擬穴青蟹MnSOD基因的克隆及表達分析

鐘錦英,傅明駿,曾憲源,王藝磊*

(1.集美大學水產學院,農業部東海海水健康養殖重點實驗室,福建 廈門 361021;2.龍巖學院生命科學學院,福建 龍巖 364012)

氧化應激是指生物體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態。線粒體電子傳遞過程中產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。吞噬細胞的激活也可以刺激ROS的產生,這被稱為呼吸爆發活動(respiratory burst)。當ROS產生的數量過多,機體抗氧化系統的平衡被打破后,會造成一系列的氧化應激損傷,如脂質過氧化、蛋白質失活和DNA的損傷等。因此,生物體建立起抗氧化系統來中和ROS的有害影響。

MnSOD可以使有氧呼吸的生物免受呼吸過程中產生的氧自由基的侵害,對于維持細胞的氧化平衡非常重要。根據定位的不同,MnSOD有兩種類型,線粒體MnSOD(mtMnSOD)和細胞質MnSOD(cytMnSOD)[2-3]。mtMnSOD在真核細胞的線粒體、細胞質及細菌中都有發現,而cytMnSOD只在甲殼動物中發現。目前已經在甲殼動物如日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)和中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)等中鑒定出許多MnSOD的同源物。已有研究表明,MnSOD在日本囊對蝦[4],中華絨螯蟹[5]和中國明對蝦[6]等甲殼動物的免疫調節中起到重要的作用。MnSOD被確定為參與超氧化物歧化酶鏈中的第一個成員[7]。已發現肽聚糖(peptidoglycan,PGN)[8]、副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)[9-11]、ROS[12]、聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid Poly I：C)[8]等可以上調MnSODs基因的表達。有研究還發現,在卵子發生和胚胎發育過程中,甲殼動物和魚類的SOD的活性都呈現增加的趨勢,這表明SOD基因在性腺的發育過程中發揮著重要的作用[13]。至今,從無脊椎動物到脊椎動物,已有許多關于MnSOD的研究報道。但是在蝦蟹等甲殼動物中,關于MnSOD的研究尚顯薄弱。

擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我國海洋養殖產量最高的海水蟹類。青蟹的養殖面臨抱卵率及成活率低、容易受環境影響而產生氧化應激等問題。本研究從擬穴青蟹性腺EST文庫中獲得SpmtMnSOD和SpcytMnSOD基因片段,運用RACE-PCR方法獲得基因全長,并利用生物信息學的方法對其進行預測分析,運用實時熒光定量PCR技術分析MnSOD基因在不同組織、性腺發育過程以及在副溶血弧菌、PGN和Poly I：C誘導后的表達譜,為深入了解擬穴青蟹MnSOD基因在性腺發育和免疫應激中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

擬穴青蟹購買自漳州市漳浦青蟹養殖場。按照性腺指數(gonado-somatic index,GSI)對其性腺發育進行分期,參照本實驗室前期的方法將雄蟹性腺發育分為3個時期,雌蟹性腺發育分為6個時期[14]。經冰水浴麻醉后,取心、肝胰腺、血淋巴、鰓、肌肉、精巢、卵巢、腦神經節和胸神經節等放入RNA later中,后轉存于-20℃冰箱中保存,用于后續基因表達實驗。

選取體重100～120 g的青蟹,在海水養殖場暫養,每天喂食新鮮花蛤。7天后,取活力強的個體進行注射,開展動物應激實驗。將青蟹分為4組：對照組(SP)注射50 μL生理鹽水;實驗組分別為注射50 μL的PGN(69554,fromBacillussubtilis1 mg/mL,Sigma)組、50 μL的Poly I：C(P9582,1 mg/mL,Sigma)組、50 μL的副溶血弧菌(1×106CFU/mL)組。均從青蟹游泳足基部進行注射,注射3、6、12、24 h后取肝胰腺、血細胞和鰓(n=5),方法如上所述。

1.2 總RNA的提取、逆轉錄及SMART-RACE擴增cDNA全長

采用Trizol 試劑(Invitrogen)提取樣品的總RNA,采用M-MLV逆轉錄酶(Promega)將總RNA逆轉錄成cDNA。以3′和5′RACE cDNA 第一條鏈為模板,利用RACE特異引物(GSP1和GSP2,表1)和試劑盒通用引物(UPM和NUP)進行兩輪PCR。PCR的擴增條件根據RACE試劑盒(Takara)的說明書來操作。將3′和5′RACE 擴增的目的產物送往上海生工生物工程有限公司測序。將已知的EST 序列、5′RACE序列和 3′RACE 序列進行拼接,得到基因的全長cDNA序列。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 生物信息學分析

基因序列特征所使用的生物信息學軟件均參照文獻[14]進行。

1.4 實時熒光定量PCR

精卵巢各發育階段的定量實驗以18S rRNA為內參基因,各組織的表達和刺激后的定量實驗以EF-1α為內參基因。反應體系：5 μL 2× Realtime PCR Master Mix(Takara),0.25 μL正向引物F(10 μmol/L),0.25 μL反向引物R(10 μmol/L),4.5 μL cDNA第一條鏈。定量反應條件為：95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個循環。每組5只青蟹。根據定量PCR儀給的CT值,計算2-ΔΔCT值,基因表達水平表示為2-ΔΔCT的平均值 ± 標準誤差的平均值,用SPSS 21.0軟件對數據進行分析,使用單因素方差分析(ANOVA)組間的差異性,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 MnSODs基因的全長克隆和序列分析

本研究克隆獲得了2個擬穴青蟹MnSOD基因(SpmtMnSOD和SpcytMnSOD)的cDNA全長序列。SpmtMnSODcDNA(GenBank登錄號：FJ605170)序列全長為1 154 bp,包括33 bp的5′ UTR、657 bp的ORF和464 bp的3′ UTR(包含polyA部分)。軟件預測顯示其編碼218個氨基酸,包含16個氨基酸的信號肽序列,蛋白分子量約為24.18 kDa,等電點約為7.09。SpcytMnSODcDNA(GenBank登錄號：GU213434)序列全長為1 184 bp,包括92 bp的5′ UTR、861 bp的ORF和231 bp的3′ UTR(包含polyA部分)。軟件預測顯示其編碼286個氨基酸,無信號肽序列,位于細胞質中,蛋白分子量約為31.33 kDa,等電點約為6.31。根據結構預測(圖1、2),SpmtMnSOD和SpcytMnSOD蛋白序列都包含有1個MnSOD 特征序列,分別為180DVWEHAYY187和243DVWEHAYY250;4個錳結合位點,分別為(H48、H96、D180、H184)和(H110、H158、D243、H247);3個絲氨酸磷酸化位點,分別為(S50、S104、S124)和(S19、S40、S190);4個酪氨酸磷酸化位點,分別為(Y31、Y56、Y190、Y197)和(Y7、Y47、Y118、Y277)。此外,SpmtMnSOD 可能存在1個蘇氨酸(T8)磷酸化位點和3個N-豆蔻?；蛄?(GGHINH、GSVENM、GSGWGW,圖1)。

圖1 擬穴青蟹SpmtMnSOD cDNA序列和推導的氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequence of SpmtMnSOD from Scylla paramamosain下劃線為信號序列(氨基酸殘基1～16),加框(180DVWEHAYY187)為MnSOD的特征序列,加粗及灰色背景(H48、H96、D180、H184)推測為Mn結合位點。

圖2 擬穴青蟹SpcytMnSOD cDNA序列和推導的氨基酸序列Fig.2 cDNA and deduced amino acid sequence of SpcytMnSOD from S. paramamosain加框(243DVWEHAYY250)為MnSOD蛋白的特征序列;加粗及灰色背景(H110、H158、D243、H247)推測為Mn結合位點。

2.2 擬穴青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD在各組織中的表達特性

以EF-1α為內參基因,實時熒光定量PCR結果顯示,SpmtMnSOD和SpcytMnSOD基因在各組織的表達存在明顯差異。SpmtMnSOD基因在心臟的表達量最高,其次是鰓、卵巢和肝胰腺,其余組織的表達量較低[圖3(a)]。SpcytMnSOD基因在肝胰腺的表達量最高,其次是卵巢、心臟和鰓,其余組織的表達量較低[圖3(b)]。

圖3 SpmtMnSOD和SpcytMnSOD在各組織中的表達情況Fig.3 Expression of SpmtMnSOD and SpcytMnSOD in different tissuesSpmtMnSOD和SpcytMnSOD都是將血中的表達水平設為1倍,柱上不同字母代表具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 擬穴青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD在性腺各發育期的表達

以18S rRNA為內參基因,在卵巢發育的各階段,SpmtMnSOD和SpcytMnSOD基因在O6期(完全成熟期)的表達量顯著高于卵巢其它發育階段(P<0.05)。在精巢發育的不同階段,SpmtMnSOD和SpcytMnSOD的表達量都低,雖然呈上升趨勢,但并無顯著性差異(P>0.05,圖4)。

圖4 SpmtMnSOD和SpcytMnSOD在性腺各發育期的表達譜Fig.4 Expression profiles of SpmtMnSOD and SpcytMnSOD during different stages of gonad developmentalO1至O6為卵巢各發育時期：O1為增殖期;O2為卵黃發生前期;O3為卵黃發生初期;O4為卵黃發生中期;O5為卵黃發生晚期;O6為完全成熟期;T1至T3為精巢各發育時期：T1為精原細胞期;T2為精母細胞期和精子細胞期;T3為成熟精子期;SpmtMnSOD和SpcytMnSOD都是將T1的表達水平設為1倍,柱上不同字母代表具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 擬穴青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD在副溶血弧菌、PGN和Poly I：C刺激下的表達

在副溶血弧菌感染后(圖5),SpmtMnSOD在12 h鰓中的表達量是對照組的2.0倍[P<0.05,圖5(c)],在肝胰腺和血中變化不明顯[圖5(a)、(e)];SpcytMnSOD的表達量在12 h肝胰腺中是對照組的1.6倍[P<0.05,圖5(b)],在3 h和12 h時的鰓中分別是對照組的1.8倍和2.4倍[P<0.05,圖5(d)],在血中變化不明顯[圖5(f)]。

圖5 肝胰腺、鰓和血中的SpmtMnSOD和SpcytMnSOD分別在副溶血弧菌(Vp)、PGN和Poly I：C刺激后的表達譜Fig.5 Expression profiles of SpmtMnSOD and SpcytMnSOD in hepatopancreas,gill and haemocytes after V. parahaemolyticus,PGN and PolyI：C challenge注射生理鹽水(SP)組為對照組,“*”表示3、6、12、24 h的實驗組與相應時間的對照組之間的顯著性差異(P<0.05)。

在PGN刺激后,SpmtMnSOD的表達量在3、6、12 h時的肝胰腺中顯著上升,分別是對照組的2.9、3.9、3.3倍[P<0.05,圖5(a)],在鰓和血中的表達量雖有所上升,但未達到顯著性差異(P>0.05);SpcytMnSOD的表達量在3、6、12 h時的肝胰腺中分別是對照組的1.8、1.6、2.7倍[P<0.05,圖5(b)],在6、24 h時的鰓中分別是對照組的1.4、1.7倍[P<0.05,圖5(d)],在6、12 h時的血中分別是對照組的4.0、2.8倍[P<0.05,圖5(f)]。

在Poly I：C刺激后,SpmtMnSOD的表達量在6 h和12 h時的肝胰腺中分別是對照組的2.2倍和1.2倍[P<0.05,圖5(a)],在3 h和6 h時的鰓中分別是對照組的5.1倍和2.4倍[P<0.05,圖5(c)],在3 h和6 h時的血中分別是對照組的2.8倍和2.2倍[P<0.05,圖5(e)];SpcytMnSOD的表達量在12 h時的肝胰腺是比對照組的2.9倍[P<0.05,圖5(b)],在6 h和12 h時的鰓中分別是對照組的1.7倍和1.9倍[P<0.05,圖5(d)],在3 h和6 h時的血中分別是對照組的2.1倍和2.0倍[P<0.05,圖5(e)]。

2.5 討論

2.5.1 擬穴青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD基因的序列特征及組織表達特性

SOD普遍存在于需氧生物體內,是機體抗氧化系統的第一道防線,能有效清除機體產生的過量超氧陰離子,保持機體內自由基代謝平衡,防御機體受到氧化損傷[1,15]。本實驗從擬穴青蟹克隆獲得2種MnSOD的cDNA全長,分別為SpmtMnSOD和SpcytMnSOD。MnSOD特征序列在擬穴青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD蛋白序列中均有發現,分別為180DVWEHAYY187和243DVWEHAYY250,保守的Mn離子結合位點在這2個蛋白序列中都存在,通過同源比對發現MnSOD在脊椎動物和無脊椎動物中的保守性都很高。熒光定量PCR的結果顯示青蟹中SpmtMnSOD和SpcytMnSODmRNA普遍表達于各組織中,表明它們可能參與清除各種正常生理過程所產生的ROS和活性氧中間體(ROI)。青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD的mRNA在心臟的表達水平高于其他組織。在小鼠中活性氧ROS的產生增加和抗氧化物的儲備量的下降等會引起心肌的梗死[16],推測SOD基因在保護心臟免受氧化應激起到重要的作用。

SpmtMnSOD和SpcytMnSOD的mRNA表達水平在卵巢、肝胰腺和鰓中的表達水平較高,這一結果與克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)和中華絨螯蟹鰓和肝胰腺中的表達相似[5,17-18]。在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中,cytMnSOD在鰓和附肢的表達量相對較高[19],然而在日本囊對蝦中,mtMnSOD和cytMnSOD在各組織的表達相對一致[4]。表達量的不同可能與物種差異以及各組織所執行的功能有關。卵巢在發育過程中需要積累大量的營養物質,這期間會產生大量的ROS,為了氧化還原系統的穩定性,需要大量的SODs來清除超氧自由基。有研究發現人體中抗氧化酶在卵母細胞成熟階段高表達,這種儲備可能是用于胚胎的發育[20]。這可能也是SpmtMnSOD和SpcytMnSOD在青蟹成熟的卵巢中表達量較高的主要原因。肝胰腺不僅是營養物質和脂類儲存的主要場所,還是蝦蟹生理活動的中心,因此需要一個較為完善的抗氧化系統來保證肝胰腺中物質和能量代謝的正常進行[21]。鰓的主要功能是呼吸作用,其呼吸上皮細胞內富含線粒體,呼吸過程會產生大量ROS;另一方面,鰓容易暴露于外界環境中,在外界環境各種因子的作用下也容易產生自由基以損害機體,因此,需要SODs清除過多的自由基以維持其體內自由基的動態平衡[21]。

2.5.2 擬穴青蟹SpmtMnSOD和SpcytMnSOD基因在應對副溶血弧菌、PGN和Poly I：C刺激下的免疫應激

無脊椎動物防御病原體主要依賴于先天免疫。先天免疫系統是由病原體觸發的,并且是由模式識別蛋白(PRPs)介導。PRPs 可以識別入侵微生物表面的保守分子,如被確定為病原體相關分子模式(PAMPs)的副溶血弧菌、PGN和Poly I：C。PRPs與PAMPs的結合會觸發一系列免疫反應,從而激活宿主免疫防御系統[22]。

先天性免疫防御系統的激活,會產生吞噬作用,這個過程會產生ROS,盡管適量的ROS會對宿主防御和信號傳導有利,但是過量會產生氧化應激。對甲殼類動物的研究表明,MnSOD 對細菌或病毒的入侵表現出顯著的反應[5,18]。鰓、肝胰腺和血細胞是甲殼類動物重要的免疫防御器官。在本研究中,青蟹在注射副溶血弧菌后,SpmtMnSOD和SpcytMnSOD的mRNA表達在鰓中都明顯增加,這與副溶血弧菌侵入羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)體內時,MnSOD的活性顯著上升相一致[11]。副溶血弧菌感染后,SpcytMnSOD在肝胰腺中的表達上升,而SpmtMnSOD在肝胰腺的表達無明顯變化,推測MnSOD在應對PAMPs 刺激的免疫防御中發揮了重要作用,二者不同可能是由于SpmtMnSOD本身在肝胰腺中就具有較高的活性,和/或較長的半衰期,足以應對副溶血弧菌的應激,所以其基因的表達沒有明顯的上升趨勢。本研究中發現PGN刺激后,SpmtMnSOD的表達量在肝胰腺中顯著上升,而SpcytMnSOD的表達量在肝胰腺、鰓和血中均有所增加,與孟凡倫等發現注射PGN可以提高中國對蝦(Penaeuschinensis)的溶菌、抗菌、SOD活力的結果[23]相似,MnSOD表達量升高,推測其在青蟹的抗細菌感染中起到一定作用。

在Poly I：C刺激后,SpmtMnSOD和SpcytMnSOD的表達在肝胰腺、鰓和血中均有所增加,推測Poly I：C通過提高MnSOD活力,從而起到抗病毒感染的作用。血細胞中的呼吸爆發與SOD的表達已被廣泛用于評估蝦對病原體的防御能力[24]。血細胞對于無脊椎動物的先天性免疫反應極為重要,參與甲殼動物的細胞免疫和體液免疫,過量產生ROS可誘導溶酶體膜穩定性的退化,進而導致中華絨螯蟹血細胞數量減少[25];在凡納濱對蝦中,注射Poly I：C時,血細胞中的ROS表達增加,MnSOD基因的表達也上升[22],這與本研究中,血細胞中MnSOD基因的表達也是一致的。說明MnSOD基因在抗氧化應激和抗細菌、病毒感染中起到重要的作用。

3 結論

本研究發現擬穴青蟹SpMnSOD在性腺成熟期高表達,為卵子成熟和胚胎發育提供抗氧化防御作用。同時SpMnSOD的表達在應對外來病原菌入侵的不同時段表現為不同程度的升高,說明其參與了機體氧化還原系統的平衡,同時也參與了機體的先天免疫反應,在清除機體由免疫應激產生的過量的自由基中起到重要的作用。