基于線粒體內穩態探討針刺調控AMPK表達治療肥胖的機制

董海城 許榕榕 王雯菲 張瑤 朱世峰

肥胖病是全球最常見的流行病之一,是心腦血管疾病、2型糖尿病等的危險因素[1,2]。針刺治療肥胖療效肯定,其確切機制目前尚不明確。近年來較多研究表明肥胖與線粒體功能受損關系密切[3,4],線粒體作為能量代謝的重要場所,其數量和功能的“質量控制”能維持健康的線粒體內穩態,線粒體內穩態的失衡在肥胖發生發展的過程中起重要作用。而腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為能量感受器,對線粒體內穩態的各個方面具有特定的調節作用,已成為防治肥胖、糖尿病等代謝性疾病的重要靶點[5,6]。本文擬從AMPK、線粒體內穩態的角度闡釋兩者之間的相關性,并初步探討針刺干預肥胖的潛在機制,為后續的相關研究提供理論指導。見圖1。

圖1 AMPK調節線粒體內穩態示意圖

1 線粒體與肥胖

肥胖發生的根本原因是能量攝入大于消耗,線粒體有“能量工廠”之稱,是細胞能量產生的關鍵。肥胖及相關疾病發生的早期事件是各組織中線粒體密度減少和氧化代謝減少。研究表明,高脂喂養大鼠脂肪滴堆積,線粒體受損、腫脹或融合,纖維排序紊亂或纖維結構異常[7]。

線粒體是細胞進行三羧酸循環和氧化磷酸化(OXPHOS)的場所,能氧化三大營養物質生成為細胞生命活動提供能量的三磷酸腺苷(ATP),是細胞進行有氧呼吸的主要場所,也是細胞內活性氧簇(ROS)的最主要來源。大多數線粒體蛋白質由核基因(nDNA)編碼,而極小部分由線粒體基因(mtDNA)編碼,mtDNA缺乏nDNA中核小體的保護,也沒有一個DNA修復機制,容易導致mtDNA的損傷和消耗[8,9]。肥胖的動物模型和人類脂肪組織中mtDNA拷貝數及蛋白表達均減少。mtDNA損傷的量化以及mtDNA拷貝數的分析和量化可能是肥胖及相關疾病進展和預后的生物標志物[10]。

線粒體主要分布在能量需求大的組織,如骨骼肌、心臟、肝臟等,人體骨骼肌中線粒體的含量隨著運動而增加并在停止訓練期間減少,骨骼肌缺失引起少肌型肥胖[11]。棕色脂肪組織(BAT)也含有大量線粒體,其特異性解偶聯作用,使脂肪酸分解產生的能量的轉化為熱能,起到減肥的作用?？傊?骨骼肌與BAT中線粒體的數量與超重、肥胖呈負相關[12]。

線粒體是高度動態運行的細胞器,經歷不斷的線粒體融合和裂變、線粒體生物合成和線粒體自噬,協調控制線粒體的形態、數量、質量、周轉和遺傳,能維持健康的線粒體內穩態,維持穩定的ATP產出。肥胖是一種慢性營養障礙性疾病,而營養狀態的改變可以雙向調節線粒體的形態和功能[13],肥胖狀態下線粒體內穩態失衡。

2 AMPK與肥胖

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,結構上由α、β和γ這3個亞基組成,用作細胞能量感受器,可以促進骨骼肌葡萄糖攝取和脂肪酸氧化,減少肝糖原合成,抑制脂肪酸和蛋白合成。ATP作為能量來源,相繼被分解為二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)。當體內能量缺乏時,如低氧、缺血及OXPHOS受抑制時,伴隨著AMP/ATP、ADP/ATP比值的升高,AMPK被磷酸化和激活,從而激活ATP再生途徑,同時抑制ATP消耗途徑。

肥胖是慢性能量失衡引起的,肥胖與AMPK之間呈負相關,AMPK活性降低與重度肥胖個體的內臟脂肪組織炎癥和全身胰島素抵抗增加有關[14]。多項研究表明,肥胖大鼠肝臟、腎臟、骨骼肌和脂肪等外周組織中AMPK磷酸化水平下降[15-18],而AMPK激動劑AICAR處理肥胖大鼠可以促進脂肪酸氧化,增加能量的消耗,降低大鼠體質量[19]。

藥物二甲雙胍除了降糖還能減輕體重,主要通過激活AMPK[20]發揮作用。許多AMPK活化療法,在肥胖及糖尿病等代謝疾病中具有巨大的治療潛力。研究表明,電針高脂喂養大鼠后骨骼肌AMPK蛋白表達水平升高[7]。糖尿病心肌病小鼠經電針干預后AMPK磷酸化水平顯著升高,并降低血糖[21]。電針還能通過增強AMPK表達,改善大鼠缺血性腦中風、失眠及慢性疲勞綜合征等[22-24]。針刺通過激活AMPK,如何調節線粒體內穩態,達到減肥目的是本文探討的方向。

3 基于線粒體內穩態探討針刺調控AMPK表達治療肥胖的機制

3.1 線粒體生物合成 線粒體生物合成能產生更多新的線粒體,提高ATP水平,增加能量消耗,改善肥胖。有研究表明,肥胖機體的線粒體生物合成處于降低的狀態[25,26]。運動和肌肉活動會誘導線粒體生物合成,運動也是AMPK的有效激活劑,提示AMPK可能參與了線粒體生物合成。研究證明,慢性AMPK激活導致線粒體生物合成增加[27]。此外,在小鼠中過度表達的構成型活性AMPKγ3亞基突變會誘導線粒體生物合成[28];而AMPKα亞基敲除和AMPK顯性失活的小鼠均呈現線粒體生物合成和功能的缺陷[29,30]?？傊?AMPK為線粒體生物合成的主要調節因子之一。

AMPK可直接調節過氧化物酶體增值物激活受體γ輔助活化因子-1α(PGC-1α)的功能促進線粒體生物合成:AMPK可直接磷酸化PGC-1α蛋白的Thr177和Ser538殘基[31],能激活不同的轉錄因子如核呼吸因子(NRFS)1和2,及雌激素相關受體-α(ERR-α),促進線粒體轉錄因子A(TFAM)的表達,驅動mtDNA的轉錄和復制[32-34];同時,NRFS誘導參與OXPHOS的基因轉錄,并將細胞核編碼的蛋白質轉移到線粒體[35,36],從而促進線粒體生物合成[27,37,38]。

有研究表明,在癌細胞中,PGC-1α、NRF1和TFAM表達增加的同時線粒體數量卻在減少[39,40],TFAM水平的提高和mtDNA拷貝數、mtDNA編碼多肽的表達不一定呈正相關[41]。故線粒體生物合成發生的標志是mtDNA拷貝數、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表達水平升高[41]。

湯倩倩[42]通過電針提高肥胖大鼠腹股溝白色脂肪組織(WAT)中AMPK磷酸化的蛋白水平,上調PGC-1α-TFAM-UCP1通路的表達,降低大鼠體質量可能與促進WAT線粒體生物合成有關,但該實驗未進行mtDNA拷貝數、nDNA拷貝數的測量。筆者認為,在線粒體生物合成方面,今后研究探討方向為:針刺提高肥胖大鼠AMPK表達水平,激活下游因子PGC-1α及相關通路,能否促進mtDNA拷貝數、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表達水平升高,而AMPK基因敲除后,針刺是否還能激活下游因子促進線粒體合成。

3.2 線粒體自噬 線粒體自噬是一種選擇性清除線粒體的模式[43],主要負責消除受損的線粒體,受損線粒體被隔離在雙膜囊泡中,形成稱為自噬體的雙膜結構,自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體,其中自噬體的內容物將發生水解降解[44]。在低氧條件下,線粒體的OXPHOS功能受到抑制,導致線粒體產生更多的ROS,對mtDNA、線粒體脂質和蛋白造成氧化損傷,而線粒體自噬能通過特異性降解受損的線粒體來防止進一步的損傷,保護細胞存活。

AMPK對線粒體自噬的調節主要通過絲氨酸/蘇氨酸激酶Atg1和Unc-51樣激酶1(ULK1)發揮作用,ULK1是酵母Atg1的同源物。其中,AMPK-ULK1軸對線粒體自噬很重要[45],AMPK通過ULK1在幾個主要位點(包括Ser555[46]、Ser317和Ser777)的磷酸化直接激活自噬和線粒體自噬,AMPK或ULK1的缺乏會導致自噬接頭p62的異常積累和線粒體自噬缺陷[46],而ULK1的突變體不能被AMPK磷酸化,則細胞表達出更多的受損線粒體。

有研究表明,經針刺干預腦出血大鼠后腦內結構損傷較少,自噬泡多于模型組,而針刺干預前經自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理后,線粒體自噬蛋白水平降低,并逆轉針刺療法對神經功能缺損改善的情況,提示針刺可通過增強線粒體自噬來減輕腦出血后的神經損傷[47-49],Zhou等[50]可視化和定量測量自噬活性結果表明大鼠衰老模型自噬能力下降,經穴位埋線和自噬促進劑干預后自噬能力下降趨勢緩和,但這種影響被3-MA處理消除,提示穴位埋線有介導線粒體自噬作用。董佳梓[51]發現針刺足三里可能是通過AMPK/ULK1信號通路,有效地提高大鼠骨骼肌線粒體自噬水平,維持大鼠骨骼肌細胞內環境的穩態。

線粒體自噬與針刺治療腦病是目前主流的研究熱點,現國內外鮮見針刺調節線粒體自噬與肥胖關系的研究,且針刺能增強線粒體自噬是否與AMPK/ULK1信號通路有關,有待進一步證明。

3.3 線粒體融合、裂變 線粒體是不斷融合和裂變的動態細胞器[52],共同平衡控制著線粒體的形狀、數量和大小,對于線粒體功能和遺傳很重要[53]。2個受損線粒體相遇后經歷融合、分裂產生電位不均勻的子線粒體,具有更健康膜電位的子線粒體將繼續參與線粒體網的融合和裂變循環,但去極化的子線粒體不再執行功能,常通過線粒體自噬降解。

在分子水平上,線粒體融合和裂變由關鍵的線粒體膜蛋白調節。線粒體外膜融合由MFN1/2介導[54],線粒體內膜融合由視神經萎縮1(Opa1)介導[55]。介導線粒體分裂的是一種大型GTP酶(Drp1),通過一組受體蛋白(MFF、Fis1、MiD49和MiD50)被募集到線粒體外膜參與線粒體裂變。

研究表明,在沒有線粒體損傷的情況下,通過直接小分子激活劑激活AMPK足以誘導線粒體裂變[56]。Toyama等[56]發現MFF上兩個磷酸化位點Ser155和Ser173是AMPK的新底物,活化的AMPK可以誘導MFF以促進Drp1從胞質溶膠募集到線粒體表面并參與線粒體裂變過程。而分子水平上關于AMPK與線粒體融合的研究較少,有研究表明蟲草素能激活AMPK同時也能上調糖尿病小鼠Mfn2相對mRNA及蛋白表達[57],AMPK可能是Mfn2的上游調節劑[58]。

肥胖人群組織以線粒體裂變為主,線粒體融合受到抑制。肥胖人群或小鼠2型糖尿病模型的肌肉中線粒體尺寸減小,并伴有Mfn2的表達減少[59],同樣,營養過剩會誘導胰腺β細胞中的線粒體斷裂,是由線粒體融合的抑制介導的[60]。研究發現Mfn1可以在高脂飲食刺激下保護線粒體呼吸功能[61],Mfn2也會通過AMPK途徑上調葡萄糖轉運蛋白表達[62],Mfn1和Mfn2均能改善胰島素抵抗,且骨骼肌中Mfn2的缺失會導致促糖尿病作用[63],提示促進線粒體融合療法可能降低體質量,改善胰島素抵抗。張婧怡[64]通過電針胰島素抵抗大鼠穴位改善了大鼠線粒體結構,骨骼肌Drp1、Fis1蛋白表達得到抑制,Mfn1、Mfn2表達等得到保護性維持,證明電針對胰島素抵抗大鼠具有抑制線粒體分裂、促進線粒體融合的作用。

根據目前的研究,AMPK激活能誘導線粒體裂變,對于改善肥胖似無益處。是否能在MFN1/2、Opa1上發現AMPK新底物,針刺激活AMPK后最終達到促進線粒體融合、抑制線粒體裂變的作用而緩解肥胖及相關并發癥是一個新的研究方向。

4 討論

中醫學對肥胖的認識始于《黃帝內經·靈樞·衛氣失?！?“人有肥、有膏、有肉…腘肉堅,皮滿者,肥。腘肉不堅,皮緩者,膏。皮肉不相離者,肉?！嗾?多氣而皮縱緩,故能縱腹垂腴。肉者,身體容大。脂者,其身收小……”將肥胖分為“脂人、膏人、肉人”,脂人肥大卻身形較小,似“均一性肥胖”;膏人肥肉多而松軟下垂,似“中心性肥胖”,肉人身體寬大,骨骼肌肉壯實,似“壯實之人”。

朱丹溪《丹溪治法心要》提出“肥白人多痰濕”、“肥白之人,沉困怠惰是氣虛”,劉河間云:“肥人腠理致密,而多郁滯,氣血難以通利”,提示肥人多痰濕和少氣,病程日久,氣虛血瘀或痰濕瘀互結是病理發展的必然結果。針刺減肥有辨證取穴,達到平衡陰陽、調理臟腑、運行氣血及疏通經絡的作用,相對于藥物和手術療法,安全有效、不易反彈[65],在臨床上已被廣泛應用。針刺減肥的主流方式主要有普通毫針針刺、電針和穴位埋線。穴位埋線是根據針灸學理論,通過針具將外科可吸收縫線埋在穴位內產生針刺效應來發揮作用,相對于普通針刺有作用持久、患者依從性好的優點。

在肥胖條件下線粒體內穩態平衡被打破,線粒體不僅形態變小,而且線粒體的合成、自噬及融合能力均受到抑制[66],ROS產生增加,導致新線粒體合成減少,衰老、損傷線粒體增加。目前研究表明,針刺能有效激活AMPK,并間接通過PGC-1α依賴性轉錄刺激線粒體生物合成―增加線粒體數量,促進ATP合成,增加能量消耗;又通過ULK1依賴性刺激線粒體自噬觸發受損線粒體的急性破壞―控制線粒體質量,維持健康線粒體數量,穩定ATP產能,防止肥胖進展;還可能提高Mfn1/2蛋白表達水平促進線粒體融合―調節線粒體網絡形狀,保護線粒體呼吸功能,這些都說明針刺干預AMPK調節線粒體內穩態發揮減肥作用。

筆者認為,針刺能提高肥胖大鼠AMPK表達水平,潛在減肥機制研究方向建議如下:(1)激活下游因子PGC-1α及相關通路,促進mtDNA拷貝數、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表達水平升高,以促進線粒體生物合成;(2)是否通過AMPK/ULK1信號通路提高線粒體自噬水平;(3)磷酸化MFN1/2或Opa1上的AMPK新底物,促進線粒體融合。因此,深入探究AMPK和線粒體內穩態的相互作用將有利于進一步闡釋針刺減肥的作用機制,豐富中醫藥理論。