德昂族酸茶中的化學成分研究

梁名志，呂海鵬，楊天銘

（1. 云南省農業科學院茶葉研究所，云南 昆明 650205；2. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 云南大學，云南 昆明 650091）

德昂族酸茶是德昂族長期飲用和食用的一種極具特色的傳統微生物發酵茶產品，制作工藝及品質風味獨特，被列為第4 批云南省省級非物質文化遺產代表性項目名錄，“德昂族酸茶制作技藝”也入選了第五批國家級非物質文化遺產代表性項目名錄。有研究發現，德昂族酸茶水提物可改善高脂飲食小鼠血脂水平，減少肝組織的脂肪變性，具有一定的保肝作用[1]；還具有預防大鼠非酒精性脂肪肝的作用[2]；此外，德昂族酸茶可維持高脂飲食小鼠腸道微生態的平衡，降低厚壁菌門與擬桿菌門的比值，對減肥具有積極的意義[3]。另有一些相關研究指出，酸茶還具有多種保健功效，如降壓安神、改善睡眠、抗氧化、抗焦慮、抗腫瘤、延緩衰老及調節免疫等[4]；酸茶富含益生菌，具有一定的開發價值[5]；應該加大對德昂族酸茶功效的研究力度[6]。因此，目前開展德昂族酸茶中的化學成分的研究工作具有重要的意義，有助于揭示德昂族酸茶風味品質和保健功效的重要化學物質基礎，為德昂族酸茶的品質評價、新產品開發及加工工藝提升等提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

酸茶樣品，來自于云南德鳳茶業有限公司2018年生產的產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 德昂族酸茶中主要化學成分測定

水分含量測定參照國標GB 5009.3—2016 操作方法；水浸出物含量測定參照國標GB/T 8305—2013操作方法；茶多酚、兒茶素類物質含量測定參照國標GB/T 8305—2018 操作方法；咖啡堿含量測定參照國標GB/T 8312—2013 測定方法；氨基酸組成測定采用氨基酸自動分析儀；有機酸和維生素成分測定采用基質輔助激光解析-飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS） 方法。

1.2.2 德昂族酸茶中非揮發性成分分析

酸茶樣品代謝物鑒定采用超高效液相色譜（SHIMADZU Nexera X2） 和串聯質譜（Applied Biosystems 4500 QTRAP） （UPLC-MS/MS） 法，委托邁維（武漢） 生物技術有限公司開展分析。

樣品制備：利用研磨儀（MM 400，Retsch） 研磨（30 Hz，1.5 min） 至粉末狀；稱取100 mg 的粉末，溶解于70%甲醇提取液1.2 mL 中；每30 min 渦旋1 次，每次持續30 s，共渦旋6 次，樣本置于4 ℃冰箱中過夜；以轉速12 000 r/min 離心10 min 后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm pore size） 過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

液相條件：①色譜柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；②流動相：A 相為超純水（加入0.1%的甲酸），B 相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；③洗脫梯度：0 min B 相比例為5%，0 min 內B 相比例線性增加到95%，并維持在1 min，10.00～11.00 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14 min，流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量4 uL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS） 5 500 V（正離子模式） /-4 500 V（負離子模式）；離子源氣體Ⅰ（GSⅠ），氣體Ⅱ（GSⅡ） 和簾氣（CUR） 分別設置為50，60，25 psi，碰撞誘導電離（CAD） 參數設置為高。在三重四極桿（QQQ） 掃描和線性離子阱（LIT）模式下分別用10 和100 μmol/L 聚丙二醇溶液進行儀器調諧和質量校準。QQQ 掃描使用多反應檢測（MRM） 模式，并將碰撞氣體（氮氣） 設置為中等。

1.2.3 德昂族酸茶中揮發性成分分析

香氣成分分析采用SBSE-GC-MS 方法[7]。

SBSE 香氣富集：準確稱取600 mg 茶粉與500 mg氯化鈉加入20 mL 頂空瓶中，加入10 mL 沸水平衡1 min 后，加入PDMS 攪拌子，在磁力攪拌器上以轉速1 200 r/min 攪拌萃取30 min 后取出攪拌子，并用純凈水洗凈攪拌子表面殘留茶粉，無紡布擦干后暫存放于1.5 mL 小瓶中待測。

GC-MS 分析：色譜參數為初始溫度50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min 的速度升溫至170 ℃，保持5 min 后，以10 ℃/min 升溫至265 ℃，保持5 min。溶劑排空模式，以高純度氦（＞99.9%） 為載體，流速1.6 mL/min。質譜參數如下：離子源為EI，溫度220 ℃，電子能量70 eV。質量掃描范圍30～600 amu。定性分析：通過NIST 2014 數據庫對GC-MS 檢測的化合物定性，依據正構烷烴測得各化合物的保留指數試驗值，與數據庫中理論值對比，要求兩者差值在20 以內。定量分析以相對含量表示。

2 結果與分析

2.1 德昂族酸茶樣品中主要化學成分分析

茶葉中水浸出物是指在規定條件下，用沸水浸出茶葉中的水可溶性物質的統稱，是茶湯的主要呈味物質，包括可溶性糖、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿等物質，其含量水平對茶葉品質有重要影響。

酸茶中主要化學成分的含量見表1。

表1 酸茶中主要化學成分的含量

由表1 可知，酸茶樣品中水浸出物含量占干質量的49.60%，表明德昂族酸茶中內含物質比較豐富。此外，另有研究曾報道德昂酸茶中水浸出物含量高達52.70%[8]。

茶多酚是茶葉中的重要品質成分和活性物質，在茶湯中一般呈現苦澀味，其中兒茶素類是茶多酚的主體物質[9]。研究發現，酸茶中茶多酚的含量占干質量的27%，而兒茶素總量（5.87%） 僅占茶多酚總量的21.74%，占比比較低。這主要與酸茶的微生物發酵過程中多酚類成分的氧化聚合和生物降解有關[10]。德昂族酸茶中表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（D、L-C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG） 含量分別為2.25%，0.86%，0.18%，2.33%，0.25%，其中非酯型兒茶素含量較高，而酯型兒茶素含量較低，含量規律與以往文獻[8]報道的研究結果接近。

咖啡堿是茶葉中的主要嘌呤堿，是構成茶湯滋味的重要物質，也是茶葉理化審評的評價標準之一。德昂族酸茶樣品中咖啡堿含量為3.6%，與常規茶產品差異不大?？扇苄蕴鞘遣铚兄匾奶鹞冻煞?，對茶湯滋味品質有重要影響。德昂族酸茶樣品中可溶性糖含量為3.70%，與常規茶產品的4%的含量水平比較接近[11]。有研究表明，酸茶發酵過程中，濕熱作用和微生物作用會導致茶葉理化成分發生較大變化。隨著酸茶發酵過程的進行，水溶性總糖的含量呈現先顯著降低后顯著上升的趨勢，發酵末期含量達到2.97%[12]。

酸茶中氨基酸成分的含量見表2。

表2 酸茶中氨基酸成分的含量/%

氨基酸是茶葉中重要的品質成分，是構成茶湯鮮爽味的重要物質基礎。由表2 可知，酸茶樣品中的氨基酸總量為1.344%，其組分上以茶氨酸（1.022%）和谷氨酸（0.097%） 為主。有研究表明，酸茶發酵過程中游離氨基酸的含量顯著升高[12]。

酸茶有機酸和維生素等成分含量見表3。

表3 酸茶有機酸和維生素等成分含量/%

由表3 可知，德昂族酸茶中乳酸和酚酸的含量較高，分別為0.85%和0.41%；維生素成分中以維B6和維B2的含量較高，分別為0.065 0%和0.011 2%。

以往有研究表明，不同級別德昂族酸茶中理化成分差異明顯[13]。有研究表明，酸茶發酵屬于厭氧發酵；由于微生物和茶葉水分的濕熱協同作用，發生了茶多酚的氧化、縮合，蛋白質和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的轉化積累，以及各產物之間的聚合、縮合等一系列反應，使其茶湯酸澀，具有“酸”而略帶清涼的香氣特征。鑒于德昂族酸茶中化學成分的含量水平及其微生物發酵過程中的變化規律情況尚未系統揭示，未來仍需要擴大樣本量進行系統分析。

2.2 德昂族酸茶中的非揮發性成分分析

采用基于UPLC-MS/MS 的代謝組學方法，從德昂族酸茶樣品中共檢測到1 130 個代謝物。

酸茶中代謝物數量統計見表4。

表4 酸茶中代謝物數量統計

由表4 可知，包括252 種黃酮類物質、203 種酚酸類、158 種脂質、106 種其他類物質、94 種氨基酸及其衍生物、94 種有機酸、71 種核苷酸及其衍生物、70 種生物堿、33 種木脂素和香豆素類、26 種鞣質、24 種萜類及8 種醌類。黃酮類、酚酸類、脂質以及氨基酸及其衍生物的代謝物數量和相對含量較高，相對含量分別占代謝物總量的14.39%，15.70%，25.50%，14.02%。

黃酮類化合物在茶葉中多以黃酮醇及其糖苷類的形式存在，是茶葉中重要的品質化學成分，也是重要的生物活性成分[14]。酚酸類成分也被證實具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗皺等多種功效，在治療糖尿病、傷口愈合中發揮重要作用[15]。該研究發現，酸茶中存在高含量的黃酮類和酚酸類物質，可能是其保健功效的重要化學物質基礎之一。酸茶樣品中檢測到的脂質成分以α -亞麻酸、γ -亞麻酸、11 -十八碳烯酸為主，都屬于不飽和脂肪酸。研究表明，α-亞麻酸具有抗動脈粥樣硬化、降血脂、保護心血管等功能[16]。 此外，檢測到的代謝物中相對含量較高的還有6 -甲基巰嘌呤、3 -甲基黃嘌呤等成分。

2.3 德昂族酸茶揮發性成分分析

采用SBSE-GC-MS 方法，從德昂族酸茶樣品中共鑒定出119 種揮發性成分。

酸茶中的揮發性成分見表5。

表5 酸茶中的揮發性成分

揮發性成分中，相對含量較高的化合物有植醇、對乙烯基苯酚、反式芳樟醇氧化物、棕櫚酸異丙酯、反式- β -紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、水楊酸甲酯、芳樟醇、香葉醇，等等，這些成分構成了德昂族酸茶揮發性成分的主體。

根據化合物的化學結構特點對上述119 種揮發

性成分進行分類，發現酸茶樣品的香氣成分中，有醛類物質9 種（總計1.76%）、醇類物質17 種（總計28.59%）、酯類物質17 種（總計21.31%）、酚類物質6 種（總計16.73%）、雜環類物質10 種（總計11.69%）、內酯類物質5 種（總計7.40%）、酮類物質16 種（總計6.65%）、碳氫化合物29 種（總計4.68%）、酸類物質7 種（總計1.36%）、醚類物質3 種（總計0.46%）?？梢?，德昂族酸茶揮發性成分中含有豐富的醇類物質、酯類物質和酚類物質等。酸茶中的關鍵致香成分后續尚需要通過GC-O 嗅聞試驗和OAV 計算等進行分析。

德昂族酸茶中檢測出的一些化合物，如4,6 -二（1,1 -二甲基乙基） - 2 -甲基苯酚和1,7,7 -三甲基雙環[2.2.1]庚- 2 -烯等，可能是酸茶中能區別于綠茶、紅茶等其他茶類的特殊物質[17]。后發酵中生成的甲氧基苯類化合物是發酵茶中重要的“陳香”成分，酸茶也存在多種甲氧基苯類化合物，如1,2,3 -三甲氧基苯和4 -乙基- 1,2 -二甲氧基苯等，可能對其香氣品質有重要影響。

3 結論

研究初步查明了德昂族酸茶的水浸出物、茶多酚、兒茶素、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖等主要成分的含量水平，并從德昂族酸茶中初步鑒定出了119 種揮發性成分和1 130 種非揮發性物質。研究結果表明，德昂族酸茶的內含物質豐富，展現出重要的開發價值。后續應加強德昂族酸茶風味品質、化學成分和保健功效的評價工作，以期為德昂族酸茶的加工工藝的提升及新產品開發利用等提供依據。