嵌合抗原受體T 細胞治療惡性腫瘤的研究進展

楊 翀，張 毅

（天津市環湖醫院，天津 300350）

嵌合抗原受體（CAR）是源自編碼單鏈可變片段（scFv）轉基因的嵌合免疫球蛋白T 細胞受體（TCR）分子，能夠識別并結合腫瘤相關抗原（TAA），通過結構域和共刺激域的激活信號激活嵌合抗原受體T 細胞（CAR T），誘導細胞因子釋放和轉錄因子表達，促進T細胞的活化和功能，最終產生針對腫瘤細胞的細胞毒活性［1］。臨床上，CAR T 治療首先需要收集患者的外周血和T 細胞，T 細胞在體外進行刺激擴增并通過病毒載體轉入特定的CAR 基因，稱為CAR T，隨后將CAR T 回輸給患者，在患者體內行使設定的腫瘤殺傷作用［2］。相較于化療，放療及手術治療，這種治療方式緩解率更高，副作用更少，患者預后生活質量更高。

目前，CAR T 過繼轉移在治療白血病和淋巴瘤等多項臨床試驗研究中取得了驚人的結果，但對實體瘤的作用有限，其原因包括免疫逃逸、CAR T 細胞遷移、免疫抑制性腫瘤微環境和抗原表達異質性等。此外，CAR T 是活性藥物，雖具有顯著的抗腫瘤活性，但也可誘發嚴重的毒性反應。因此，CAR T 對實體瘤方面研究的新方法應專注于增強效力而非增加毒性。本綜述概述了CAR T 的發展現狀，并對其在血液系統惡性腫瘤和實體瘤研究應用中遇到的諸多挑戰及應對方法進行總結。

1 CAR 的結構與演變

CAR 的結構主要由細胞外域和細胞內域組成。細胞外域包括靶向域和鉸鏈區；細胞內域包括跨膜域（TM）、共刺激域（通常為CD3ζ）和激活域［3］。CAR 的靶向域通常來源于單克隆抗體（mAb）的單鏈可變片段（scFv），負責識別并結合在腫瘤細胞表面表達的TAA［4］。鉸鏈區主要用于連接靶向域和TM 域，主要來源于CD8、CD28、IgG1 和IgG4。細胞內域在T 細胞活化、增殖、持久性和細胞毒性中起關鍵作用［5］。CAR 的TM 結構域源自CD3ζ、CD8α、CD4、CD28 和誘導型T細胞共刺激物（ICOS）等分子。此外，共刺激域是CAR的重要組成部分，因其可以促進CAR T 細胞的不同特性。迄今為止，CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、ICOS、CD27、MYD88-CD40 和KIR2DS2 已被用作各種試驗研究中的共刺激域［6］。CAR 結構中使用的激活域在遇到靶抗原時對T 細胞激活具有關鍵作用，其主要來源于TCR-CD3 復合物的CD3ζ 部分。目前，已使用的其他激活域包括FcεRIγ、TCR 相關蛋白激酶70 kDa（ZAP70）的ζ 鏈和DAP12［6］。

第一代CAR 發現于20 世紀80 年代后期，僅包括scFv 和CD3ζ，在響應抗原時表現出有限的擴增和相對較短的持久性，并在臨床研究中尚未顯示出抗腫瘤功效［7］。第二代CAR 的臨床活性可通過CD3ζ 結構域插入誘導，即共刺激域CD28 或CD137/4-1BB 被添加到CAR T 細胞的CD3ζ 內域，促進更強大和持久的T 細胞反應［8］。此外，靶向CD19 抗原（CD19 特異性scFv）的第二代CAR 對B 細胞惡性腫瘤具有高度活性，并具有良好的臨床益處［8］。為了克服每個單獨共刺激域的局限性，第三代CARs 同時結合兩種共刺激信號（CD28 和4-1BB），與第二代相比，其具有更好的擴展性和更長的持久性［6］。近年來，由于在實體瘤患者中缺乏臨床上成功的CAR T 療法，CAR 結構的進一步改進已被用于提高CAR T 的功效。第四代CAR 構建體通過誘導促炎細胞因子的分泌，增強工程細胞的遷移和功效，提高抗腫瘤活性［9］。相比之下，第五代CAR 采用了完全不同的方法，旨在激活Janus激酶信號轉導和轉錄激活因子（JAK-STAT）信號通路以促進T 細胞增殖。與第二代和第三代相比，第五代CAR T 細胞被證明具有更好的抗腫瘤作用和持久性。

2 血液系統惡性腫瘤中的CAR T

自2010 年以來，大量臨床試驗證明了針對CD19的CAR T 能夠有效緩解急性淋巴細胞白血?。ˋLL）、彌漫性大B 細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴細胞白血病的臨床反應［10］。具有4-1BB/CD3ζ 共刺激結構域的Tisagenlecleucel（KYMRIAH，Novartis）于2018 年被歐洲藥品管理局（EMA）批準用于B 細胞ALL（B-ALL），具有CD28/CD3ζ 共刺激域的Axicabtagene ciloleucel（YESCARTA，Kite Pharmaceuticals）于2017 年被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于大B 細胞淋巴瘤（BCL）［11-12］。Tisagenlecleucel 是一種自體T 細胞，帶有編碼CD19 特異性CAR 的慢病毒載體，在日本復發/難治性（r/r）B-ALL 患者亞組中表現出顯著的療效和可控的安全性，使其成為B-ALL 患者的有效治療方法［12］。Axicabtagene ciloleucel 是一種CD19 特異性CAR T，主要用于治療接受兩種或多種全身治療后復發或難治性大BCL 的成年患者［11］。以2×106CD19-CAR-T/kg 的劑量向111 例DLBCL 患者輸注Axicabtagene ciloleucel，完全緩解率為54%，療效顯著［13］。第三代基于CD3ζ/CD28 的CD19 特異性的CAR T 產品Brexucabtagene Autoleucel（TECARTUS）于2020 年被FDA 和EMA 批準用于治療套細胞淋巴瘤（MCL）［14］。然而，最新的長期隨訪研究顯示，高達41%的ALL 患者會出現疾病復發，相比之下，DLBCL 的反應率似乎更持久，大多數患者在12 個月的隨訪期間沒有復發［10］?？傊?，CAR T 療法已成為治療血液系統惡性腫瘤的重要選擇。

3 CAR T 治療血液系統惡性腫瘤存在的問題

3.1 CAR T 持久性和增殖不足 CAR T 足夠的持久性和增殖率被證明與緩解率相關［15］。CAR T 的持久性和增殖率取決于共刺激域。CAR 中含有CD28 結構域的T 細胞獲得了具有快速增殖和葡萄糖代謝的效應記憶表型，這導致了更快的腫瘤細胞清除速率。相比之下，基于4-1BB 的CAR T 表現出較慢的抗腫瘤活性，T 細胞主要分化為具有增強耐力、氧化代謝和增加線粒體生物發生的中央記憶細胞。淋巴細胞不同亞群的持久性和活性似乎依賴于不同的共激活域。細胞毒性（CD8+）CAR T 的持久性被證明取決于4-1BB 信號傳導，而輔助（CD4+）CAR T 需要ICOS 信號傳導。使用針對亞群調整的CAR 分子重新定向T 細胞導致CAR T 在小鼠模型中的持久性和抗癌功效增強［16］。此外，CAR T 的亞群組成是影響治療結果的一種方式。首個具有明確CD4/CD8 比率的CAR T 療法似乎甚至適用于患有嚴重白細胞減少癥的患者，目前正在接受FDA 的批準程序［17］。

然而，如果沒有具有高增殖潛力的強效T 細胞，即使是完美的嵌合抗原受體也會表現不佳。目前，臨床前試驗通常是基于健康供體的T 細胞，不考慮腫瘤發生過程中發生的計數變化。研究表明，在腫瘤發生過程中，T 細胞獲得耗竭表型，增殖能力降低，而這種變化在癌癥晚期似乎是不可逆轉的［18］。與健康細胞相比，耗盡的中樞記憶T 細胞具有不同的轉錄狀態［19］。

3.2 抗原陰性疾病復發 CD19 抗原丟失是B-ALL患者在CD19 CAR T 治療后復發的主要原因。CD19抗原丟失也顯示在非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者中［20］。最近描述了導致抗原丟失的兩種主要機制：抗原逃逸和譜系轉換。

缺乏同源表位的表型相同疾病的復發是抗原逃逸的特征。B-ALL 中描述了CD19 的幾種剪接變體。一些變體在抗原的細胞外部分缺乏CAR T 識別的表位，而其他變體缺乏跨膜區，導致CD19 表面表達的喪失［21］。在CAR T 輸注之前，已經可以在患者中檢測到腫瘤細胞中的CD19 剪接變體［22］。CAR T 只是刺激對治療耐藥的惡性細胞變體的選擇。然而，也報道了抗原逃逸的其他機制。Friederike Braig 等［23］已經表明CD81（一種調節CD19 成熟和運輸的蛋白質）的轉錄后改變導致CD19 表達的喪失和疾病的復發。另一方面，譜系轉換機制取決于癌細胞對治療的反應從淋巴樣到髓樣表型的變化［24］?？朔@些障礙的主要方法如上所述，依賴于同時靶向多個表位。

4 實體瘤中的CAR T

隨著CAR T 療法在血液系統惡性腫瘤的臨床成功，在實體瘤中的試驗也緊隨其后。迄今為止，已經啟動了100 多項CAR T 在實體瘤中的臨床試驗，其中大部分使用的是第二代或第三代CAR，并且有至少20 項已發表研究結果。雖然在實體瘤中，CAR T 細胞療法迄今未能表現出與血液系統惡性腫瘤相似的緩解率，但在各種實體瘤臨床試驗中仍有部分患者獲得部分或完全緩解，說明CAR T 療法對實體瘤是有效的。在一項靶向神經母細胞瘤的雙唾液酸神經節苷脂2（GD2）特異性CAR T 治療的Ⅰ期臨床試驗中，入組時患有活動性疾病的11 例患者中有3 例實現了完全緩解［25］。靶向肉瘤的人表皮生長因子受體2（HER2）特異性CAR 的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究也報道了令人鼓舞的結果，在17 例可評估的患者中，3 例病情穩定，能夠接受手術切除殘留腫瘤，無需進一步治療即可完全緩解［26］。在Brown CE 等［27］的一項研究中，使用IL13Rα2特異性CAR T 進行區域多劑量治療后，1 例播散性膠質母細胞瘤患者完全緩解?？傊?，CAR T 療法在實體瘤試驗中的臨床緩解率不如血液系統惡性腫瘤顯著，但迄今為止觀察到的臨床表現也證實了其在實體瘤中的治療活性。

5 CAR T 治療實體瘤的障礙

5.1 腫瘤抗原異質性和腫瘤抗原逃逸 實體瘤由分子異質亞群組成，不同腫瘤的抗原表達不同。異源靶抗原的表達限制了CAR T 治療的結果，并與抗原逃逸，腫瘤耐藥和去除大多數免疫原性表位后的復發有關［20］。在接受表皮生長因子受體（EGFR）靶向CAR T 治療的復發性膠質母細胞瘤患者中，已經顯示出由腫瘤抗原丟失引起的腫瘤耐藥性［28］。因此，解決腫瘤異質性和克服腫瘤逃逸是實現長期緩解的必要條件。

研究人員一直致力于構建多靶CAR T，旨在通過識別多種抗原來抑制腫瘤逃逸。串聯CAR T 具有兩個scFV，可識別CAR 構建體的不同抗原。一項研究在膠質母細胞瘤小鼠模型中比較了共表達HER2 和IL13Rα 的串聯CAR T 與單特異性CAR T 的效果，發現前者抗原逃逸減少，并提高了腫瘤清除率［29］。目前已經開發了同時表達多種CAR 構建體的CAR T。一項研究發現，在自體小鼠模型中，針對3 種不同膠質母細胞瘤靶標的三價CAR T 在不同小鼠之間出現抗原異質性，并促進了腫瘤清除［30］。在腫瘤環境中靶向突變抗原或非腫瘤細胞抗原，例如成纖維細胞或腫瘤脈管系統，也可以克服抗原逃逸［31］。如一項研究所示，識別EGFRvⅢ的EGFRvⅢCAR T 抑制了膠質母細胞瘤模型中的腫瘤生長［32］。

其他克服抗原逃逸的嘗試還包括使用表達雙特異性T 細胞接合物（BiTE）的修飾T 細胞和能夠誘導內源性免疫反應以協同消除腫瘤的免疫調節劑。BiTEs 的主要機制是利用兩個靶向CD3 和腫瘤抗原的scFv 將T 細胞與腫瘤細胞連接起來，從而招募和激活內源性T 細胞殺死腫瘤細胞。一項研究發現，表達EGFR 靶向BiTE 的CAR T 能夠在膠質母細胞瘤模型中招募內源性T 細胞，有效減弱抗原表達異質性，并抑制抗原逃逸［33］。此外，表達CD40 配體（CD40L）的CAR T 也已被證明可提供CD40 激活信號并激活內源性抗原呈遞細胞（APC）以分泌刺激性細胞因子，從而增強抗腫瘤功效并克服抗原逃逸［34］。

5.2 有限的CAR T 運送 從血液到腫瘤部位的成功轉運是CAR T 攻擊腫瘤細胞的先決條件。與容易進入血液惡性腫瘤不同，實體瘤常會因各種原因導致T細胞歸巢效率低下和腫瘤部位浸潤受限。腫瘤組織表達的趨化因子失配，與CAR T 上的趨化因子受體（CCR）不兼容導致T 細胞歸巢效率低下［35］。由致密細胞外基質（ECM）構成的物理屏障以及實體瘤中異常的腫瘤血管則進一步抑制了浸潤。局部輸注將CAR T遞送至腫瘤部位或顱腔可以有效避免全身性注射的毒性和脫靶效應，是一種潛在的手段。臨床前模型顯示，顱內注射靶向HER2 和IL13Ra2 的CAR T 治療乳腺癌腦轉移和膠質母細胞瘤的療效顯著［36］。局部注射雖然具有較好的療效，但理論上這種方法僅限于單個腫瘤病變。

為了增強T 細胞浸潤并實現細胞歸巢，探索其他方法是有必要的。通過直接優化CAR T 表達的CCR，可以更好地與腫瘤細胞表達的趨化因子配體（CCL）相互作用。Moon 等［37］利用慢病毒載體獲得表達CCR2b的抗間皮素CAR T，該細胞與癌細胞分泌的CCL2 相互作用，改善了T 細胞浸潤，并提高了抗腫瘤活性。另一項研究發現，表達CXCR2 的CAR T 可以促進T 細胞歸巢并增強抗腫瘤反應［38］。此外，CCR4 等其他CCR也已被證明在不同程度上是有效的。

為了增強T 細胞的遷移和浸潤能力，另一種潛在的方法被提出，即通過改造CAR T 來識別基質細胞相關抗原或分泌基質降解酶來破壞實體瘤中的物理屏障。在許多實體瘤中的成纖維細胞上均有表達的蛋白酶成纖維細胞活化蛋白（FAP）使這種方法看到了希望。Wang 等［39］研究發現，靶向腫瘤基質中FAP 的CAR T 可以有效抑制腫瘤生長，增強宿主免疫力，而不會產生嚴重的毒性反應。腫瘤基質等物理障礙限制了T 細胞的浸潤。由于硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）是CAR T 進入腫瘤細胞必須降解的主要成分，因此表達乙酰肝素酶（降解HSPG 的酶）的CAR T 可能改善T細胞浸潤能力。一項旨在補充基質中乙酰肝素酶不足的研究發現，表達乙酰肝素酶的CAR T 可以增強T細胞浸潤并提高抗腫瘤活性［40］。

5.3 微環境免疫抑制 即使成功將CAR T 運送到腫瘤部位，高度免疫抑制的TME 也可以限制其發揮作用。實體瘤的抑制性TME 主要是由多種免疫抑制分子和抑制性免疫細胞組成的。抑制性免疫細胞（如調節性T 細胞）可以通過接觸依賴性的方式，阻礙CAR T 增殖，降低細胞毒性。而一些抑制性因子［如轉化生長因子-β（TGF-β）和IL-10］則可以促進T 細胞通過間接接觸導致細胞無反應。近來已經發現，多種方式可以克服免疫抑制性TME，提高T 細胞的存活和增殖［41］。

一些研究致力于修飾CAR T 過表達的細胞因子促進炎癥，如IL-12、IL-15 和IL-18。IL-12 是一種促炎細胞因子，因其具有增強CD8+細胞的細胞毒性能力，并可以通過巨噬細胞的募集和參與降低腫瘤逃逸而成為研究熱點［42］。Yeku 等［43］研究發現分泌IL-12的工程改造的T 細胞可以顯著延長生存時間，增加細胞毒性，抵抗細胞凋亡和PD-L1 誘導的功能抑制。在白血病模型中，還發現表達IL-15 的抗CD19 CAR T細胞實現持久性并誘導持續緩解，這可能與記憶細胞亞群的形成有關［44］。同樣，在神經母細胞瘤轉移模型中，用IL-15 優化GD2 CAR T 可提高抗腫瘤能力［45］。此外，有關分泌IL-18 的CAR T 的相關研究表明，這些細胞具有增強增殖和浸潤能力，并且可以募集內源性免疫細胞來調節TME［46］。

阻斷CAR T 和TME 中的免疫抑制信號可以使CAR T 免受免疫抑制分子的影響。TGF-β 信號傳導是重要的免疫抑制途徑，因此促進抗腫瘤反應的可行替代方法是阻斷TGF-β 信號傳導。一項研究發現，在臨床前前列腺癌模型中，TGF-β 顯性陰性受體（DNR）可以有效地保護CAR T 免受免疫抑制細胞因子的干擾，抑制信號轉導［47］。同時，Sukumaran 等［48］用受體工程改造CAR T，將TGF-β 信號轉化為4-1BB或IL-12 刺激信號，可以改善抗腫瘤作用，并對免疫抑制信號產生抗性。另一項研究還發現，阻斷TGF-β信號的CAR T 不僅可以增強細胞毒性和提高抗腫瘤活性，而且還可以保護相鄰的免疫細胞免受TGF-β介導的免疫抑制作用［49］。

同樣，對胰腺癌模型的研究表明，表達反向細胞因子受體的CAR T 可以促進T 細胞存活。將IL-4 的細胞外片段和IL-7 受體的細胞內片段融合，可以使細胞因子的免疫抑制信號轉化為激活信號［50］。此外，營養缺乏、低pH 值和低氧等代謝紊亂是TME 的另一個特征，而代謝競爭則進一步限制了CAR T 的活性［51］。改變CAR T 的代謝途徑也可能是一種有效的手段。例如，在低氧條件下，可以穩定表達轉錄因子低氧誘導因子1-α（HIF-1α），通過修飾CAR T 表達HIF-1α，具有抗缺氧的能力，可以增加CAR 表達和提高溶瘤作用，改善抗腫瘤作用［52］。

6 CAR T 療法的毒性

CAR T 療法給腫瘤患者帶來了希望，但難以預測的急性毒性阻礙了其廣泛實施。細胞因子釋放綜合征和免疫效應細胞相關神經毒性綜合征是發生最頻繁、癥狀最突出的急性毒性反應，癥狀嚴重者可能會危及到生命。其他毒性還包括與CAR T 相關的腦病綜合征、巨噬細胞活化綜合征、吞噬性淋巴細胞組織細胞增生、移植物抗宿主病、靶向腫瘤外毒性、過敏反應和感染。

6.1 細胞因子釋放綜合征 細胞因子釋放綜合征（CRS）是CAR T 療法最常見的不良反應。CAR T 識別同源抗原，激活T 細胞和旁觀者免疫細胞，IL-1、IL-6、IL-15 和干擾素γ（IFN-γ）等促炎細胞因子的過度釋放，引起全身免疫激活，臨床表現為高熱、低血壓、缺氧甚至多器官功能障礙［53-54］。在活化的免疫細胞中，巨噬細胞在CRS 的病理生理學中發揮著至關重要的作用［55］。CRS 通常發生在CAR T 輸注后的第一周，可以通過使用托珠單抗（抗IL-6R 抗體）進行控制［56］。對于托珠單抗無反應或重度CRS 患者，建議使用皮質類固醇，但可能會影響CAR T 的有效性［56-57］。在極少數情況下，CAR T 輸注后也可能會出現全身性高炎癥性疾?。?7］。由于這種疾病的臨床表現和實驗室檢查結果與CRS 相似，也可能出現具有較高死亡率的噬血細胞綜合征，需額外使用依托泊苷或阿糖胞苷治療［58］。

6.2 免疫效應細胞相關神經毒性綜合征 免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS）是CAR T 療法第二個最常見的不良反應。在輕度病例中，患者通常會出現注意力下降、語言障礙和書寫障礙。而在嚴重的情況下，患者通常會出現癲癇發作、運動無力、顱內壓升高、視神經盤水腫和腦水腫。雖然在大多數情況下是可逆的，但ICANS 會延長住院時間，需要對部分患者進行重癥監護，可能會造成延遲康復，護理成本增加［59］。目前，CRS 的病理生理學已被廣泛研究，并且已經制定了抗IL-6 治療的適當治療方法，但ICANS 的病理生理學及其最佳治療方法尚不清楚［56］。ICANS的發展有兩個主要假設，即細胞因子擴散到大腦和T細胞進入中樞神經系統［60］。第一種假設認為，ICANS的發展與循環內和腦脊液中高水平的炎性細胞因子有關，單核細胞衍生的IL-1 最近被認為是神經毒性的關鍵驅動因素［60］。第二種假設認為，血腦屏障通透性增加可能會促進T 細胞進入中樞神經系統導致神經炎癥［61］。與CRS 同時出現的神經毒性通常癥狀較輕且持續時間較短，而CRS 后出現的神經毒性通常更嚴重（≥3 級）且持續時間較長［56］。與CRS 類似，ICANS 管理取決于毒性等級，對CRS 并發ICANS 的患者推薦使用托珠單抗，ICANS 癥狀嚴重的患者皮質類固醇的作用更顯著。

7 總結和展望

CAR T 療法一直是免疫細胞治療領域的焦點，極有希望徹底改變某些腫瘤（特別是血液腫瘤）的臨床治療現狀。美國是全球最早開啟CAR T 治療臨床試驗的國家。2010 年以前，全球CAR T 治療臨床注冊試驗都集中在美國開展。我國從2012 年起開始了CAR T 治療臨床注冊，每年新注冊的CAR T 項目以數倍的速度爆發式增長，目前已成為全球CAR T 療法臨床試驗注冊數量最多的國家［62］。但是CAR T 療法在技術上和臨床應用上仍然存在著許多亟待解決的問題。

從短時間內的治療效果看，CAR T 療法對某些血液腫瘤的治療效果十分顯著，但若將觀察期限進一步延長則會發現，許多患者在經過CAR T 治療幾個月甚至更長時間后，會出現腫瘤復發的現象，影響患者預后。因此，提高CAR T 激活程度，提高其增殖能力，并延長CAR T 在患者體內的存活時間是未來研究的重點方向之一。

目前，CAR T 療法在血液系統惡性腫瘤中的治療效果良好，而在實體瘤上的應用還是以嘗試為主，雖然現在結果不明顯，但無論是基礎研究還是臨床研究，都還沒有證據表明這條路完全行不通，其在治療實體瘤領域依然存在很大的發展空間。