LncRNA在肺動脈高壓中的作用研究進展

陸維 陳亮 姜玉新 陸志偉

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)的主要特征是肺血管重塑,從而導致動脈管腔變窄,肺血管阻力增加,肺動脈壓升高,最終右心衰竭甚至死亡。肺動脈內皮細胞,肺動脈平滑肌細胞,成纖維細胞,免疫系統失調及血管生成受損等因素參與肺血管重塑[1]。PAH目前病因不明,可能與遺傳突變、表觀遺傳、環境因素,免疫炎癥等相關,目前對PAH的發病機制的研究已經取得了顯著進展。

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)因其在疾病中的作用,已經成為越來越令人感興趣的領域。ncRNA中的一個亞組,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),內源性表達缺乏蛋白編碼能力的RNA,這些RNA在一系列病理生理過程中發揮重要作用,譬如調節細胞活動(增殖、遷徙、凋亡、血管新生、新陳代謝),炎癥反應和免疫應答和血管新生[2]。根據lncRNA在蛋白質編碼區域附近的基因組位置,lncRNA被分為5類:正義,反義,內含子,基因間和雙向作用lncRNA[3]。然而,非編碼RNA并非完全不參與編碼,現已發現lncRNA可參與編碼蛋白質或多肽[4],這些功能肽可能成為抗癌治療的靶點或預后的標記物。近年來,大量研究表明其在PAH發病機制中參與細胞差異表達。本文將綜述lncRNA在PAH病理生理中的作用,并闡述其在PAH診斷及治療中的作用及面臨的挑戰。

一、LncRNA在PAH中的作用機制

肺動脈血管重塑是PAH的重要機制,肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的過度增殖和凋亡抵抗可導致肺血管重塑。PASMC的功能障礙可由不同的信號通路介導,包括:PDGF,TGF-β,Wnt,雌激素,Notch,PI3K/AKT/mTOR 和 MAPK等。目前大部分lncRNA的研究都集中在PAH發展過程中對PASMCs及肺動脈血管內皮細胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)的調節作用。

1 H19

LncRNA H19是一種高度保守lncRNA,在胚胎形成過程中,在許多胎兒組織和在胚胎本身中高表達,但H19出生后在除了心臟和骨骼肌中以外的組織中下調[5]。近來,一些研究揭示了H19在PAH發病機制中的調節作用,其表達水平在野百合堿(MCT)誘導的PAH兔子和小鼠模型的血液和肺中均有升高,此外,已證明PDGF,IL-1β和 IL-6可以誘導產生H19,且可以通過PDGF-BB/H19/let-7b信號軸調節1型血管緊張素II受體促進PASMC細胞增殖[6]。而對小鼠模型中H19進行敲降,則對MCT誘導的PAH臨床特征(右室肥大,肺血管中膜厚度和血管肌化等)表現出保護作用,表明H19可能是PAH的一個潛在治療靶點。但是有研究則得出不同的結論,Wang等最近的研究表明,MCT誘導的PAH大鼠的H19,PDCD4和miR-675-3p水平顯著降低,而IGF1R 和 miR-200α的表達水平增高,并證明了褪黑素可通過調節H19/miR-200α/PDCD4 和H19/miR-675-3p/IGF1R信號軸,抑制PASMCs 增殖,對PAH起保護作用[7]。故此,H19在肺血管重塑的作用方向尚不明確,仍需要更多在人類PAH樣本中的研究。

2 CASC2

癌癥易感性候選者2(Cancer Susceptibility Candidate 2,CASC2)是一種腫瘤抑制基因,已被研究證明通過不同的機制調節細胞增殖、遷移、侵襲、轉移和血管生成。Gong等研究表明CASC2的表達水平在缺氧誘導的大鼠PAH模型的PA中和人PASMCs(HPASMCs)中明顯降低,且無論體內和體外,CASC2過表達都可以抑制細胞增殖和遷移,并促進凋亡。此外,CASC2過表達可通過降低缺氧誘導的表型切換相關標記物α-SMA的表達。CASC2過表達可以改善缺氧誘導的大鼠的肺動脈高壓的表現如:平均肺動脈壓,RV肥厚,肺血管內壁增厚和纖維化等[8]。另一項體外研究表明,CASC2可通過調節miR-222/ING5軸減弱缺氧誘導的HPASMC的增殖和遷移,表明CASC2可能作為抑制PAH中的血管重塑的一個靶點[9]。

3 TUG1

?；撬嵘险{基因1(Taurine-Up-Regulated Gene 1,TUG1)是一種長度為7.1 kb 的lncRNA,在PASMC的細胞質和細胞核中都有表達,其在哺乳動物中高度保守。既往的研究表明TUG1參與調控蛋白和miRNA的表達,在細胞增殖、凋亡和染色質的調控重塑中起重要作用。Yang等的研究表明,TUG1在缺氧誘導的小鼠模型和PASMCs中高表達。TUG1通過與miR-374c結合,上調Foxc1的表達,而沉默的TUG1通過結合miR-374c下調Foxc1表達,從而抑制增殖和遷移,并通過Notch信號通路促進PASMCs凋亡,阻礙PAH的肺血管重構[10]。Wang[11]等的研究發現TUG1是通過結合miR-328來調節HPASMCs的增殖和細胞周期,而TUG1是否還通過其他機制調節PAH,如表型轉換,免疫失調,炎癥反應等,仍需要進一步研究。

4 MALAT1

轉移相關肺腺癌轉錄物1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1,MALAT1)是一種高度保守的lncRNA,已發現其參與多種癌癥發病機制,Brock等報道了MALAT1在低氧的HPASMCs和缺氧誘導的小鼠肺組織中顯著升高,并發現MALAT1可促進PASMCs的增殖和遷移,并調節它的表型。此外,MALAT1基因敲除可以抑制體外PASMC的增殖,通過上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達來抑制小鼠模型心肌肥厚[12]。而Zhuo等,在MALAT1基因上識別了一個與PAH易感性相關的單核苷酸多態性序列rs619586A>G,而MALAT1 rs619586 GG等位基因對PAH有保護作用。進一步的功能實驗表明,MALAT1中rs619586A到G的改變可以通過作為miR-214的競爭性內源性RNA (ceRNA)直接上調X盒結合蛋白1 (XBP1)的表達,并因此通過縮短S-M相變來抑制血管內皮細胞的增殖和遷移[13]。此外,還有研究表明MALAT1通過調節miR-503/Toll樣受體4促進HPASMCs遷移和增殖[14]。這表明MALAT1可能通過多種路徑抑制PASMC的增殖。

5 MEG3

母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)位于人類染色體14q32上,長度為1.6kb,它是一種腫瘤抑制因子。Piccoli等的研究表明,MEG3主要定位于缺氧PASMCs的細胞質中,在缺氧誘導的PAH動物模型和特發性肺動脈高壓患者的PASMCs中表達水平顯著升高[15]。MEG3通過肺特異性傳遞小干擾RNA (siRNA)進行敲除后,可抑制PAH在體內的發展。MEG3基因沉默后,特發性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary hypertension,IPAH)患者的PASMCs和體外缺氧暴露的PASMCs二者的細胞增殖和細胞周期進程均減弱,此外MEG3還可與microRNA-328-3p (miR-328-3p)相互作用并導致其降解,導致胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)上調。這可能揭示了MEG3在缺氧誘導PASMC增殖中存在多種調控機制[16]。

6 ANRIL

INK4位點上的lncRNA反義非編碼RNA (Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus,ANRIL)是一段長126kb的長鏈非編碼RNA,包含19個外顯子,定位于染色體9p21區域的INK4位點上。ANRIL首先在家族性黑色素瘤患者中發現。ANRIL的失調和血管內皮功能障礙、細胞增殖、凋亡、遷移、血管平滑肌細胞的衰老、單個核細胞增殖和粘附以及DNA損傷有關。Wang等人的研究表明,ANRIL在缺氧的HPASMCs中表達顯著下降,而siRNA導致的ANRIL靜默加速了細胞周期進程,使更多的HPASMC從G0/G1期進入G2/M+S期,增加了缺氧暴露的HPASMCs細胞增殖和遷移,證明ANRIL在缺氧HPASMCs中起重要作用[17],這可能為PAH的治療提供了新的靶點,但仍需要更多的研究去證實及探索更多的作用機制。

7 TYKRIL

生物信息學分析發現酪氨酸激酶受體誘導lncRNA(Tyrosine Kinase Receptor Inducing LncRNA,TYKRIL)是所有條件下唯一普遍上調的lncRNA。PDGF、IL-18 和TGF-β等促PAH因子可誘導TYKRIL表達上調。有研究表明TYKRIL可通過p53/PDGF信號軸促進PASMC細胞增殖,同時抑制其凋亡。且在體外對IPAH患者的肺精確切割薄片(PCLS)研究,證明用GapmeR介導的PCLS中TYKRIL的敲除,可逆轉肺血管重構,說明TYRIL對PAH有潛在的治療作用[18]。

8 SMILR

平滑肌富集lncRNA(Smooth Muscle Enriched Long Noncoding RNA,SMILR)的表達已被證明在PAH患者、MCT誘導的PAH模型和缺氧誘導的HPASMCs中高表達。一項體外研究表明,SMILR的下調通過靶向miR-141抑制缺氧誘導的PASMC的增殖和遷移,SMILR 的雙鏈RNA在MCT誘導的PAH大鼠模型中的傳遞,可通過靶向Rho/ROCK/miR-141軸改善PAH和肺血管重塑[19]。但其目前在PAH中的研究仍非常有限,未來需要更多的研究去證實及探索其在PAH中的作用。

9 PAXIP1-AS1

一項小樣本的研究發現PAXIP1-AS1在IPAH患者的肺小動脈,血管外膜成纖維細胞和PASMC中表達上調。而PAXIP1-AS1的抑制可通過靶向其下游的樁蛋白促進細胞凋亡,抑制PASMC的增殖和遷移[20]。還有研究亦得出PAXIP1-AS1的表達在缺氧誘導的大鼠PAH模型和缺氧的PASMCs中均顯著升高。該研究發現PAXIP1-AS1通過與WIPF1/RhoA復合體相互作用,招募轉錄因子ETS1形成調控復合體充當支架的作用。PAXIP1-AS1的敲除顯著抑制缺氧誘導的HPASMCs的細胞活力和遷移[21]。

10 RPS4l

核糖體蛋白S4l(Ribosomal Protein S4-Like,RPS4l)是Liu等在缺氧誘導的小鼠PAH模型中,通過高通量RNA測序技術發現了其在肺組織中的表達降低,并在PASMCs中也驗證了這一點。RPS4l可通過調控PASMCs中白細胞介素增強劑結合因子3 (ILF3)和缺氧誘導因子1 (HIF-1α),來調節細胞增殖、遷移和細胞周期進程等功能,而轉基因小鼠過表達RPS4l可通過減少肺血管重構和右心室肥厚來減緩PAH的發展[22]。進一步的研究發現,RPS4l編碼的一條新肽RPS4XL,在缺氧誘導的PAH和缺氧PASMCs中下調。RPS4XL通過抑制其結合蛋白RPS6的磷酸化來抑制缺氧誘導的PASMC的增殖,表明這條肽可能在缺氧的PAH中起作用[23]。但這些仍需要更多的研究在體內及PAH患者中證實。

11 GAS5

LncRNA生長停滯特異性轉錄本5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)已被發現在多種腫瘤中表達下調,比如肺、乳腺、膀胱、胃、前列腺和胰腺癌等,表明GAS5可能在細胞生長和增殖中起抑制作用。近來,在缺氧誘導的PAH大鼠的肺和缺氧的PASMCs中,GAS5的表達被發現顯著下調,用siRNA沉默GAS5的表達可能通過GAS5/miR-23b-3p/KCNK3信號軸來刺激HPASMCs的遷移和增殖[24]。與此一致的是用血小板源生長因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)處理的PASMC中也發現了GAS5表達的下調,進一步的研究發現GAS5通過靶向miR-382-3p調節慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(CTEPH)大鼠的肺動脈壁增厚、血管生成和自噬[25]。Wu等在CETPH患者及大鼠模型中采集肺動脈內皮細胞,研究亞精胺(SP)誘導自噬的機制中發現,SP誘導的自噬使PAECs中的GAS5升高。GAS5的下調則可逆轉了SP在PAECs中的作用,進一步的研究發現GAS5在體內外通過miRNA 31 5p/NAT8L信號通路促進SP誘導的自噬,表明GAS5未來可能是治療CTEPH分子標記物之一[26],但是目前GAS5與其他的lncRNA存在一樣的問題,其多在嚙齒動物模型中研究,在哺乳動物中或是體內研究甚少,未來還有很大的研究潛力

12 PAHRF

肺動脈高壓相關因子(Pulmonary Arterial Hypertension Related Factor,PAHRF),又名NONHSAT169231.1,位于人類14號染色體上,缺氧暴露的HPASMCs和PAH患者的肺動脈中有較低的PAHRF表達水平,PAHRF過表達抑制HPASMCs的細胞增殖,促進細胞凋亡,然而對它進行敲除則得到相反的效果。PAHRF可以通過內源性吸附miR-23a-3p,最終使MST1的表達下調。過表達PAHRF的質粒在缺氧條件下可抑制miR-23a-3p的表達,從而刺激HPASMCs增殖和抑制凋亡來促進缺氧肺動脈高壓的肺血管重塑[27]。

13 MANTIS

又稱n342419,有研究表明其在MCT- PAH大鼠模型和晚期IPAH患者的肺中表達降低,在人膠質母細胞瘤患者分離出的ECs中和喂養動脈粥樣硬化飲食的食蟹猴頸動脈中明顯升高。表明MANTIS在不同疾病中表達具有特異性,進一步的研究表明,如果對 MANTIS進行抑制或敲除,在注射了基質嵌入的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)小鼠體外實驗中,ECs的遷移,血管管腔形成和血管出芽均受到抑制,這可能解釋了由于MANTIS下調導致PAH患者遠端肺動脈血管生成受阻的原因[28]。

二、LncRNA在PAH中的診斷作用

目前已經發現多種lncRNA在PAH中表達異常,參與了PAH的不同階段。Omura等的研究發現血漿H19水平可以區分PAH患者與對照組,其水平與RV功能相關,并還能預測長期生存,這表明H19可能是PAH診斷和預后生物標志物,且已有指南將其納入PAH預后分層的亞組[29]。還有小樣本的研究中發現IPAH患者肺小動脈,血管外膜成纖維細胞和PASMC中PAXIP1-AS1的增高[20],除此之外還有研究發現PAH患者血漿中MALAT1增高[14],這些都可能成為PAH診斷的生物標志物。但目前仍缺乏在人類大樣本中的研究,且各種lncRNA參與的PAH發生發展的階段仍不明,導致在患者中采集標本的時機不明,可能影響其作為生物學標記物的開發。其在臨床實踐中實現更準確的PAH風險分層、診斷和預后管理仍有很大的潛力。

三、LncRNA在PAH中的治療作用

目前,針對lncRNA的作用僅在一些腫瘤的動物模型中進行,且因為lncRNA在物種間的保守性很差,目前尚無理想的人類PAH模型,這使得開發和測試用于人類的lncRNA藥品非常困難。此外,多數lncRNA存在于細胞核,且具有高度二級結構,這使得 siRNA與這部分lncRNA結合并使其沉默變的困難,而構建lncRNA高表達質粒的方式也存在受限于細胞核的問題,Yin等[30]設計了 Sno載體,其可以穩定地表達任何感興趣的序列,并限制其在細胞核中的積累,并且可能保持著正常的核關聯核功能,這可能為這些定位在細胞核的lncRNA功能的探索提供新的方法。

四、結語

PAH是一種以肺血管重構為特征的疾病,可導致肺動脈壓持續升高、右心衰甚至死亡。lncRNA是轉錄和轉錄后水平調控基因表達的關鍵分子。目前大量的證據表明lncRNA是PAH發病和進展的重要作用。新的PAH相關lncRNA及其調控機制不斷發現。這些lncRNA不僅有望成為治療藥物的有效靶點,還可能為PAH分層、預后方面提供依據。但是,目前的研究多在體外或嚙齒動物模型中進行,其主要的建模方法為缺氧和野百合堿誘導模型,而建立靈長動物模型可行栓塞或動靜脈分流術,但 PAH形成的機制復雜,目前鮮有研究對這些動物模型和人類PAH的相關性進行研究,而有關lncRNA治療研究也非常有限,尤其在臨床應用方面。因此,需要繼續研究lncRNA的作用機制,探索更有效的、可及的靶點;同時探索建立理想的PAH模型,使lncRNA相關的藥物能夠走向臨床應用。