5個綿羊品種DLK1基因多態性與生長性狀的關聯性分析

孟泉祿,張明軍,史金平,付玲娟,劉 婷,張全偉,成述儒

(1.甘肅農業大學 動物科學技術學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅農業大學 生命科學技術學院,甘肅 蘭州 730070)

甘肅省地域遼闊,適合多個綿羊品種生長繁殖,且不同品種綿羊在生長繁育過程中能保持其獨有的生產特性。甘肅高山細毛羊主產于甘肅省肅南縣,是我國高寒山區第1個綿羊新品種,主要特點是能適應高寒牧區嚴酷的自然生態條件[1];蒙古羊膻味較輕、肉質鮮美和育肥增膘能力等生產性能顯著,廣泛分布于內蒙古和甘肅地區[2];藏綿羊是典型的中國粗毛羊品種,抗逆性強、耐粗飼[3];小尾寒羊屬外來品種,生長發育快、肉用性能好,是世界著名高繁殖力綿羊之一[4];灘羊原屬蒙古羊,具有耐干旱、個體大和適應性強等特性[5]。綿羊生產性能受環境影響,同時還受到遺傳因素調控,挖掘與綿羊生長性能相關基因,是提高綿羊產業發展的理論基礎。

DLK1(delta-like 1 homologue,DLK1)是一種父源表達印記基因,定位于人14號染色體、小鼠12號染色體和綿羊18號染色體上,其主要編碼跨膜蛋白,同時對肌肉生長也具有一定的調節作用[6]。研究表明,DLK1轉錄和翻譯產物在人類胎兒期各組織中廣泛表達,出生后表現出組織特異性,僅在胰腺、垂體和腎上腺等組織中表達[7]。同其他印記基因相似,DLK1是哺乳動物生長發育的重要調節因子,其表達水平對細胞增殖和分化有顯著影響[8]。Andersen等[9]通過對骨骼肌重塑過程中DLK1的表達量研究發現,DLK1在人類所有疾病中都呈上調趨勢,且DLK1轉錄和翻譯產物的表達高峰與成肌細胞分化融合的表達相一致,由此推測,DLK1可能在不同的水平和時間點參與肌肉發育和重塑的過程。Shin等[10]對處于不同生長時期雞的DLK1克隆和序列分析發現,DLK1可能在脂肪和肌肉組織發育的早期階段起重要作用。Waddell等[11]通過建立小鼠DLK1基因敲除和過表達模型發現,DLK1基因敲除導致小鼠出生后生長遲緩和肌肉再生能力受損;相反,DLK1過表達能抑制培養成肌細胞的增殖和增強分化。因此,DLK1可促進哺乳動物肌肉生長發育,但對脂肪組織分化和增長具有抑制作用。近年來,有研究發現綿羊的雙肌臀性狀也是由DLK1基因過表達所致[12],但具體有關DLK1基因參與肌肉的生長發育的機制尚不清楚[13]。本研究就DLK1基因多態性是否影響綿羊生長性能開展試驗,以期尋找新的與綿羊生長性能相關的分子標記,進而為提高甘肅綿羊生產性能提供基礎數據和理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

本試驗以甘肅省內固有綿羊品種—藏綿羊、蒙古羊、甘肅高山細毛羊、灘羊和外來品種小尾寒羊共240頭為研究對象,具體來源和數量見表1。

表1 羊樣品信息

綿羊不同生長期(0,1,3,6,9月齡)測定記錄體質量、體高、體長和胸圍等生長性能指標;9月齡頸靜脈采集綿羊血液,-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 血液基因組DNA提取

室溫溶化冷凍血液樣品,按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說明提取基因組DNA,NanoDrop 2000分光光度計測定其純度和濃度,以1.8～2.0為參考作為純DNA,用于后續試驗,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量,檢測合格后用于下一步PCR擴增。

1.3 引物設計

根據NCBI提供綿羊DLK1基因(XM_027957404.2)CDS序列,使用Primer 3.0在線設計網站設計DLK1基因特異性引物,引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成,引物信息如下DLK1-F:5′-GGACGCTTGTTGAGTGAGTGT-3′,DLK1-R:5′-TTTGTTCAGAGTGAGAGCCAA-3′,目的片段大小216 bp。

1.4 DLK1基因的PCR擴增程序

PCR反應體系20 μL:2×Taq Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板(80 ng/μL)1 μL,ddH2O 8 μL。擴增程序如下:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,重復循環40次;最后72 ℃延伸5 min。擴增完成后使用1×TBE 緩沖液、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物質量,凝膠成像系統觀察并攝片。

1.5 DLK1基因多態性PCR-SSCP分析

SSCP基因分型反應:4 μL PCR擴增產物和6 μL變性緩沖液振蕩混合均勻,98 ℃金屬浴變性10 min,結束后快速置于冰盒中冷卻10 min完成變性;之后將變性產物迅速注入凝膠孔,待樣品沉入膠孔底部,150 V恒壓電泳;至2條DNA單鏈分開后,增加電壓至180 V于含1×TBE的聚丙烯酰胺凝膠中電泳6 h。

為使條帶更清晰可視化,對電泳產物進行銀染顯型,凝膠成像儀攝片。挑選不同基因型個體送至西安擎科澤西生物科技有限責任公司進行DNA測序。

1.6 統計分析

根據PCR-SSCP檢測結果,對多態基因座的不同基因型進行統計分析,利用MEGA 7.0軟件比對核酸序列,POPGENE分析軟件處理基因型頻率等相關群體遺傳參數,SPSS 20.0對生長性狀指標參數進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 血液基因組DNA

提取待測定血液DNA濃度及純度,得到單個樣品質量濃度大于50 ng/μL,OD260/280為1.8～2.0,表明提取DNA樣本純度高,無污染;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量,條帶清晰、無雜帶,表明提取DNA完整性高,符合后續試驗標準。

2.2 DLK1基因PCR擴增產物

PCR擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1:各泳道電泳條帶清楚,無雜帶,符合其后SSCP電泳檢測標準。

1—9.PCR擴增產物,250 bp;M.DL1000 Marker。

2.3 DLK1基因SSCP檢測

PCR擴增產物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠,在恒溫4 ℃,恒壓180 V電壓下進行SSCP電泳檢測,結果如圖2:DLK1基因共存在3種基因型,將其定義為AA、AB和BB。

圖2 DLK1基因內含子5分型圖

2.4 DLK1基因多態基因型測序

5個綿羊種群DLK1基因不同基因型PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收,送至生物公司進行測序。測序結果如圖3。將標準序列XM_027957404.2與擴增序列進行比對(圖4)發現,在DLK1基因內含子5區域發現突變位點G30412C(G→C)。

圖3 測序峰圖

圖4 PCR擴增產物與GenBank同源序列的比對

2.5 DLK1基因多態位點遺傳特性分析

結合SSCP及測序結果分析,統計出5個綿羊品種突變位點的基因型數量、計算基因型頻率和等位基因頻率,結果見表2。甘肅高山細毛羊、藏綿羊、蒙古羊、灘羊和小尾寒羊AB基因型及B等位基因頻率分別為0.460 0/0.531 4、0.480 0/0.594 4、0.420 0/0.587 4、0.400 0/0.616 5和0.440 0/0.601 5。在5個綿羊品種中,AB基因型均為優勢等位基因型,B均為優勢等位基因,且在5個綿羊群體中均可以檢測到這3種基因型的個體。

表2 綿羊DLK1基因遺傳多態性分析

由表2可知,甘肅高山細毛羊、藏羊、蒙古羊、灘羊和小尾寒羊雜合度和多態信息含量分別為0.464 4/0.385 6,0.445 2/0.379 8,0.414 4/0.365 2,0.367 6/0.356 7和0.431 3/0.369 0,其中甘肅高山細毛羊雜合度最高,灘羊雜合度最低;甘肅高山細毛羊多態信息含量最高,灘羊多態信息含量最低,且5個綿羊品種均表現出中度多態性(0.25

2.6 基因多態性與生長性狀關聯分析

運用SPSS 20.0軟件分析DLK1不同基因型與生長性能之間的相關性,結果如表3?；蛐托@著影響1月齡和3月齡綿羊的體長和胸圍,對綿羊6月齡和9月齡體長、胸圍的影響無統計學意義;1月齡和3月齡BB型綿羊個體體長和胸圍顯著高于AA型個體;總體來說,基因型效應對這5個綿羊品種的體長和胸圍影響顯著,對體高和體質量影響不大。

表3 綿羊DLK1基因不同基因型與生長性狀的相關性分析

3 結論與討論

DLK1首次被發現于神經母細胞瘤中,是人類目前已發現的印跡基因之一,其主要參與編碼糖基化跨膜蛋白,同時還參與脂肪合成[14]。研究表明,DLK1基因在生物體生長發育和組織再生過程中發揮重要作用[15]。徐倩倩等[16]發現,當DLK1在骨骼肌中過表達時,小鼠骨骼肌表現出肥大性狀,表明DLK1基因是否正常表達對肌肉組織發育和發揮功能起重要影響。與正常組織相比,DLK1在多種腫瘤組織中表達量有顯著增高趨勢,表明其對腫瘤的發生和發展起調控作用[17-18],同時DLK1可參與許多細胞的分化調節,其中包括脂肪細胞和血細胞生成調節,以及對創傷起修復作用。

作為一種印記基因,DLK1缺失或高表達都可能引起相關的印記基因疾病,但其致病的具體機制還未得到更加深入的研究[19]。目前,對于DLK1基因的多態性研究分析較多,涉及多個物種,但是在綿羊方面的研究非常少。本試驗中DLK1基因并未檢測到與Freking等[20]試驗相一致的突變結果,可能是由于引種時發生了始祖效應或遺傳漂變,以及受人工選擇的影響。廖紅海等[21]通過熒光定量PCR檢測了山羊不同組織中DLK1基因的表達量,其結果顯示,在山羊不同組織中DLK1基因均有表達,且腎臟組織中表達水平最高,脂肪組織中表達量最低,表明DLK1可能具有抑制脂肪合成的作用。陳付英[22]在南陽黃牛和郟縣紅牛遺傳多態性與生長性狀相關性研究中,對DLK1基因的多態性與生長發育性狀進行相關性分析,發現不同的基因型對牛的生長發育有顯著的影響。李云龍等[23]通過對寧夏灘羊、特克塞爾、薩?？诉@3個綿羊群體進行測序研究發現,其DNA序列共有5個突變位點,分別為第54 507位的G→C突變、第54 553位的T→C突變、第54 592位的 C→T 突變、第54 620 位的C→T突變和第54 638位的T→G 突變。通過與李云龍等[23]的研究序列比對發現,本研究在5個綿羊品種中,DLK1基因第5內含子的第30 412 bp處發現的G→C突變與其在第54 507處發現的G→C突變研究結果一致,且DLK1基因的不同基因型在灘羊的體高、體長和胸圍這3個生產性狀上存在顯著差異與本次研究結果一致。陳付英等[24]對不同品種牛樣本(秦川牛287頭,南陽牛、郟縣牛、晉陽牛、安格斯牛、中國荷斯坦牛、牦牛和水牛各50頭)進行PCR-SSCP和DNA測序分析,結果表明,只在秦川牛DLK1外顯子5位點檢測到2個SSCP基因型,分別為E5-A和E5-B,且E5-A為優勢基因型,通過測序結果分析發現此突變為同義突變,在其他樣本中只檢測到1種SSCP基因型。諸多研究證實,DLK1基因不同基因型和家畜的體長、胸圍有顯著相關性,這與本研究結果相同。因此,DLK1基因可以作為選擇甘肅地方綿羊品種生產性狀的候選標記基因。同時,通過對比分析5個不同品種綿羊的生產性能表明,小尾寒羊在不同月齡的生產性狀均優于其他4個綿羊品種。

本研究通過對比5個不同品種綿羊的DLK1基因發現,DLK1基因在5個綿羊品種中均具有多態性,且在第5內含子區域內發現突變位點G30412C,其對于5個綿羊品種的體長和胸圍具有顯著相關性。以上結果表明,DLK1基因可作為選擇甘肅地方綿羊品種生產性狀的候選基因。