2016—2020年安徽省手足口病相關柯薩奇病毒A組16型分子分型研究

馮明子，傅荔艷，葛盈露，馬婉婉，王鵬，孫永，史永林,

1.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽 合肥 230032；2.安徽省疾病預防控制中心，安徽省公共衛生研究院，安徽省醫療衛生重點?？撇≡⑸锓肿由飳W實驗室

柯薩奇病毒A 組16 型（coxsackievirus A16,CV-A16）是小RNA 病毒科腸道病毒屬的一種，為單正鏈RNA 病毒，基因組全長約7.4 kb，是引發手足口?。╤and, foot and mouth disease, HFMD）的常見病原體之一，于1951 年首次被分離出[1]。按照CV-A16 基因組VP1 區基因序列可將其分為A、B和D 三個基因型，A 基因型的唯一成員是G-10 原型株；而B 基因型分為B1、B2 亞型，B1 亞型進一步分為B1a、B1b 和B1c；D 基因型為新發現型別，比較少見[2-3]。近年來安徽省HFMD 發病水平一直較高，而對HFMD 相關病原學的分子分型研究相對較少[4-5]。本研究收集安徽省各地的HFMD CV-A16核酸陽性咽拭子標本，利用生物信息學和分子遺傳學方法鑒定病毒基因型，并對其VP1區測定的序列進行遺傳進化和氨基酸變異位點分析，為進一步研究疾病分子機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 資料與標本來源 本研究中安徽省2016 年1月—2020 年12 月HFMD 病例信息來源于中國疾病預防控制信息系統傳染病報告管理信息系統。收集安徽省各市（縣、區）2016 年1 月—2020 年12 月HFMD患者CV-A16核酸陽性咽拭子樣本。病例標本采集與實驗室檢測符合《手足口病預防控制指南（2009版）》[6]要求。

1.2 主要試劑與儀器 核酸提取試劑盒（665A，中國臺灣圓點公司）；磁珠法自動核酸提取儀（SLA-32，中國臺灣圓點公司）；熒光定量PCR 擴增儀（Quant-Studio 5,Thermo Fisher）；普通PCR 擴增儀（Mastercycler X50P,Eppendorf）；腸道病毒CV-A16熒光定量PCR檢測試劑盒（P531，西安天隆公司）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver 2.0（RR055A,Takara）。

1.3 核酸抽提與熒光定量PCR 和RT-PCR 取出保存的咽拭子標本在室溫條件下融化，漩渦振蕩混勻后在二級生物安全柜內取200 μL 混勻液抽提病毒RNA，提取步驟按照核酸提取儀操作說明書進行，程序運行完成后吸取核酸洗脫液置-20 ℃備用。采用腸道病毒CV-A16 熒光定量PCR 檢測試劑盒對收集到的HFMD 核酸陽性標本進行檢測，對檢出的CV-A16 陽性標本VP1 區基因序列進行RT-PCR 擴增。CV-A16 VP1 區基因RT-PCR 擴增引物（CV-A16-VP1-S/ CV-A16-VP1-A）參照文獻[7]，RT-PCR 擴增體系25 μL，反應條件：逆轉錄50 ℃30 min，1 個循環；預變性95 ℃15 min，1 個循環；三步循環94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min，40個循環；總延伸72 ℃10 min。PCR 擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離特異性目的條帶。

1.4 基因序列測定與進化分析 將擴增出的陽性PCR 產物送到上海伯杰醫療科技股份有限公司測序，測序結果提交到腸道病毒在線分型網站（https://www.rivm.nl/mpf/typing tool/enterovirus/）進行CVA16 基因型別分析，并同步提交到NCBI 網站進行BLAST 比對。從GenBank 數據庫下載CV-A16 各基因型參考序列，在MEGA 6.0 生物軟件中采用Clustal W 法進行基因序列比對，采用鄰接法（neighbor-joining, NJ）構建CV-A16 VP1 區基因系統進化樹。腸道病毒參考株VP1 區序列分別為U05876、 EU812514、 AM292468、 AM292455、LT577709、 AM292476、 JN248420、 KU596021、KX871389、KX586352、MW197387、MW999272、MW999274、MT553210、MT553192、MT553208、MW197395、LC603085、MT119437、MT553222、MT663414、MZ043547、MZ491035、KM260139、KU595992、KX871449、MH003973、MT119428、MW197293、MW197351、MW462142、KC866888、KP341916。

2 結 果

2.1 HFMD 流行概況 2016—2020 年安徽省累計報告HFMD 實驗室確診病例16 650 例，各年依次為1 057 例、2 955 例、4 202 例、3 962 例、4 474例。腸道病毒A 組71 型（enterovirus A71,EV-A71）共1 296 份（占7.78%）；CV-A16 型共3 809 份（占22.88%）；其他型別共11 545 份（占69.34%）。2016—2020 年CV-A16 在實驗室確診病例中的構成比依次為20.72%（219/1 057）、22.91%（677/2 955）、23.89%（1 004/4 202）、42.58%（1 687/3 962）、4.96%（222/4 474）。見圖1。

圖1 2016—2020年安徽省HFMD實驗室確診病例和CV-A16病例分布情況Figure 1 Monthly reported HFMD cases confirmed via laboratory studies and the proportion of CV-A16 cases in Anhui Province from 2016 to 2020

2.2 測序與基因型別鑒定 共有436 份CV-A16核酸陽性樣本納入研究。經測序后進行比對和同源性分析獲得290 條陽性序列，均為B1 亞型，其中B1a 基因亞型65 株，占22.41%（65/290），B1b 基因亞型225株，占77.59%（225/290）。見表1。

表1 2016—2020年安徽省HFMD CV-A16基因型分布情況Table 1 Distribution of HFMD CV-A16 genotypes in Anhui Province from 2016 to 2020

2.3 同源性比較與進化分析 290 條CV-A16 VP1基因序列核苷酸堿基均為891 個，編碼297 個氨基酸，未見缺失或插入序列；其核苷酸和氨基酸序列同源性為86.80%～100.00%和97.60%～100.00%，與CV-A16原型株（G-10,U05876）核苷酸和氨基酸序列同源性為74.10%～76.80%和90.50%～92.20%；65 條B1a 型VP1 區基因序列與GenBank 數據庫中B1a 參考株（KC866888）核苷酸和氨基酸序列同源性為93.00%～99.90%和98.60%～100.00%，225 條B1b 型VP1 區基因序列與GenBank 數據庫中B1b參考株（KP341916）核苷酸和氨基酸序列同源性為88.40%～99.60%和98.60%～100.00%。

CV-A16 VP1 基因序列親緣性進化樹分析表明，2016—2020 年安徽省CV-A16 流行毒株屬于B基因型B1a 和B1b 基因亞型，未鑒定出其他基因型。進一步分析顯示，CV-A16 B1a 基因亞型流行株在遺傳進化上大致分為Cluster A、Cluster B、Cluster C 和Cluster D 分支簇。見圖2。2017 年阜陽市、2020 年淮南市和合肥市部分B1a 流行株屬于Cluster A 進化分支；2019 年合肥市、宣城市、黃山市、蚌埠市和淮北市B1a 流行株屬于Cluster B 進化分支；2018 年和2020 年合肥市部分B1a 流行株屬于Cluster C進化分支；2016 年安慶市B1a流行株屬于Cluster D 進化分支。Cluster D 分支簇流行株與福建株（KU596021）、山東煙臺株（KX586352）、上海株（KX871389）親緣性關系較近。

圖2 2016—2020年安徽省CV-A16 VP1區基因進化樹Figure 2 Phylogenetic tree of VP1 gene sequences of CVA16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020

2016—2020年鑒定出的CV-A16 B1b基因亞型流行株在遺傳進化上大致分為6 個分支簇（ClusterⅠ～Ⅵ），見圖2。2016 年阜陽市、合肥市，2017 年宣城市、安慶市、滁州市，2018 年蚌埠市、銅陵市，2019 年合肥市、宣城市的B1b 流行株屬于ClusterⅠ進化分支；2017 年淮北市和阜陽市，2018 年合肥市和蚌埠市B1b 流行株屬于Cluster Ⅱ進化分支；2016 年安慶市和阜陽市B1b 流行株屬于Cluster Ⅲ進化分支；2016 年合肥市和阜陽市，2017 年合肥市、宣城市、安慶市和滁州市，2018 年銅陵市，2019年宣城市和銅陵市部分流行株屬于Cluster Ⅳ進化分支；2016 年阜陽市、安慶市，2017 年滁州市、阜陽市、合肥市和2019 年合肥市部分流行株屬于Cluster Ⅴ進化分支；2016 年安慶市、2017 年合肥市、2018年銅陵市部分流行株屬于Cluster Ⅵ進化分支。

2.4 VP1 區氨基酸變異位點分布情況 2016—2020 年CV-A16 型VP1 基因序列與CV-A16 原型株（G-10, U05876）進行氨基酸變異情況分析發現，290 條序列VP1 區297 個氨基酸編碼位點中有20個發生變異，見表2。2016 年安徽省檢出的60 株CV-A16 B1a 和B1b 流行株VP1 區有21 個氨基酸編碼位點發生變異，比表2 中多了1 個變異位點（VP1-A11T）；2018 年和2019 年共檢出的147 株B1a 和B1b CV-A16 流行株，VP1 區有21 個氨基酸編碼位點發生變異，比表2 中多了1 個變異位點（VP1-P215L）。本研究發現2016—2020 年安徽省225株B1b CV-A16毒株中有181株VP1區第14個氨基酸編碼位點出現變異（S14N），占80.44%（181/225）;205 株VP1 區第23 個氨基酸編碼位點出現變異（L23M），占91.11%（205/225），在B1a CV-A16 毒株中未見變異。

表2 2016—2020年安徽省CV-A16 VP1區氨基酸位點變異情況Table 2 Amino acid site variation in VP1 region of CV-A16 strains in Anhui Province from 2016 to 2020

3 討 論

HFMD 的主要表現是患者手、足和口腔皮膚或黏膜皮損，前驅癥狀多為發燒、上呼吸道不適[8]。1981 年上海報告我國首例HFMD 病例，此后至2007 年HFMD 在我國的流行表現為局部地區小規模暴發，重癥和死亡病例少見；2007 年后HFMD 局部地區出現較大規模暴發，重癥和死亡病例數呈升高趨勢[9]。2008—2017 年安徽省共報告HFMD 病例930 613 例，其中重癥病例4 738 例，在全國排名第11 位；死亡病例147 例，在全國排名第9 位[5,10]。有研究表明，2017—2018年安徽省HFMD CV-A6實驗室確診病例數較以往有升高趨勢，且病原譜發生變化，可能與EV-A71滅活疫苗的接種數量有關[11]。

既往研究表明，1999—2008 年我國流行的CVA16 毒株都屬于B1a 和B1b 基因亞型，在2008 年之后出現B1c 基因亞型，但B1b 基因亞型始終處于優勢地位[12-14]。B1a 分支毒株最早于1995 年在日本被發現，隨后在我國、馬來西亞和泰國成為CV-A16主要流行株[15]。近年來，CV-A16 B1 基因亞型成為我國主要流行株，也是安徽省的優勢流行株，以CV-A16 B1b 分支為優勢基因型，B1a 分支與其共同流行及進化循環[7,16]。本研究結果顯示，2016—2020年安徽省B1b基因亞型分支成為優勢流行株，這與安徽省先前有關CV-A16 毒株分子遺傳進化分析的情況基本一致[7,16]。

對2016—2020 年安徽省CV-A16 流行株序列基因型別的占比進行分析發現，2016—2018 年CVA16 B1b 基因亞型占比均超過90%；而2019 年CVA16 B1a 基因亞型毒株所占比例與同年CV-A16 B1b 比例接近；2020 年CV-A16 B1a 基因亞型毒株所占比例明顯高于CV-A16 B1b，占比近90%。這可能提示安徽省HFMD CV-A16 流行株基因亞型有改變的趨勢，待后續的監測數據證實。從進化樹聚類結果看，安徽省CV-A16 B1a Cluster D 分支簇流行株與部分周邊城市親緣關系較近，提示安徽省HFMD CV-A16 B1a 流行株在演變過程中可能與周邊區域流行株共同循環和進化。此外，安徽省290株CV-A16 毒株VP1 區氨基酸序列變異分析發現，5 年中290 株CV-A16 序列中有288 株病毒在VP1區13 位上由蘇氨酸替換為天冬酰胺，但2019 年的2 株B1b 基因亞型毒株（19BB002- 2019013b、19BB004-2019015b）在13 位上由蘇氨酸替換為絲氨酸，是否提示安徽省CV-A16 B1b 基因亞型在循環進化中演變成新的分支有待后續研究證實。

本研究證實了HFMD CV-A16 腸道病毒B1a 和B1b 兩種基因亞型在安徽省共同存在，且B1 毒株流行的優勢基因型別發生了變化，為完善安徽省手足口病病原譜分子進化資料以及疾病防控提供了科學參考。但本研究收集到的手足口病患兒咽拭子樣本均來自輕癥病例，無重癥病例標本，且2020年受新冠病毒感染疫情影響收集到的標本數量較少，可能會導致本研究結果存在一定局限性。

利益沖突聲明全部作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明馮明子負責樣本收集與整理、實驗室檢測、論文撰寫；傅荔艷、葛盈露、王鵬參與實驗室檢測；馬婉婉負責數據整理和分析；孫永、史永林負責研究設計、論文撰寫指導