弓形蟲ROP5與ROP18的雙基因缺失株構建及表型鑒定

陳 蕓，劉 旗，張曼玉，耿小玲，蔣 蔚，王 權

（中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241）

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii,T.gondii）為一種專性胞內寄生的頂復門原蟲，可感染幾乎所有溫血動物的有核細胞[1]。全世界大約三分之一的人口感染了弓形蟲[2]。流行病學調查顯示，我國的弓形蟲感染率為7.9%，低于世界平均水平，但呈現逐年上升的趨勢[3]。弓形蟲主要有三種感染途徑：經口感染，經血液感染及先天性感染[4]。當機體感染弓形蟲后，通常表現為隱性感染，但免疫力低下者（如艾滋病患者、惡性腫瘤患者、服用免疫抑制藥物的患者等）感染弓形蟲后會導致全身急性感染，嚴重時可導致死亡。此外，孕期感染弓形蟲可導致流產、畸胎以及新生兒先天性弓形蟲病等[5]。在畜牧業生產上，弓形蟲可感染多種家畜，影響其生長發育與繁殖，并導致肉/奶產品質量下降，直接或間接帶來巨大的經濟損失，且食用被感染動物的肉制品或奶制品，也可將弓形蟲傳播給人類，嚴重威脅人類健康[6]。

弓形蟲危害嚴重與其具有逃逸宿主的天然免疫的功能相關[7]。棒狀體蛋白（rhoptries,ROPs）在入侵宿主過程中由弓形蟲棒狀體分泌，經蟲體頂端釋放至納蟲泡（parasitophorous vacuole,PV）或者宿主細胞胞質中，主要參與調節蟲體入侵，增殖及PV形成等[8]。ROP18是一種高度多態性的棒狀蛋白激酶，具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結構[9]，能特異性結合宿主細胞內的免疫相關GTP酶（immunityrelated GTPases,IRGs），主要磷酸化IRGs中的Irga6的第102位、108位蘇氨酸，防止Irga6在納蟲泡膜上積累并破壞納蟲泡的完整性[10]。此外，ROP18還可以靶向激活轉錄因子（activating transcription factor 6 beta,ATF6-β），導致其降解，從而干擾ATF6-β相關的免疫反應[11]，還可抑制宿主的NF-κB信號通路[12]。近年來還發現弓形蟲ROP18可通過線粒體凋亡途徑抑制宿主細胞凋亡，維持線粒體膜電位和完整性，阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中[13-14]。ROP5是由一組串聯的、重復的高度多態性基因組成的假激酶[15]，與ROP18協同作用可增加ROP18的磷酸化活性[16]。此外，ROP5也可直接與納蟲泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）上的IRGs結合，當弓形蟲缺乏ROP18基因時，ROP5在逃逸宿主免疫方面發揮重要作用[17]。此外，Zheng等[18]發現ROP5的重組蛋白疫苗可以誘導細胞和體液（Th1/Th2）免疫應答，延長感染RH株小鼠的存活時間。Yuan等[19]研究發現ROP18核酸疫苗可增強昆明鼠對弓形蟲特異性Th1型應答，并顯著延長小鼠的存活時間。

上述表明ROP5、ROP18均為弓形蟲重要的毒力因子，具有調節宿主天然免疫反應的功能，可能還具有其他尚待發現的功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因敲除技術構建弓形蟲RH株ROP5的單基因缺失株，并在此基礎上構建ROP5與ROP18的雙基因缺失株，為進一步研究ROP5與ROP18的作用機制及基因缺失弱毒株疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、蟲株、質粒與小鼠 Vero細胞由本實驗室液氮保存，復蘇后培養于含10%胎牛血清的完全培養基；弓形蟲RH株由本實驗保存；弓形蟲ROP18缺失株（ROP18-KO）由本實驗前期試驗構建并保存于液氮中；質粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT與質粒pDHFR:UPRT-D為本實驗室保存；pCas9-CAT質粒（Addgene,cat.no.80323）購自addgene；大腸桿菌TOP10感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；清潔級雌性昆明鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養基、PBS、胰酶均購自Gibco公司；胎牛血清購自BI公司；基因組DNA提取試劑盒購自北京賽百盛基因技術有限公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Phanta Max Super-Fidelity與ClonExpress MultiS One step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；結晶紫染色液購自碧云天生物技術公司；CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.3 CRISPR/Cas9基因敲除質粒和同源重組質粒的構建及鑒定 根據NCBI在線數據庫獲取弓形蟲RH株ROP5基因全長序列（GenBank：HQ916455.1），利用CRISPR/Cas9基因敲除系統在線網站（http://crispr.mit.edu）設計ROP5的sgRNA引物，選取得分較高的sgRNA序列，并將sgRNA引物送金唯智公司合成。以pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT質粒為模板，將pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT質粒以3個片段的形式擴增（引物見表1），并將質粒中的sgRNA序列替換為ROP5的sgRNA序列。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收純化，再通過ClonExpress MuLtiS One step Cloning Kit進行連接。將同源重組后的產物轉化至TOP10感受態細胞，再涂布于含有氨芐青霉素（Ampicillin,AMP）的固體培養基上，篩選單克隆菌落，并進行菌液PCR鑒定，擴增產物送至擎科生物科技有限公司測序。以pUPRT::DHFR-D質粒為模板，擴增pROP5::DHFR-D質粒骨架部分及DHFR抗性基因部分，以RH株DNA為模板擴增ROP5的5'UTR及3'UTR片段，并通過ClonExpress MuLtiS One step Cloning Kit進行連接，構建pROP5::DHFR-D質粒（引物見表2），轉化至TOP10感受態細胞，挑取單菌落進行菌液PCR鑒定，分別擴增5'UTR與DHFR片段連接處，3'UTR與DHFR片段連接處、驗證質粒是否構建成功，引物見表3。以相同方法構建pROP18::CAT-D質粒，其中以pCas9/CAT質粒為模板，擴增氯霉素抗性基因（CAT）。

表1 構建pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5的引物Table 1 The primers for construction of pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5

表2 構建pROP5::DHFR-D的引物Table 2 The primers for construction of pROP5::DHFR-D

表3 驗證pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5與pROP5::DHFR-D的引物Table 3 The primers for identification of pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5 and pROP5::DHFR-D

1.4ROP5缺失株的構建及驗證 收集新鮮逸出的RH株速殖子，經孔徑為5 μm的濾器過濾純化后，用電轉液Cytomix洗滌兩遍并重懸蟲體。將質粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5和pROP5::DHFR-D各30 μg（1∶1的比例）加入至1×107個純化后的弓形蟲RH株中，再加入一定量的電轉液，使最終體積為300 μL，混勻后加入至2 mm間距的電擊杯中，用Gene Pulser Xcell電穿孔系統（Bio-rad伯樂）按照以下參數電轉：電壓為1500 V，電容為25 μF，電阻為50 ?。電轉后的蟲體轉移至長滿80%Vero細胞的6孔板中繼續培養。培養48 h后，將培養基更換為含有3 μmol/L息瘧定的培養基，對弓形蟲進行藥物篩選，并將繼續增殖的弓形蟲轉移至含80%Vero細胞的96孔板中進行單克隆篩選，連續篩選3代后，擴大培養單克隆蟲株，并進行PCR驗證，引物見表4。

表4 用于鑒定ROP5-KO株和ROP5/ROP18-KO株的引物Table 4 The primers for identification of ROP5-KO strain and ROP5/ROP18-KO strain

1.5ROP5與ROP18雙基因缺失株的構建及驗證 將pSAG1:CAS9::TgU6:ROP18質粒和pROP18::CAT-D質粒各30 μg（1∶1的比例）加入至1×107個純化的ROP5-KO弓形蟲懸液中，總體積為300 μL，充分混勻后加入至間距為2 mm的電轉杯，電轉條件與參數同上，電轉后繼續放置于含Vero細胞的6孔板中培養，并用40 μmol/L的氯霉素進行藥物篩選，再在96孔板中進行3次亞克隆。篩選后的單克隆蟲株在6孔板中繼續擴大培養后，提取基因組DNA，擴增ROP5基因片段及ROP18基因片段，驗證雙基因缺失株是否構建成功（引物見表4）。

1.6 入侵試驗 將RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株、ROP5/ROP18-KO株用CFDA SE標記（具體試驗步驟見說明書），標記完成后，將各蟲株加入至含90%Vero細胞的6孔板中，每孔接種1×106個CFDA SE標記的弓形蟲速殖子，37℃培養2 h后，PBS清洗未入侵Vero細胞的速殖子，繼續培養12 h，細胞經胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM完全培養基重懸，用Beckman Coulter Cytomics FC 500流式細胞儀檢測弓形蟲入侵Vero細胞的入侵率。

1.7 弓形蟲增殖試驗 將每種蟲株（各5×105個速殖子）分別接種于含Vero細胞的6孔板中，每個蟲株設3個重復孔。37℃培養12 h 后，PBS清洗除去未入侵細胞的蟲體，并加入新鮮的含2%FBS的DMEM繼續培養24 h，顯微鏡下計數100個假包囊，并統計每個假包囊中含有的速殖子個數。

1.8 噬斑試驗 分別將RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株及ROP5/ROP18-KO株的速殖子（500個）接種于Vero細胞，繼續培養7 d后，用PBS洗滌兩遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用結晶紫室溫染色20 min，PBS洗去殘留的結晶紫后，顯微鏡下觀察各種蟲株所形成的空斑大小。

1.9 對小鼠的毒力試驗 本試驗選取6～8周齡雌性昆明鼠作為試驗動物，試驗分4組，每組10只昆明鼠，分別接種0.5 mL生理鹽水（對照組）、RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株、ROP5/ROP18-KO株各1000個速殖子，記錄并統計各組小鼠的死亡時間及死亡只數。

1.10 數據統計 采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析。如果與對照組有差異再對不同試驗組進行方法分析，結果用平均值±標準差（±SD）表示。

2 結果

2.1 pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質粒與pROP5::DHFR-D質粒的構建及驗證 利用NCBI在線數據庫查詢弓形蟲ROP5基因序列信息，可知ROP5基因具有三個亞型，分別是ROP5A（GenBank:HQ916451.1），ROP5B（GenBank: HQ916448.1），ROP5C（GenBank: HQ916455.1）。本實驗首先以RH株DNA為模板，擴增ROP5基因全長并測序，經BLAST對比得知，所擴增的ROP5基因與ROP5B、ROP5C的相似性均99%。將pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT經3個片段擴增（圖1A），并將UPRT的sgRNA替換成ROP5的sgRNA，環化連接構建pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質粒，經PCR擴增含sgRNA片段并測序（圖1B）。為了構建同源重組質粒，以弓形蟲基因組DNA為模板，擴增ROP5的5'UTR、3'UTR，以pUPRT::DHFR-D質粒為模板擴增質粒骨架片段及DHFR抗性基因片段（圖1C），連接成功后，對質粒進行PCR鑒定（圖1D）。結果顯示，用于敲除的兩個質粒均構建成功。

圖1 pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質粒與pROP5::DHFR-D質粒的構建及驗證Fig.1 Construction and verification of pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5 and pROP5::DHFR-D

2.2ROP5基因敲除株的篩選與鑒定 將pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質粒和pROP5::DHFR-D質粒同時轉染至弓形蟲RH株速殖子中并經息瘧定篩選，獲得單克隆蟲株。提取弓形蟲DNA進行PCR鑒定，同時以RH株為對照。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳的結果表明，以RH株DNA為模板擴增出ROP5基因的901 bp，且條帶單一，但ROP5缺失株中無條帶。此外，ROP5-KO株擴增出5'UTR與DHFR片段連接處1113 bp片段，3'UTR與DHFR片段連接處1470 bp片段，說明DHFR基因已重組至ROP5靶基因處，說明ROP5-KO株構建成功（圖2）。

圖2 ROP5基因缺失株的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of ROP5-KO strain

2.3ROP5/ROP18雙基因缺失株的篩選及鑒定 本實驗室在前期研究中已成功構建pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP18質粒和pROP18::CAT-D質粒。將兩個質粒同時電轉至構建成功的ROP5-KO株速殖子中，并通過40 μmol/L的氯霉素篩選。單克隆蟲株擴大培養后提取基因組DNA進行PCR鑒定，同時以RH株為對照。結果顯示，RH株中存在ROP5及ROP8基因，而基因缺失蟲株中無條帶，說明ROP5與ROP18的雙基因缺失株構建成功（圖3）。

圖3 ROP5/ROP18雙基因缺失株的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of ROP5/ROP18-KO strain

2.4 體外入侵及增殖試驗 為了研究ROP5-KO株和ROP5/ROP18-KO株的表型變化，我們評估了ROP5-KO株和ROP5/ROP18-KO株的入侵能力、增殖能力。通過流式細胞儀分析可以得出（圖4），RH株對Vero細胞的感染率為43.7%，而ROP5-KO株的感染率為34.8%，ROP18-KO株的感染率為29.3%，ROP5/ROP18-KO株的感染率為26.8%，說明缺失ROP5基因和ROP18基因均可導致弓形蟲體外入侵細胞的能力降低。同時缺失ROP5及ROP18基因后，弓形蟲的入侵能力明顯低于RH株，也低于ROP5-KO株及ROP18-KO株。增殖試驗結果可以看出，入侵36 h后，RH株假包囊中多為16個速殖子，而ROP5-KO株和ROP18-KO株，ROP5/ROP18-KO株中多為8個速殖子，且雙缺失蟲株的含16個速殖子的假包囊個數顯著少于兩種單基因缺失株，說明ROP5與ROP18雙基因缺失后，顯著降低弓形蟲的增殖速率（圖5）。

圖4 流式細胞儀測弓形蟲的入侵率Fig.4 Detection of T.gondii invasion rate by flow cytometry

圖5 體外增殖試驗Fig.5 Proliferation experiment in vitro

2.5 噬斑試驗 噬斑試驗的結果同樣可以看出，連續培養7 d后，ROP5-KO株、ROP18-KO株和ROP5/ROP18-KO株所形成的空斑面積小于RH株，且ROP5/ROP18-KO株所形成的空斑面積最?。▓D6）。說明ROP5與ROP18雙基因缺失后，速殖子的生存能力降低，與體外入侵及增殖能力的試驗結果一致。

圖6 噬斑試驗Fig.6 Plaque assay

2.6 小鼠毒力試驗 將RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株和ROP5/ROP18-KO株分別對昆明鼠進行腹腔接種，接種劑量為1×103個，記錄各組昆明鼠的死亡時間。結果表明：RH株感染小鼠后，小鼠在第7 d全部死亡，但接種ROP5-KO株和ROP18-KO后，小鼠的存活時間均延長，且接種ROP5/ROP18-KO株后，小鼠的平均存活時間延長至9 d，說明當兩者同時敲除后，可顯著降低弓形蟲的毒力（圖7）。

圖7 缺失株對小鼠存活時間的影響Fig.7 Effects of mutant strains on the survival time of mice

3 討論

CRISPR/Cas9系統是由CRISPR 序列元件與Cas9基因組成，然后通過一段序列特異性的guide-RNA分子引導核酸內切酶（Cas9）到特異靶點，從而定向完成基因組的編輯[20]。目前，CRISPR/Cas9基因敲除技術已成功應用于瘧原蟲[21]、利什曼原蟲[22]、弓形蟲[23-25]等多種寄生蟲，提高了對寄生蟲基因的編輯效率，有助于功能基因的分析及疫苗候選分子的篩選等。隨著敲除技術的不斷發展，針對單個sgRNA難以剪切的基因，可通過改造pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT質粒，設計針對目的基因上下游的兩個sgRNA，從而完成對整個目的基因片段進行剪切，提高基因敲除效率[26]。此外，為了進一步探索兩個基因的協同作用，可構建針對目的基因的雙基因缺失株，用不同的藥物對陽性蟲株進行篩選。目前已發現可用于弓形蟲陽性篩選的藥物有息瘧定、氯霉素、霉酚酸等，用于陰性篩選的藥物有5-氟尿嘧啶脫氧核苷（5-fluorodeoxyuracil）、6-硫黃嘌呤（6- thioxanthine）等。此外，Long等[27]還對基因敲除質粒進行改造，加入熒光標簽蛋白（GFP和mCherry），通過熒光顯微鏡篩選陽性蟲株。為了更利于探索弓形蟲各基因之間的相互作用，CRISPR/Cas9技術的不斷優化和升級，提高了基因編輯的效率及應用范圍，促進對弓形蟲各基因作用機制的研究，加快了對弓形蟲特異性疫苗的研究。

本試驗通過息瘧定與氯霉素這兩種藥物對弓形蟲缺失株進行陽性篩選，并成功構建了ROP5-KO株及ROP5/ROP18-KO株。表型試驗結果表明，與RH相比，ROP5基因和ROP18基因單獨缺失后，弓形蟲的入侵及增殖能力、對小鼠毒力等方面均有明顯下降，且ROP5/ROP18-KO株的入侵及增殖能力降低更為顯著，且對小鼠毒力明顯降低。在早期研究中，Fox等[28]對Ⅱ型弓形蟲的多個ROP基因進行敲除，并發現ROP5和ROP18基因缺失后顯著降低弓形蟲對IRGs的抵抗力，并增加小鼠的存活率，說明ROP5和ROP18都是Ⅱ型弓形蟲重要的毒力基因。本實驗結果證明敲除RH株ROP5與ROP18后同樣會導致RH株毒力降低，但RH株為強毒株，缺失株感染只延長了小鼠的存活時間，不能阻止小鼠死亡。Michael等[29]通過對Ⅱ型蟲株ME49和強毒蟲株VAND株進行基因比對，發現ROP5是導致強毒株和Ⅱ型蟲株差異的主要毒力因子，且缺失ROP5基因可導致VAND蟲株毒力顯著減弱。Saeij等[30]也發現ROP18對小鼠毒力的差異主要表現在其表達水平不同，ROP18在Ⅰ型與Ⅱ型蟲株體內表達量高，而在Ⅲ型蟲株體內表達量低，當Ⅲ型蟲株過表達ROP18Ⅰ或者ROP18Ⅱ，可恢復弓形蟲對小鼠的毒力，說明ROP5與ROP18都是弓形蟲重要的毒力因子。

目前，對弓形蟲ROP5及ROP18的研究主要集中在IRGs方面。當弓形蟲入侵宿主細胞時，宿主天然免疫系統發揮作用，產生大量的IFN-γ[31]，IFN-γ進一步通過多種作用途徑抑制弓形蟲增殖并殺滅弓形蟲[32-33]。IRGs可以聚集于納蟲泡膜表面，導致納蟲泡膜變形、穿孔甚至破裂，是宿主細胞抵抗胞內弓形蟲的主要作用之一[34]，一旦納蟲泡膜損壞，弓形蟲將容易被宿主細胞細胞質溶解，從而清除弓形蟲[35]。Zhao等[36]研究發現強毒株可以抵抗IRGs在PVM上聚集，從而避免被清除，中等毒力的Ⅱ型和無毒力的Ⅲ型寄生蟲不能阻止IRGs的招募。造成這一顯著差異的主要原因是不同蟲株的ROP18和ROP5基因序列存在差異[37]。ROP18對阻止IRGs在納蟲泡上裝配等方面發揮重要作用[38]，它可磷酸化宿主Irga6核苷酸結合區域的兩個蘇氨酸，導致GTPase失去生物活性，抑制其在弓形蟲空泡膜上的積累。ROP5在阻斷IRG介導的免疫清除方面與ROP18具有協同作用[39]。此外，在缺乏ROP18時，ROP5可直接作用于IRGs，減少IRGs在PVM上富集[17]。

除了在抵抗IRGs方面發揮重要作用外，ROP5和ROP18還能抑制MHC-I對弓形蟲抗原的遞呈、減少CD8+T細胞識別和清除弓形蟲[40]。此外，ROP18具有抑制宿主細胞凋亡的作用[14]。由此猜測這兩者可能在其他方面也具有協同作用。構建ROP5與ROP18的雙缺失株可為進一步研究兩者的功能奠定基礎。