湖北省鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

朱玲玲，孫敏華，胡 怡，汪 婷，徐 歡，汪 威，殷世彬，汪招雄

（1.長江大學動物科學學院，荊州 434025；2.廣東省農業科學院獸醫研究所，廣州 510640）

鴨傳染性漿膜炎（infectious serositis of duck）是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer,RA）感染鴨引起的一種高度接觸性敗血性傳染病[1-2]。該病多見于1～8周齡雛鴨，發病率和死亡率都非常高，其特征癥狀為肝周炎、纖維素性心包炎、腦膜炎和氣囊炎，是當前嚴重危害養鴨業的細菌性傳染病之一，每年給我國養鴨業造成嚴重的經濟損失[3-4]。在生產實踐中由于抗生素的長期大量使用，越來越多的RA表現出耐藥性，其耐藥譜廣泛且不同的菌株耐藥性存在極大的差異[5]。目前已對RA檢測到氯霉素、氟苯尼考、紅霉素等抗生素的耐藥基因，耐藥株的廣泛出現，嚴重影響了抗生素防治該病的臨床效果[6-7]。

本試驗從湖北不同地區規?；唸霾杉锁唫魅拘詽{膜炎疑似病例肝臟，分離鑒定了34株RA菌株，并對菌株進行了耐藥譜分析，測定了氟苯尼考flor基因，為今后湖北省RA的藥物防控提供了近期的實驗數據，為flor耐藥性機制的研究奠定了良好基礎。

1 材料和方法

1.1 病料和主要試劑 從湖北荊州、潛江、荊門等地多個患病鴨場采集疑似鴨傳染性漿膜炎肝臟，病鴨均表現神經癥狀，解剖可見典型的纖維性心包膜炎、肝周炎等病理變化。胰蛋白酶大豆瓊脂培養基（TSA）和胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）均購自美國BD Bifco公司；藥敏片購自中國藥物研究所。

1.2 引物的設計與合成 根據RAOmpA基因序列設計特異性檢測引物，RA-OmpA-F為ATGTTG ATGACTGGACTTGGT，RA-OmpA-R為CTTCAC TACTGGAAGGTCAGA，擴增片段長度為1119 bp；根據RAflor基因序列設計特異性檢測引物，上游引物flor-F為ATGACCACCACACGC，下游引物為RAOmpA-R為TTAGACGACTGGCGACT，擴增片段長度為1215 bp。引物序列均由華大基因有限公司合成。

1.3 細菌的分離 無菌采集鴨傳染性漿膜炎疑似病例肝臟，在TSA培養基上劃線接種，37℃培養24～48 h，挑取單菌落于TSB中，37℃振蕩培養16～40 h。

1.4 細菌革蘭氏染色 挑取純化過的單菌落，涂抹于干凈的載玻片，用細菌革蘭氏染色法進行染色，在油鏡下觀察其形態特征。

1.5 生化試驗 對分離細菌進行葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露醇和山梨醇，靛基質、VP試驗、硝酸鹽還原、硫化氫產生、甲基紅、觸酶、氧化酶等試驗。

1.6 RA的PCR鑒定 取50 μL菌液在沸水中煮5 min作為模板備用，構建20 μL PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反應條件：94℃預變性8 min；94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30個循環；72℃終延伸1 min。PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像下觀察。

1.7 藥敏試驗 取200 μL菌液均勻涂布于TSA平板上，待菌液吸收后，在平皿上均勻貼上藥敏紙片，37℃培養16 h，測量、記錄結果。

1.8 RA氟苯尼考耐藥基因PCR鑒定 取50 μL菌液在沸水中煮5 min作為模板備用，構建20 μL PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反應條件：94℃預變性8 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30個循環；72℃終延伸1 min。PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像下觀察。

2 結果

2.1 鴨疫里默氏桿菌培養特性 分離的菌株在普通培養基和麥康凱培養基上不能生長，TSA培養基上生長旺盛，菌落為白色圓形，大小1～2 mm，表面光滑。在含有胰蛋白酵母的肉湯中37℃培養48 h后，培養基中呈現輕微渾濁現象，管底出現少量沉淀。

2.2 形態及染色 革蘭氏染色可見分離菌株呈現典型的兩極著色紅色短小桿菌。多數單個存在，少數成雙或短鏈排列（圖1）。

圖1 RA革蘭氏染色形態特征Fig.1 Morphological characteristics of RA

圖2 RA OmpA基因 PCR檢測結果Fig.2 The detection of RA OmpA gene by PCR

圖3 RA氟苯尼考flor基因PCR鑒定結果Fig.3 PCR identification of flor gene in RA

2.3 分離菌株的生化鑒定 對分離菌株進行生化試驗，結果表明34株分離菌株不發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇。枸櫞酸鹽、甲基紅試驗、VP試驗均為陰性，氧化酶、尿素反應為陽性。

2.4 分離菌株特異性PCR鑒定 34株菌株PCR擴增產物菌呈現特異性條帶，大小與目的基因片段一致。將PCR膠回收產物送至擎科生物科技有限公司測序，測序結果經NCBI數據庫比對，與RA的OmpA基因序列同源性高達99%。

2.5 RA耐藥性分析 藥敏試驗顯示，34株分離株耐藥性較強，對頭孢噻肟、大觀霉素和阿米卡星敏感性比較高，對新霉素和諾氟沙星耐藥性最強，對氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、環丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、多西環素的耐藥性介于二者之間。

表1 34株鴨疫里默氏桿菌對12種抗生素耐藥性分析Table 1 Drug resistance of 34 strains of Riemerella anatipestifer to 12 antibiotics

2.6 RA氟苯尼考flor基因的PCR鑒定及序列分析 對34株RA進行氟苯尼考耐藥基因flor、fexA、fexAv、fexB、cfr進行PCR測定，結果只有flor基因顯示目的條帶，其他基因均不顯示。其中16株RA擴增出與目的片段大小一致的特異性片段，膠回收產物送至擎生物科技有限公司測序，所得序列與flor全基因序列比對，相似性高達100%。

3 討論

本研究從湖北省鴨場采集了鴨傳染性漿膜炎疑似感染鴨病料，分離和鑒定了34株鴨疫里默氏桿菌。藥物敏感性試驗表明，34株分離株耐藥性普遍較強，耐藥譜較廣，很多分離的菌株對3種以上的抗生素產生了耐性性。對12種抗生素耐藥性比較分析顯示，頭孢噻肟、大觀霉素和阿米卡星對大部分分離菌株比較敏感，但是分離菌株對新霉素和諾氟沙星耐藥性最強，超過三分之二的菌株產生了耐藥性，對氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、環丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、多西環素的耐藥性介于兩者之間。對耐藥性統計表明在臨床上用于治療RA的常規藥物品種有限，有些藥物在較低的濃度下基本上失去作用，預示著加大了臨床藥物防治該病的難度，穿梭用藥、聯合用藥以及使用高成本藥物勢必會增加養殖成本，將進一步提高RA對少數品種藥物耐藥性的風險[8-11]。

氯霉素類藥物具有抗菌譜廣、吸收快的特點，廣泛分布于體內，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都是該類藥物里的經典藥物等。氟苯尼考價格低廉，近些年在鴨場被廣泛用來防控RA，近年來分離出來的具有氟苯尼考抗性的RA比例逐漸增加，呈現越來越廣泛的趨勢[12-13]。本研究在藥物敏感試驗的基礎上，對34株分離株測定了氟苯尼考flor基因，發現其中16株分離株攜帶該基因，進一步驗證了RA對氟苯尼考耐藥的廣泛性和嚴重性。