鴨坦布蘇病毒E蛋白生物信息學分析

胡 怡，徐 歡，杜志強，朱玲玲，汪 婷，殷世彬，汪 威，汪招雄

（長江大學動物科學學院，荊州 434025）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）是一種能引起蛋鴨產蛋量下降，卵泡膜出血的單股正鏈RNA病毒[1]。自2010年開始，國內部分鴨場陸續暴發了鴨坦布蘇病毒病，給我國養鴨業造成了巨大的經濟損失。DTMUV是黃病毒科黃病毒屬成員，能感染鴨、雞、鵝、鴿子等[2]。Tang等[3]在鴨場員工血清中檢測到了DTMUV抗體，表明其對人具有潛在威脅性。該病毒的開放性閱讀框（open reading frame,ORF），編碼產生了一個長為3425個氨基酸的多肽，在宿主和病毒蛋白酶的作用下，水解為C、prM、E、NS1、NS2A、NS3、NS4A和NS5蛋白。其中C、prM、E蛋白為該病毒的結構蛋白，其他為非結構蛋白[4]。

DTMUV的E蛋白是重要的免疫原性蛋白，能誘導機體產生中和抗體[5]，是研究亞單位疫苗的重要蛋白。研究結果表明，E蛋白在病毒的組織嗜性、神經毒性、介導病毒與細胞膜融合以及致病力等方面有著重要的作用[6-7]。通過對E蛋白進行生物信息學分析，其研究結果將為亞單位疫苗的研發，基因功能的研究提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 毒株DTMUV E基因序列由本實驗室分離病毒測序，由NovoPro軟件將其翻譯成氨基酸序列。

1.2 DTMUV E蛋白的理化性質分析 利用Protparam（https://web.expasy.org/protparam）分析DTMUV E蛋白的相對分子質量、理論等電點、不穩定指數等理化性質。

1.3 DTMUV E蛋白的親疏水性分析 利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線軟件對DTMUV E蛋白進行親疏水性分析。

1.4 DTMUV E蛋白的跨膜區分析 利用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/-TMHMM/）分析DTMUV E蛋白的跨膜區。

1.5 DTMUV E蛋白的信號肽分析 利用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析DTMUV E蛋白的信號肽。

1.6 DTMU E蛋白的亞細胞定位預測 利用Virus-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.etu.cn/bioinf/vir-us-multi/）預測DTMUV E蛋白的亞細胞定位。

1.7 DTMUV E蛋白的二級結構預測 利用SOPMA（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/login/SO-PMA）預測DTMUV E蛋白的二級結構，分析其無規律卷曲、α-螺旋、β-轉角和延伸鏈的比例。

1.8 DTMUV E蛋白的三級結構預測 利用Phyre 2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre）在線軟件預測DTMUV E蛋白的三級結構，運用c5wsnC模型來進行預測。

1.9 DTMUV E蛋白的翻譯后修飾位點預測分析 分別利用NetNGlyc 1.0 Server（http://www.c-bs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、NetAcet 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/）和NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測分析DTMUV E蛋白的糖基化、乙?；土姿峄揎椢稽c（閾值都為0.5）。

1.10 DTMUV E蛋白的潛在抗原表位分析 利用Predicting Anti-genic Peptides（http://imed.me--d.ucm.es/Tools/antigenic.pl）在線軟件對DTMUV E蛋白的抗原決定簇進行預測分析（閾值為0.5）。利用IEDB（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）對DTMUV E蛋白的B細胞抗原表位進行預測分析（閾值為0.35）。利用NetMHCⅡpan 3.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-MHCⅡpan）對DTMUV E蛋白的T細胞抗原表位進行預測分析。選取HLA_DRB1_0101、HLA_DRB1_0301、HLA_DRB1_0401、HLA_DRB1_0701、HLA_DRB1_0801、HLA_DRB--1_0901、HLA_DRB1_1001、HLA_DRB1_1201、HLA_DRB1_1301、HLA_DRB1_1401、HLA_DRB1_1501、HLA_DRB1_1601亞型為限定條件。

2 結果

2.1 DTMUV E蛋白的理化性質分析結果 DTMUV E蛋白的分子式為C2405H3757N649O723S32，相對分子質量為54357.12。DTMUV E蛋白由501個氨基酸組成，其中包含了20種氨基酸，氨基酸的組成及比例見圖1。E蛋白的正負電荷氨基酸殘基數分別為47和46個，其理論等電點為7.63。E蛋白的不穩定指數為26.84，低于閾值40，表明該蛋白為穩定性蛋白。

2.2 DTMUV E蛋白的親疏水性分析結果 DTMUV E蛋白的平均親水性指數為-0.092，位于第489和490位氨基酸的疏水性指數最大，為2.700，位于第398位氨基酸的疏水性指數最小，為-2.211，且該蛋白的親水性氨基酸區域多于疏水性氨基酸區域，預測該蛋白為親水性蛋白（圖2）。

圖2 E蛋白的親疏水性預測結果Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic prediction of E protein

2.3 DTMUV E蛋白的跨膜區分析結果 如圖3所示，E蛋白有兩個跨膜螺旋區，分別位于452～474位和481～499位。

圖3 E蛋白跨膜螺旋區預測結果Fig.3 Predicted results of E protein transmembrane helical region

2.4 DTMUV E蛋白的信號肽分析結果 如圖4所示C值（剪切位點）和Y值（綜合S值和C值）均在第18位氨基酸達到最大，分別為0.169和0.134，S值（信號肽）第1～17位氨基酸的平均值為0.119，Y值與S值均小于閾值0.5，預測該蛋白沒有信號肽結構。

圖4 E蛋白信號肽預測結果Fig.4 Prediction results of E protein signal peptide

2.5 DTMUV E蛋白的亞細胞定位分析結果 預測結果表明，E蛋白定位于病毒衣殼中，表明E蛋白為囊膜蛋白。

2.6 DTMUV E蛋白的二級結構分析結果 如圖5所示，E蛋白中有208個氨基酸參與無規律卷曲的形成，占比最大，為41.52%；有100個氨基酸參與α-螺旋的形成，占比為19.96%；有162個氨基酸參與延伸鏈的形成，占比為32.34%；有31個氨基酸參與β-轉角的形成，占比為6.19%。

圖5 E蛋白二級結構預測結果Fig.5 Secondary structure prediction results of E protein

2.7 DTMUV E蛋白的三級結構分析結果 E蛋白的三級結構預測模型（c5wsnC）如圖6所示，該預測模型的蛋白覆蓋率為100%，可信度為100%。

圖6 E蛋白的三級結構模型Fig.6 Tertiary structure model of E protein

2.8 DTMUV E蛋白的翻譯后修飾位點分析結果如圖7所示，E蛋白有18個潛在的糖基化修飾位點，分別位于第8位、16位、47位、82位、103位、134位、154位、207位、214位、222位、235位、277位、307位、314位、347位、359位、475位和498位氨基酸。利用NetAcet軟件預測結果表明，E蛋白沒有乙?；揎椢稽c。如圖8所示，E蛋白含有24個絲氨酸磷酸化修飾位點，5個絡氨酸磷酸化修飾位點，23個蘇氨酸磷酸化修飾位點，包含有PKA、PKC、PKG、unsp、cdk5、p38MAPK、GSK3、SRC、CKⅠ、CKⅡ、EGFR、DNAPK、INSR、cdc2、RSK總共15類蛋白質激酶結合位點。

圖7 E蛋白糖基化預測結果Fig.7 Predicted results of E protein glycosylation

圖8 E蛋白磷酸化位點預測結果Fig.8 Phosphorylation site prediction results of E protein

2.9 DTMUV E蛋白的潛在抗原表位分析結果 利用Predicting Anti-genic Peptides軟件分析可知，E蛋白含有20個潛在的抗原決定簇。利用IEDB 軟件分析E蛋白的B細胞抗原表位，結果如圖9所示，連續氨基酸數量超過10個的B細胞抗原表位為62～86位、147～160位、172～183位、224～235位氨基酸。如表1所示，E蛋白的CD4+抗原表位結果中，HLA_DRB1_0801亞型的強結合肽最多，為15個，HLA_DRB1_0701亞型的弱結合肽最多，為52個。

表1 E蛋白CD4+抗原表位預測結果Table 1 Prediction results of E protein CD4+ antigen epitope

圖9 E蛋白潛在B細胞抗原表位預測結果Fig.9 Prediction results of potential B cell epitopes of E protein

3 討論

自2010年我國首次發現鴨坦蘇病毒病以來，該病對我國養鴨業造成了比較大的經濟損失。鴨群發病率可高達100%，雖然病死率低，但主要引起蛋鴨的產蛋量大幅度下降，甚至絕產。病鴨后期會出現神經癥狀，導致淘汰率升高，是造成我國鴨出欄量下降的主要因素之一。DTMUV不僅可以感染禽類，在將病毒接種于小鼠腦內實驗中，還會使小鼠出現神經癥狀甚至死亡[8]。Tang等[31]甚至在鴨場員工血清中檢測到了DTMUV的中和抗體。鴨坦布蘇病毒病傳入我國以后，就迅速傳遍全國，因此開展鴨坦布蘇病毒的研究是具有重要現實意義的。

E蛋白是DTMUV的重要抗原蛋白。莊育彬等[9]通過軟件預測DTMUV E蛋白含有17個糖基化修飾位點、13個絲氨酸、4個酪氨酸和8個蘇氨酸磷酸化修飾位點。與本研究所預測的18個糖基化修飾位點、24個絲氨酸、5個酪氨酸和23個蘇氨酸磷酸化修飾位點有一定的出入，可能是毒株和軟件不同所導致。與同為黃病毒屬的乙型腦炎病毒的預測結果比較顯示其也無信號肽，有兩個跨膜螺旋區，但跨膜區域有所不同，在乙型腦炎病毒E蛋白的結構域上具有與其毒力相關的氨基酸位點[10]。E蛋白結構域上也存在與毒力相關的氨基酸位點（E367、E304、E156）[11-13]，其中E156的突變是通過破壞E蛋白位于第154位氨基酸的N聯糖基化結構，而使DTMUV的毒力在鴨中傳播衰減。而位于E蛋白結構域上的第408位氨基酸的突變會增強中和抗體反應[14]。E蛋白結構域上的關鍵氨基酸位點的突變可能會導致蛋白質生物學功能的改變。DTMUV E蛋白的結構域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均被研究人員證實可以使小鼠產生抗體，并能為小鼠提供良好的免疫保護力[15-16]。余磊等[17]鑒定出了5個B細胞線性表位E25（25LEGGSCVTITAKDKPTIDVK44）、E97（97VDRGWGNG104）、E229（229SAGTW QNK236）、E349（349MTPVGRLI356）和E385（LVGSGKGQIRYQWHRSGSTI404）。張琳等[18]鑒定出了DTMUV E蛋白的一個B細胞線性表位385LVGSGKGQI393（EP385），并證明了該表位具有良好的免疫原性。李晨曦等[19]鑒定出了DTMUV E蛋白的線性抗原表位EVEPPFG，并證實了其為黃病毒共享型抗原表位。Gong等[20]用一個新的中和單克隆抗體3B8鑒定出了一個新的線性表位FSCLGMQNR。Chen等[21]鑒定出了一種新的中和性交叉反應表位。外源性抗原E蛋白在誘導機體產生針對DTMUV的中和抗體中起著關鍵作用，Chen等[22]在以鴨為宿主進行密碼子優化的縮短的E451基因在重組鴨瘟病毒載體中表達量最高[22]。由于E蛋白具有良好的免疫原性，將E蛋白與脂質體混合制成的亞單位疫苗的免疫效果更好[23]，E蛋白還可以與Semliki Forest virus（SFV）復制子制備成自殺性DNA疫苗，該疫苗可誘導機體產生強烈的體液免疫和細胞免疫反應，可以完全抵抗小鴨的DTMUV攻擊[24]。本研究所預測的DTMUV E蛋白中連續氨基酸數量超過10個的B細胞線性表位有4個，為B細胞抗原表位的鑒定提供了更多的可能性選擇，也為針對E蛋白進行的相關疫苗研究提供了理論基礎。

本研究利用生物信息學方法對DTMUV E蛋白進行了分析，結果顯示E蛋白由501個氨基酸組成，為親水性蛋白，穩定性較好；有2個跨膜螺旋區，無信號肽，且定位于病毒衣殼中的囊膜蛋白；有18個潛在的糖基化修飾位點、24個絲氨酸、5個酪氨酸和23個蘇氨酸磷酸化修飾位點；有20個潛在的抗原決定簇，有4個連續氨基酸數量超過10個的B細胞線性表位；選擇不同的亞型時，CD4+抗原表位都有多個結合肽。為進一步研究DTMUV的亞單位疫苗、E基因的功能提供了更多的理論支持。