玉米秸稈纖維素降解菌的紫外-微波復合誘變及產酶條件優化

魏 煒,趙之璧,袁雅姝

(沈陽建筑大學市政與環境工程學院,遼寧 沈陽 110168)

玉米秸稈在農業副產物中占比較大[1-2],簡單焚燒會造成大氣污染和資源浪費,纖維素是玉米秸稈細胞壁的主要成分,結構較為復雜,質地結實緊密[3],傳統的物理和化學方法對秸稈降解的效率不高,而生物法降解可以彌補上述不足[4-5]。高云航等[6]從牛糞中篩選出一株纖維素酶活性較高的菌株N12。高兆明等[7]從廈門紅樹林泥樣中篩選到一株纖維素酶產生菌G21。李君君[8]針對茶粕進行研究,從土壤、樹葉和腐爛的樹葉中篩選出了L-1、L-2、L-3、L-4、L-5和L-6纖維素降解菌株。魯雄[9]以甘蔗渣為唯一碳源,從廈門溫泉樣品中篩選出熱穩定纖維素產生菌XM70。王巖等[10-11]以農村自然堆肥堆秸稈還田土為菌源,在15 ℃低溫的培養條件下成功篩選出單菌54株。景如賢等[12]采取克氏碘液染色法從常年落葉的土壤中分離出高效降解菌。纖維素分解菌的篩選與鑒定是決定能否實現秸稈高效轉化為葡萄糖的關鍵。因此,筆者以沈陽地區的土樣為原料,利用剛果紅染色法從中篩選出降解性能相對較好的兩種菌株并進行鑒定,通過紫外-微波復合誘變篩選出降解性能更好的菌株,并對產酶條件進行了優化,為提升降解秸稈菌的性能提供了理論依據。

1 實 驗

1.1 秸稈及土樣

實驗秸稈采自沈陽市張官橋下河畔處的玉米田,大多數秸稈已經腐爛,并被降解風干成碎屑狀。實驗土樣采自沈陽建筑大學景觀稻田、古樹下,張官橋下玉米田、菜地,以及天柱山下等自然環境土壤。

1.2 主要試劑、培養基及儀器設備

試劑:濃度為0.05 mol/L,pH為4.8的醋酸緩沖液;CMC-HAc緩沖液;DNS試劑[13];質量濃度為1 g/L的葡萄糖標準液。

培養基:富集培養液[14];羧甲基纖維素鈉分離篩選培養基;剛果紅纖維素瓊脂培養基[15];濾紙條液體培養基[16];羧甲基纖維素鈉培養基。

儀器設備:烘箱;恒溫震蕩培養箱;鼓風干燥箱;高速多功能粉碎機;高壓蒸汽滅菌鍋;冰箱;高速離心機;電磁爐;生物顯微鏡等。

1.3 實驗方法

菌株形態學鑒定采用革蘭氏染色法[17]并參考菌株鑒定手冊;菌株分子學鑒定采用細菌16SrDNA序列測序的方法。

采用Van Soest分析法測定纖維素降解率。

羧甲基纖維素(CMC)酶活力和濾紙(FPA)酶活力的測定依據下式:

(1)

式中:A為CMC或FPA酶活力,U/mL;C為還原糖質量濃度,g/L;X為稀釋倍數,取25;V為總酶液體積,取10 mL;T為作用時間,取30 min;V1為參與反應的酶液體積,取0.5 mL;M為葡萄糖分子量,180。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的初篩

表1為7株纖維素降解菌透明圈直徑D、菌落直徑d及其比值。

表1 7株纖維素降解菌透明圈及菌落直徑Table 1 Clear circle and colony diameter of 7 cellulose degrading bacteria

選取D/d值相對較大的菌株Ⅰ、菌株Ⅳ、菌株Ⅴ和菌株Ⅵ4種菌株進行濾紙條斷裂實驗。培養15 d的斷裂情況如表2所示,其中菌株Ⅰ在第6 d開始斷裂;菌株Ⅳ和菌株Ⅴ雖然在前9 d斷裂程度一樣,但菌株Ⅳ在12 d斷裂程度更深,菌株Ⅴ在12 d沒有變化?？梢?菌株Ⅰ、菌株Ⅳ降解性相對較好。

表2 4株降解菌的濾紙條斷裂情況Table 2 Break of filter paper of 4 strains of degrading bacteria

選取濾紙條斷裂情況較好的菌株Ⅰ、菌株Ⅳ進行剛果紅液體驗證實驗,5 d后觀察發現:菌株Ⅰ液體底部有大量紅色沉淀,液體顏色變透明;菌株Ⅳ液體底部有少量紅色沉淀,液體顏色變淺,仍有少量顏色?？梢?菌株Ⅰ對纖維素的降解性最好、菌株Ⅳ次之。

2.1.2 菌株Ⅰ的復篩

初篩并不足以說明降解性能的優劣,還需要測定酶活力和降解率加以驗證,測得的葡萄糖標準曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

實驗分別測出菌株Ⅰ、菌株Ⅳ、菌株Ⅴ的CMC酶活力、FPA酶活力、吸光度及產糖量,將測定的吸光度值代入葡萄糖標準曲線中求出還原糖含量,用酶活力公式求出酶活力值,測得的纖維素降解率如表3所示,可以看出,菌株Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的CMC酶活力分別是1.050 U·mL-1、0.917 U·mL-1、0.858 U·mL-1;FPA酶活力分別為0.942 U·mL-1、0.810 U·mL-1、0.800 U·mL-1;纖維素降解率分別為22.09%、15.73%、14.23%。由此可見,無論是CMC和FPA酶活力,還是降解率,菌株Ⅰ都是最優的,與初篩的實驗結果一致。

表3 CMC和FPA酶活力及降解率測定結果Table 3 Results of CMC and FPA enzyme activity and degradation rate determination

2.1.3 菌株Ⅰ的16SrDNA分子學鑒定

對菌株Ⅰ進行基因組DNA提取、16S擴增、PCR產物的檢測,然后進行純化、測序,最后進行Ncbi-Blast比對分析,完成16S rDNA基因分子鑒定。圖2為對纖維素降解性能最好的菌株Ⅰ的16S rDNA同源性系統發育樹。根據Blast分析結果,菌株Ⅰ與Streptomyces sp.FZ92親緣關系最近,達到99.93%;菌株Ⅳ與Streptomyces rubiginosus親緣關系最近,達到99.65%,由此初步判定菌株Ⅰ為鏈霉菌。

圖2 菌株Ⅰ的16S rDNA同源性的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rDNA homology of strain I

2.2 菌株Ⅰ的紫外誘變育種

2.2.1 菌株Ⅰ的紫外誘變及初篩結果

制備孢子濃度為 1.0×108個/mL的菌懸液,置于紫外燈下進行常規處理,設定照射時間分別為20 s,40 s,60 s,100 s,120 s;在不同照射時間取樣,在涂布過程中避免被光照射,置于40 ℃培養箱,暗培養24 h,再見光培養48 h。紫外照射產生的影響如圖3所示。

圖3 紫外誘變的影響Fig.3 The influence of ultraviolet mutagenesis

從圖3可以看出,孢子的致死率隨著紫外線照射時間的延長而增加,當照射時間增至60 s、80 s、120 s時,致死率分別為78%、85%和98%,選擇80s為最佳照射時間進行篩選。選取D1/d1較大的6株菌種,分別命名為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6,進行固態發酵復篩實驗。

2.2.2 菌株Ⅰ的紫外誘變復篩結果

表4為紫外誘變后的復篩結果?？梢钥闯?菌株經過紫外誘變后,不論是CMC和FPA酶活力,還是對纖維素的降解效率,都有所提升,尤其是菌株SF3對纖維素的降解率達到29.37%,與未誘變相比提升了7.28%,因此選用菌株SF3進行復合誘變實驗。

表4 菌株Ⅰ的微紫外誘變復篩結果Table 4 Rescreening results of strain I by UV mutagenesis

2.3 菌株SF3的紫外-微波復合誘變育種

菌株SF3的復合誘變時間對孢子的影響如圖4所示。根據圖4結果,選擇1 min作為微波誘變時間進行復合誘變。

圖4 復合誘變時間對孢子的影響Fig.4 Effect of compound mutagenesis time on spores

經紫外-微波復合誘變后的復篩結果如表5所示。從表5中可以看出,菌株經過復合誘變后,不論是對CMC和FPA酶活力,還是對纖維素降解效率的影響,與單獨紫外誘變和未誘變相比都有了極大的提升,尤其是菌株SF3-3對纖維素的降解率達到40.21%,與未誘變相比提升了18.12%,與單獨紫外誘變相比提升了10.84%,且通過重復固態發酵,其穩定性較好,對纖維素的降解率始終保持在30.57%～40.21%。由此可見,紫外-微波復合誘變與傳統的單獨誘變相比效果更好。SF3-3可作為復合誘變產生的新菌株進行產酶條件優化。

表5 紫外-微波復合誘變菌株的復篩結果Table 5 Results of re-screening of UV-microwave combination mutagenic strains

2.4 產酶條件優化

2.4.1 不同溫度對酶活力的影響

溫度直接影響到菌株的生理活性。一般真菌的最佳發酵溫度在25 ℃左右,細菌在30 ℃左右。因此,設定實驗溫度分別為20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃。將菌株接種于pH為7.0的50 mL培養基中,分別在以上溫度條件下130 r/min振蕩培養4 d,制備粗酶液,測定CMC及FPA活力,結果如圖5所示。

圖5 溫度對CMC和FPA酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on CMC and FPA enzume activity

由圖5可知,溫度對CMC和FPA酶活力影響較大,在其他條件相同時,CMC和FPA酶活力均呈先升高后降低的趨勢。當溫度達到28 ℃,CMC和FPA酶活力均達到最大值,分別為1.996 U/mL和1.951 U/mL,在此溫度下,菌株的酶促反應速率達到較高,產酶條件達到最佳。在低于25 ℃和高于30 ℃時,由于溫度較為極端導致菌株部分酶失活變性,在一定程度上抑制了CMC和FPA的酶活力,尤其是在20 ℃時CMC和FPA酶活力均達到最低值,分別為1.184 U/mL和1.126 U/mL。因此可將后續實驗的溫度設置為28 ℃。

2.4.2 不同培養基初始pH值對酶活力的影響

培養基初始pH值改變產酶效果的機理是由于pH可以改變菌株細胞內部的電荷量,在一定程度上影響了酶的構造及酶促反應的速率。設定發酵培養基初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,將培養過夜的菌種分別接種于50 mL培養基中,再分別在28 ℃條件下,130 r/min振蕩培養4 d后制備粗酶液,測定CMC及FPA酶活力,圖6為測定結果。

圖6 pH對CMC和FPA酶活力的影響Fig.6 Effect ofpH on CMC and FPA enzume activity

由圖6可知,培養基初始pH值對CMC和FPA的酶活力的影響較大,從圖中可以看出,在其他條件都相同的情況下,CMC和FPA酶活力呈現先升高再降低的趨勢,且不同pH下的酶活力差異也比較顯著,因此表明培養基初始pH對菌株的CMC和FPA酶活力影響較大。當pH值呈酸性時,酸性越強酶活力越低,當pH為4.0時,CMC和FPA酶活力達到酸性條件下也是整體條件下的最低值,分別為1.260 U/mL和1.126 U/mL;當pH升高至中性時,酶活力有了明顯的提高,其中當培養基初始pH值達到7.0時,CMC和FPA酶活力達到最大分別為2.072 U/mL和1.871 U/mL;繼續升高pH達到堿性時,酶活力逐漸降低,直到pH達到9.0時,CMC和FPA酶活力達到堿性條件下的最低值,分別為1.753 U/mL和1.646 U/mL。由此可見,酸性條件下對菌株酶活力的影響程度要強于堿性。最適培養基初始pH值為7.0。

2.4.3 不同接種量對酶活力的影響

將菌株分別按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種于50 mL、初始pH值為7.0的培養基中,在28 ℃、130 r/min的條件下振蕩培養4 d后取發酵液,測定CMC及FPA活力,以確定最佳接種量(見圖7)。

圖7 接種量對CMC和FPA酶活力的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on CMC and FPA enzume activity

從圖7中可知,接種量對酶活力的影響不是很大,隨接種量呈先升高再下降的趨勢,在其他條件相同時,該菌的接種量為2%時,其CMC和FPA酶活力均達到最大值,分別為1.603 U/mL和1.523 U/mL,當接種量超過2%時,菌株的酶活力逐漸降低,尤其是當接種量達到10%時,其CMC和FPA酶活力均達到最低值,分別為1.501 U/mL和1.465 U/mL,接種量的增加導致酶促反應無法正常進行,在一定程度上抑制了產酶效果,因此最適接種量為2%。

2.4.4 不同轉速對酶活力的影響

將菌株以接種量為2%接種到初始pH值為7.0發酵培養基中,分別設定搖床轉速為100 r/min、130 r/min、148 r/min、180 r/min,均置于28 ℃條件下振蕩培養4 d后取發酵液,測定CMC及FPA活力,圖8為實驗結果。

圖8 轉速對CMC和FPA酶活力的影響Fig.8 Effectof rotational speed on CMC and FPA enzume activity

由圖8可知,轉速對CMC和FPA酶活力的影響不是很大,在其他條件相同時,該菌的最適轉速為130 r/min,其CMC和FPA酶活力均達到最大值,分別為1.642 U/mL和1.563 U/mL,當轉速低于100 r/min和高于180 r/min時,在一定程度上抑制了產酶效果,且在轉速達到180 r/min時,CMC和FPA酶活力均達到最小值,分別為1.599 U/mL和1.489 U/mL,造成酶活力較低的原因是過快的轉速可能改變菌株細胞變性或使之失活,在一定程度上影響了酶促反應速率,因此,該菌株的最適宜轉速為130 r/min。

2.5 正交試驗及驗證

由于誘變后的Streptomyces sp.FZ92C的CMC和FPA酶活會受到多種因素的影響,因此要確定一個最佳的反應條件。將培養時間設置為4d,設計了正交試驗,各因素水平表如表6所示。

表6 正交試驗因素水平表Table 6 Factor level table of orthogonal test

正交試驗極差越大,說明影響就越大。正交試驗結果如表7所示,從表7中4種單因素CMC與FPA正交試驗的極值實驗結果可以看出,對兩種酶活力影響最大的是溫度,其次是培養基pH值,再次是接種量,最后是轉速。

表7 正交試驗結果表Table 7 Results of orthogonal test

通過正交試驗得出的結果確定最佳條件:溫度為28 ℃、接種量為2%、pH值為6.0、轉速為130 r/min,此時的CMC酶活力為1.812 U/mL,FPA酶活力為1.812 U/mL。單因素試驗得出的最佳試驗條件:溫度為28℃、接種量為2%、pH值為7.0、轉速為130 r/min,CMC酶活力為2.072 U/mL,FPA酶活力為1.464 U/mL。由此可見單因素試驗得出最佳條件時的CMC和FPA酶活力要高于正交試驗最佳條件時的CMC和FPA酶活力,因此最佳產酶條件:溫度為28℃、接種量為2%、pH值為7.0、轉速為130 r/min。

3 結 論

(1)從張官橋下玉米地篩選出來的兩株降解菌經16S rDNA鑒定均為鏈霉菌屬菌種,菌株Ⅰ與Streptomyces sp.FZ92親緣關系為99.93%;菌株Ⅳ與Streptomyces rubiginosus親緣關系99.65%,且菌株Ⅰ的降解性能最好,達12.08%。

(2)對菌株Ⅰ進行紫外-微波復合誘變,得到1株纖維素降解性能最好、對秸稈降解效率達到40.21%的菌株SF3-3,與未誘變株相比降解率提升了18.12%,與單獨紫外誘變株相比降解率提升了10.84%,復合誘變極大地提高了菌株的降解性能。

(3)兩種酶活力的影響因素強弱依次為:溫度、培養基初始pH值、接種量、轉速;復合誘變后的菌株SF3-3的最佳產酶條件:溫度為28 ℃、接種量為2%、pH值為7.0、轉速為130 r/min。