印度梨形孢對鹽脅迫下水稻幼苗生長及抗氧化系統的影響

夏楊 李傳明 劉琴, 韓光杰 徐彬 黃立鑫 祁建杭 陸玉榮 徐健,*

印度梨形孢對鹽脅迫下水稻幼苗生長及抗氧化系統的影響

夏楊1李傳明2劉琴1,2韓光杰1徐彬1黃立鑫1祁建杭2陸玉榮1徐健1,*

(1江蘇里下河地區農業科學研究所/國家農業微生物揚州觀測實驗站，江蘇 揚州 225007；2揚州綠源生物化工有限公司，江蘇 揚州 225008；*通信聯系人，email: bio-xj@163.com)

【目的】探究印度梨形孢()PI-020對鹽脅迫下水稻幼苗生長、抗氧化相關酶活性及基因表達水平的影響?！痉椒ā恳圆煌瑵舛鹊腜I-020菌絲體懸液接種南粳9108水培苗，顯微鏡觀察及qPCR技術分析PI-020在水稻秧苗根系的定殖能力，并測定水稻葉片丙二醛(MDA)含量，分析水稻秧苗的表型參數、光合色素含量、抗氧化相關酶活性及基因表達的變化?！窘Y果】與對照相比，鹽脅迫條件下(100 mmol/L NaCl)，PI-020定殖后，水稻葉片MDA含量顯著降低。200倍菌絲體稀釋液處理的效果最好，MDA含量減少了67.2%。PI-020定殖后，水稻株高、根長、葉面積、鮮質量和干質量分別增加了34.67%、23.62%、58.04%、59.53%和67.25%，與對照相比均差異顯著；同時PI-020定殖還顯著提高了葉片光合色素含量，抗氧化酶CAT、APX、POD活性及抗氧化相關基因、、的表達水平?！窘Y論】印度梨形孢PI-020通過提高水稻幼苗抗氧化能力減少鹽脅迫引起的氧化損傷，從而降低MDA含量，同時緩解光合色素的降解，保護了水稻光合系統，進而提高水稻耐鹽性。

印度梨形孢；水稻；鹽脅迫；抗氧化酶；抗氧化基因

土壤鹽漬化是制約作物生長發育的重要非生物脅迫因子，嚴重影響作物產量形成。中國鹽漬土壤面積近1×108hm2，約占全球鹽漬土壤面積的1/10[1, 2]。受全球氣候變暖影響，加之不合理灌溉、過量施肥等人類活動，土壤次生鹽漬化問題也在不斷加劇。水稻是世界重要的糧食作物之一，對鹽脅迫非常敏感，鹽脅迫主要在離子穩態、滲透平衡、活性氧(ROS)清除和營養平衡方面對水稻造成傷害，引起水稻生長發育減緩，最終導致產量減少、品質下降[3]。近年來，受土壤鹽漬化影響的水稻種植面積逐年擴大，提高水稻耐鹽性對于鹽堿農田的修復和改良，以及水稻產量和品質的提升具有重要意義[4, 5]。

印度梨形孢()屬擔子菌門(Basidiomycota)層菌綱(Hymenomycetes)蠟殼耳目(Sebacinales)蠟殼耳科(Sebacinaceae)梨形孢屬()，最早由印度科學家Verma等[6]于1998年自塔爾沙漠灌木根際分離獲得，能定殖于植物根系表面、表皮細胞和細胞間隙，并形成典型的梨形厚垣孢子，存活于植物根系[7]。寄主范圍廣泛，可以與200多種單子葉、雙子葉植物共生，通過增強植物對N、P等營養物質的吸收，促進植物生長，增強植物系統抗性，是一種具有廣泛應用潛力的多功能植物內生真菌[8]。Abdelaziz等[9]研究發現能通過調節Na+/K+穩態、抗氧化酶活性和基因表達來誘導番茄(L.)對鹽脅迫的抗性，進而促進生長，提高產量。為此，美國《Science》雜志發表評論，稱向土壤中添加真菌是應對鹽堿化的低成本可行方法。

對多種植物具有顯著的鹽脅迫緩解作用，且作用機制多樣。接種的大麥(L.)，由于谷胱甘肽-抗壞血酸循環(GSH-AsA)的激活，抗氧化能力得到提升，表現出更好的耐鹽脅迫潛力[10]。接種玉米(L.)后能改善玉米氣孔運作，提高鉀向嫩枝的輸送速率，增強植株對鹽脅迫的抗性[11]。此外，研究表明通過上調、和基因的表達緩解鹽脅迫對非洲菊(L.)的負面影響[12]?？梢?，可以在活性氧清除、離子平衡、基因表達等方面與植物互作，提高植株的耐鹽能力。在對水稻鹽脅迫影響方面，研究發現能促進鹽脅迫下水稻幼苗生長，增強水稻對鹽脅迫的耐性[13, 14]。進一步研究表明接種的水稻幼苗，葉片中的耐鹽相關基因、、和的表達量上調[15]。目前，關于在水稻耐鹽方面的研究較少，其定殖對水稻抗氧化系統的影響還不清楚，調控水稻耐鹽的機制尚不明確。本研究選用南粳9108水稻品種作為供試材料，在鹽脅迫條件下測定定殖對水稻生長、光合色素含量、抗氧化酶活性和抗氧化基因表達的影響，系統探究調控水稻耐鹽性的機制，以期為應用內生真菌提高水稻耐鹽性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株PI-020由江蘇里下河地區農業科學研究所應用微生物研究室分離并保存[16]；供試水稻品種為南粳9108，由江蘇金土地種業有限公司提供。

1.2 PI-020菌絲體的制備

取PI-020于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L)平板上活化，28 ℃下培養7 d后，截取邊緣活性菌絲塊3個接種于100 mL PDB(不含瓊脂的PDA)培養液中，28 ℃、180 r/min下振蕩培養7 d，待孢子形成后，收集菌絲體20 g，加入100 mL無菌水，經切碎機破碎后備用。

1.3 水稻種植與處理

選取顆粒飽滿的水稻種子，漂洗后于70%乙醇浸泡5 min，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3遍，浸種1 d，于28 ℃黑暗條件下催芽3 d。以水稻水培營養液作為稀釋液對PI-020菌絲體進行50倍(P1)、100倍(P2)、200倍(P3)、400倍(P4)和800倍(P5)5種濃度稀釋，挑選長勢良好、出芽一致的種子置于水培盒中，加入不同濃度的菌絲體稀釋液，于26 ℃、14/10 h(光照/黑暗)、相對濕度70%的條件下培養，每3 d更換一次水培液[17]。15 d后進行鹽脅迫處理，鹽脅迫所用NaCl濃度為100 mmol/L(預實驗設置0、50、100、150、200 mmol/L不同NaCl濃度處理，根據幼苗生長狀態并結合王建飛等[18]研究結果確定)，以無鹽脅迫處理組為對照，鹽脅迫處理7 d后進行取樣和測定各項指標，每個處理3次重復。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.4 測定指標與方法

1.4.1 PI-020定殖檢測

鹽脅迫之前，每個處理隨機選取水稻幼苗，用無菌水沖洗幼苗根系3遍，待除去根系表面附著的菌絲體后，切成1 cm長小段。參考武美燕等[19]方法對根系樣品進行處理、染色和制片，觀察PI-020在水稻根系的定殖情況并拍照。提取接種和未接種處理的水稻根系DNA，參考夏楊等[20]的方法采用qPCR法進行定殖量檢測，每個處理隨機檢測5株水稻，試驗設3次重復。

1.4.2 丙二醛(MDA)含量測定

取各個處理的水稻葉片樣品，采用10％三氯乙酸提取MDA，參考Yun等[11]的方法利用硫代巴比妥酸(TBA)與MDA顯色反應進行測定和計算。

1.4.3 植株表型參數測定

收集鹽脅迫和無鹽脅迫處理7 d后的水稻植株，用去離子水沖洗干凈，吸水紙擦干后測量株高和根長，采用LI-3000C便攜式葉面積儀(美國LI-COR公司)測定葉面積，并立即稱重記錄數據，完成后用紙包好后放入電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)，先105℃下殺青40 min，再80℃下烘干至恒重進行稱重。

1.4.4 光合色素含量測定

參考王學奎等[21]的方法采用乙醇浸提法測定樣品中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.4.5 抗氧化酶活性測定

取新鮮的水稻葉片樣品，置于研缽中液氮研磨后，加入等體積預冷的磷酸緩沖液，12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液作為粗酶液用于過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化物酶(POD)活性測定，酶活性測定方法參考吳強盛[22]的方法。

1.4.6 抗氧化基因表達測定

按照TRNzol Universal總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)使用說明書提取水稻葉片總RNA，參照cDNA第一鏈合成試劑盒(寶日醫生物技術有限公司)說明書進行反轉錄合成cDNA第一鏈，－20 ℃保存備用。

通過NCBI數據庫獲取目的基因序列，利用Primer Premier 5.0設計熒光定量引物(表1)，引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。采用7500實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)進行qRT-PCR擴增，以為內參基因，測定水稻過氧化氫酶基因()、抗壞血酸過氧化物酶基因()、超氧化物歧化酶基因()以及谷胱甘肽還原酶基因()的表達量。反應體系參考高靈敏性染料法定量PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書配制，反應程序為95℃下30 s；95℃下10 s，60℃下30 s(收集熒光信號)，共40個循環，每個樣品重復3次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量[23]。

A－顯微鏡觀察；B－定殖量測定。PI-020為接種處理；CK為未接種處理。

Fig. 1. Colonization of PI-020 in rice roots.

1.5 數據分析

每個試驗設3次生物學重復。采用Excel 2019進行數據統計與分析，利用SPSS 22.0進行方差分析和差異顯著性分析，運用GraphPad Prism 8進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 PI-020定殖檢測及對水稻MDA含量的影響

PI-020接種處理水稻苗15 d，取水稻根系組織進行染色，并用光學顯微鏡觀察PI-020在根系的定殖情況。結果表明，所有接種處理的植株根皮層組織中均能觀察到梨形狀孢子(圖1-A)。qPCR檢測結果顯示，接種處理的15株水稻苗均能檢測到PI-020，定殖量如圖1-B所示，而未接種處理的水稻苗均未能檢測到。表明PI-020已穩定定殖于水培水稻苗根系，水稻植株可用于后續鹽脅迫試驗。

對不同濃度PI-020菌絲體懸液處理的水稻苗進行鹽脅迫處理，結果顯示鹽脅迫顯著抑制了水稻秧苗的生長，表現為株高、根長減小，而PI-020定殖不同程度地緩解了水稻的鹽脅迫(圖2-A)。MDA含量測定結果表明(圖2-B)，無鹽脅迫時，對照水稻葉片MDA含量處于較低水平，為4.83±0.15 nmol/g。鹽脅迫下，無PI-020定殖的水稻MDA含量為17.76±0.17 nmol/g，是對照的3.7倍，差異顯著。與對照相比，雖然PI-020定殖的水稻MDA含量也顯著升高，但均顯著低于無PI-020定殖的處理組。葉片MDA含量與PI-020處理濃度相關，隨濃度升高，MDA含量先降低后升高，其中以100倍(P2N)和200倍(P3N)稀釋濃度的菌絲體懸液處理的水稻MDA含量最低，較無PI-020定殖的處理分別降低了65.7%和67.2%。PI-020定殖均能顯著減輕鹽脅迫對水稻細胞膜造成的傷害，后續以200倍濃度稀釋菌絲體作接種處理的水稻苗進行試驗。

A－水稻鹽脅迫7 d后的表型，標尺為3 cm；B－水稻鹽脅迫7 d后葉片丙二醛含量。CK為對照；N為鹽脅迫；P1N為50倍梨形孢稀釋液+鹽脅迫；P2N為100倍梨形孢稀釋液+鹽脅迫；P3N為200倍梨形孢稀釋液+鹽脅迫；P4N為400倍梨形孢稀釋液+鹽脅迫；P5N為800倍梨形孢稀釋液+鹽脅迫。不同小寫字母表示處理之間差異達0.05顯著水平。下同。

Fig. 2. Effects of PI-020 colonization on salt tolerance of rice.

圖3 水稻鹽脅迫7 d后的表型

Fig. 3. Phenotypes of rice seedlings after 7 days of salt stress.

2.2 PI-020對鹽脅迫下水稻生長及光合色素含量的影響

水稻受到鹽脅迫后，生長發育受抑，葉片干枯(圖3)。由圖3可見，無PI-020定殖的水稻苗受鹽脅迫7 d后第二片完全葉發黃內卷，第三片完全葉葉尖也已漸趨發黃。PI-020定殖能夠顯著緩解鹽脅迫帶來的葉片損傷，有PI-020定殖的水稻苗第二、三片完全葉仍呈綠色展開狀。生長參數測定結果顯示PI-020定殖能夠促進水稻生長，同時顯著減小鹽脅迫對生長的抑制作用(圖4)。正常情況下，PI-020定殖后水稻株高、根長、葉面積、鮮質量和干質量較對照分別提高了10.89%、23.75%、29.39%、32.09%和33.75%。在受到鹽脅迫后，PI-020定殖的水稻株高、根長、葉面積、鮮質量和干質量也高于未定殖的鹽脅迫植株，分別提高了34.67%、23.62%、58.04%、59.53%和67.25%，差異顯著。

圖4 PI-020定殖對鹽脅迫下水稻生長的影響

Fig. 4. Effects of PI-020 colonization on rice growth under salt stress.

葉綠素和類胡蘿卜素屬于光合色素，在植物光合作用過程中發揮著重要作用。PI-020定殖對水稻葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響如圖5所示。無鹽脅迫時，PI-020定殖對水稻葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量無影響，與對照差異不顯著。受到鹽脅迫后，水稻葉片中光合色素含量與對照相比均顯著下降。PI-020定殖降低了鹽脅迫對水稻葉片光合色素含量的影響。有PI-020定殖的水稻葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量分別為0.57、0.17、0.74和0.12 mg/g，均顯著高于無PI-020定殖的鹽脅迫處理水稻。

Fig. 5. Effects of PI-020 colonization on photosynthetic pigment contents in rice leaves.

2.3 PI-020對鹽脅迫下水稻抗氧化酶活性及抗氧化基因表達水平的影響

正常條件下，PI-020定殖顯著提高水稻葉片SOD活性，對CAT、APX、POD活性無顯著影響(圖6)。受到鹽脅迫后，葉片CAT活性無變化，APX活性顯著下降，SOD和POD活性顯著提高。但有PI-020定殖的水稻CAT、APX和POD活性顯著上升，分別為無PI-020定殖水稻的1.5倍、2.7倍和1.3倍，SOD活性無顯著變化。

圖6 PI-020定殖對水稻抗氧化酶活性的影響

Fig. 6. Effects of colonization of PI-020 on the activities of antioxidant enzymes in rice.

由圖7可知，正常條件下，與對照相比，PI-020定殖對、和基因表達量沒有顯著影響，基因表達量顯著上調了1.3倍。鹽脅迫下，PI-020定殖顯著提高了、和基因的表達水平，分別上調了2.7倍、1.5倍和2.5倍，而基因的表達水平沒有發生顯著變化。

圖7 PI-020定殖對水稻抗氧化酶活性相關基因表達水平的影響

Fig. 7. Effects of PI-020 colonization on gene expression levels related to antioxidant enzyme activities in rice.

3 討論

在本研究中，我們采用了不同濃度的PI-020菌絲體稀釋液對水稻進行接種，鏡檢觀察及定量分析發現PI-020均能定殖于水稻苗根系。MDA為水稻在鹽脅迫等逆境條件下發生膜脂過氧化反應的產物，其含量可以作為判斷細胞膜對逆境反應強弱的指標。不同濃度PI-020定殖均可以顯著降低鹽脅迫條件下水稻葉片MDA含量，表明PI-020能緩解鹽脅迫對水稻葉片的膜脂過氧化作用。同時，這種緩解作用與接種濃度相關，當菌絲體稀釋倍數為200倍時，對膜脂過氧化反應緩解作用效果最好，濃度過低或過高都會影響PI-020作用的發揮。這可能是由于內生菌與寄主之間相互作用是平衡的拮抗關系，這一平衡一旦被打破，內生菌與寄主將會由互惠共生轉變為致病感染[24]。內生菌同寄主之間的共生平衡是有條件的，只有接菌量適當時，與植物才能形成互惠互利的共生關系[25]。

生物量是植物對鹽脅迫反應的綜合體現，是植物耐鹽性評價的重要指標[26]。Cruz等[27]發現與番茄共培養能緩解鹽脅迫對植株生物量積累的抑制；Abdelaziz等[28]發現鹽脅迫條件下，的定殖可以促進擬南芥的生長，增加植物的生物量。本研究中，有定殖的水稻，無論鹽脅迫條件是否存在，其植株的生物量均顯著高于對照。表明定殖能促進水稻生長，增加水稻生物量，且鹽脅迫條件下，定殖緩解了鹽脅迫對水稻的生長抑制。葉綠素、類胡蘿卜素等光合色素對植物光合作用過程中光能的吸收、傳遞和轉化極為重要。鹽脅迫條件下，定殖顯著提高了葉片中總葉綠素和類胡蘿卜素含量，表明定殖能緩解鹽脅迫對水稻葉綠素和類胡蘿卜素的降解，一定程度上保護光合作用系統。Ghorbani等[29]同樣發現接種可緩解鹽脅迫對番茄光合色素的不利影響。

脅迫使得水稻葉片中MDA含量增加，可能是由于脅迫引起的代謝紊亂致使植物的氧化還原系統受到破壞，ROS大量積累對植物造成傷害[30]。PI-020的定殖能夠顯著提高鹽脅迫下水稻的CAT、APX和POD等抗氧化酶活性，降低MDA含量，說明PI-020定殖有助于緩解氧化應激，減少鹽脅迫給水稻帶來的負面影響。李亮等[31]也發現可以通過激活抗氧化物酶活性來提高紫花苜蓿耐鹽性。植物受到環境脅迫時，防御基因會被激活，如、等[32]。Li等[33]研究發現，高表達基因能提高擬南芥對氧化應激的抗性。Yan等[34]研究發現，和基因的過表達能增強甘薯的耐鹽性?？寡趸虮磉_水平的上升能提高細胞ROS清除效率，增強植物對非生物脅迫的抗性[35]。本研究中，PI-020定殖能顯著提高鹽脅迫下水稻、的表達水平，與酶活性水平變化一致，推測PI-020能通過誘導鹽脅迫下水稻抗氧化基因的表達提高水稻耐鹽性。Guan等[36]報道，(AK059841，LOC_Os08g44770)基因過表達提高了水稻活性氧的解毒能力，減輕了鹽脅迫導致的氧化損傷，本研究發現PI-020定殖顯著提高了基因的表達量。雖然PI-020定殖增強了鹽脅迫下基因的表達量，但SOD酶活性無顯著變化。劉家林等[37]報道水稻基因組中存在9個基因，Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD三類SOD相互作用，組建成相對穩定的抗脅迫體系，SOD酶活性可能受多個基因共同調控。Xu等[38]研究發現，在干旱脅迫和復水條件下，肯塔基藍草葉片基因表達顯著增強，而SOD酶活性卻顯著降低，這種差異性表明酶活性的變化不是由mRNA水平引起的，而是在轉錄后水平上受到調控，這也可能是本研究中SOD酶活性與基因表達之間出現差異性的原因。

長期以來，土壤鹽漬化危害著水稻生長發育，造成產量下降。選育耐鹽品種、改良鹽堿土、優化栽培技術、施加外源物質是提高水稻耐鹽性的主要途徑和方法[39]，的出現或可為水稻促生耐鹽研究提供新思路。與叢枝菌根真菌(Abuscular Mycorrhizal Fungi, AMF)功能十分相似，對植物都能產生促生抗逆的效果，但性質上又有所不同，AMF是活體共生真菌，只能在活體植物根部寄生，而可以在多種人工合成培養基上進行培養，獲得純培養物[8, 40]。因此，不僅可用于科學研究，而且具有廣闊的產業化應用前景。

4 結論

定殖可以促進水稻生長，顯著緩解鹽脅迫對生長的抑制，抗逆促生效果與濃度相關；定殖后通過提高水稻抗氧化基因的表達水平及抗氧化酶活性，減少鹽脅迫對水稻造成的氧化損傷，降低MDA含量。此外還可通過緩解光合色素降解的方式，保護水稻光合系統，增強水稻對鹽脅迫的抗性。

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Effects ofon the Growth and Antioxidant System of Rice Seedlings Under Salt Stress

XIA Yang1, LI Chuanming2, LIU Qin1,2, HAN Guangjie1, XU Bin1, HUANG Lixin1, QI Jianhang2, LU Yurong1, XU Jian1,*

(Jiangsu Lixiahe District Institute of Agricultural Sciences/National Experimental Station of Yangzhou for Agricultural Microbiology, Yangzhou 225007, China; Yangzhou Lyuan Bio-chemical Ltd. Co., Yangzhou 225008, China; Corresponding author, email: bio-xj@163.com)

【Objective】This study aims to investigate the impact ofPI-020 on rice seedling growth, antioxidant-related enzyme activities and gene expression levels in response to salt stress. 【Method】Different concentrations of PI-020 mycelial suspensions were used to inoculate Nanjing 9108 hydroponic seedlings. The colonization ability of PI-020 in rice seedling roots was evaluated using a microscopy and qPCR. The malondialdehyde (MDA) content of rice leaves was determined, and changes of phenotypic parameters, photosynthetic pigment contents, antioxidant-related enzyme activities and gene expression levels in rice seedlings were analyzed. 【Result】Under salt stress (100 mmol/L NaCl), PI-020 colonization significantly reduced the MDA content in rice leaves compared to the control. The 200-fold mycelial dilution was the most effective, resulting in a 67.2% decrease in MDA content. After PI-020 colonization, the plant height, root length, leaf area, fresh weight, and dry weight of rice seedlings significantly increased by 34.67%, 23.62%, 58.04%, 59.53%, and 67.25%, respectively, compared to the control. Additionally, PI-020 colonization significantly increased the photosynthetic pigment contents, CAT, APX, POD activities, and the expression levels of antioxidant-related genes,, andin leaves. 【Conclusion】PI-020 reduces the oxidative damage caused by salt stress through improving the antioxidant capacity of rice seedlings, thereby reducing the content of MDA, while alleviating the degradation of photosynthetic pigments, protecting the photosynthetic system. Consequently, it improves the salt tolerance of rice.

; rice; salt stress; antioxidant enzyme; antioxidant gene

10.16819/j.1001-7216.2023.230201

2023-02-01；

2023-05-11。

江蘇省科技支撐計劃資助項目(BE2020321)；江蘇省自主創新資金資助項目[CX(20)1004]；江蘇省亞夫科技服務項目[KF(22)1020]；農業基礎性長期性科技工作資助項目(NAES069AM04, NAES-EE-041)。