連續3 a生草對蘋果園土壤理化性質及微生物群落的影響

姜莉莉,孫瑞紅,張甘雨,張文升,宮慶濤,武海斌

(山東省果樹研究所,山東泰安 271000)

果園土壤管理是果業生產的重要環節。行間生草是近年來國內興起的果園管理新模式,改變了傳統的果園清耕管理方式[1]。大量研究表明,果園生草有利于改善果園生態環境,改良土壤結構[2],促進保水保土[3],增加土壤有機質及各種養分元素含量[4],提高果園綜合效益[5]。

不同生草制度對果園土壤的改良效果存在明顯差異[6]。目前果園生草有自然生草和人工種草2種模式。王艷廷等[7]報道,自然生草能夠降低黃河三角洲果園土壤的含鹽量,提高有機質含量。秦景逸等[8]報道,與清耕相比,蘋果園間作紅豆草、紫花苜蓿等綠肥可提高土壤速效氮、速效磷和有機質含量。楊野等[9]報道,蘋果園種植黑麥草可使土壤速效磷和速效鉀含量分別較對照增加82.1%和20.4%。

長柔毛野豌豆(ViciavillosaR.)屬于1a生豆科植物,其有冬小麥特性,春季迅速爬蔓生長、覆滿地面,具有涵養水源的作用,在果園生草中應用較廣[10]。白三葉(TrifoliumrepensLinn)又名白車軸草,其莖葉細軟、匍匐生長特性強,被廣泛用于水土保持、園林綠化及果園生草[11]。黑麥草(LoliumperenneL)屬禾本科1a生或多年生優良牧草,具有培肥土壤的作用[12]。

本研究以自然生草(Natural Grass, NG)為對照,研究蘋果園行間連續3a種植黑麥草(LoliumperenneL., LPL)、白三葉(TrifoliumrepensLinn., TRL)和長柔毛野豌豆(ViciavillosaR., VVR)對土壤微生物群落結構及堿解氮(Alkali-hydrolyzable nitrogen,AN)、有效磷(Available phosphorus,AP)、速效鉀(Available kalium,AK)、有機質(Organic matter,OM)和pH的影響,并進行相關性分析,以期為果園生草制度的科學制定和果園種植業的綠色健康發展提供理論 依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗區位于山東省聊城市陽谷縣蘋安耶果農業科技有限公司矮砧立架密植蘋果園(36°10′54″N,115°54′3″E)。試驗地南北向,地勢平坦,地貌、土質等自然條件基本一致。土壤為砂壤土,pH 7.8。供試蘋果為2 a生‘煙富三號’,砧木為M9T337,株行距為1 m×3.5 m。自然生草群落為稗草、馬唐、狗尾草、蒲公英、馬齒莧及苦荬菜等。

園區肥水措施基本一致,2017-2020年,每年采收后秋施有機肥500 kg/667m2(含有機質40%,芽孢桿菌0.2 億/g)。通過水肥一體化追肥處理見表1。

表1 試驗果園追肥記錄

1.2 試驗設計

采用單因素隨機區組試驗設計,以自然生草為對照,設置種植黑麥草(LPL)、白三葉(TRL)和長柔毛野豌豆(VVR)3個人工生草處理。每個處理重復3次,每個小區面積350 m2。分別于2017年、2018年和2019年10月進行行間機械播種,播種密度22.5 kg/hm2,播種深度1～2 cm,各處理的生態條件及蘋果的田間管理措施一致。

1.3 樣品采集

分別于2018、2019和2020年蘋果采收后施基肥之前進行土壤采樣。在各小區兩行樹間均勻布設15～20個采樣點,清除表層凋落物,用土鉆采集5～15 cm土層土樣。將每個處理的土樣充分混勻,去除根系等雜質,過1 mm篩后分成2份。一份經液氮凍干處理后,以干冰保存并送樣,用于測定土壤微生物群落結構;另一份風干后,用于土壤理化性質分析。

1.4 土壤微生物群落結構分析

土壤微生物群落結構的高通量測序分析由北京諾禾致源科技股份有限公司代理完成。

提取樣本基因組 DNA 并檢測純度和濃度后,以無菌水稀釋至1 ng/μL。以此為模板,分別采用帶Barcode的引物515F/806R和ITS5-1737F/ITS2-2043R進行16S和ITS區域PCR擴增,用于鑒定細菌和真菌多樣性。

PCR產物經電泳檢測和酶標定量,根據濃度進行等量混樣,以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的條帶。構建文庫,經過Qubit和Q-PCR定量檢測合格后,使用NovaSeq 6000進行上機測序。

拆分出樣本數據,截去Barcode和引物序列,進行數據質控,去除嵌合體序列,得到最終有效數據。利用Uparse算法進行聚類分析,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。依據其算法原則,篩選出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋,用Qiime軟件(v1.9.1)中的blast方法與Unite(v8.2)數據庫進行物種注釋分析,并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。以樣本中數據量最少的為標準進行均一化處理,并基于此進行后續的Alpha和Beta多樣性分析。

使用Qiime軟件計算Observed-otus,Chao1,Shannon,Simpson,ace,Goods-coverage,PD_whole_tree 指數,使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。進行Spearman相關性分析,以pheatmap函數進行可視化。

1.5 土壤理化性質測定

土壤堿解氮(Alkali-hydrolyzable nitrogen,AN)含量測定方法采用堿解擴散法,有效磷 (Available phosphorus,AP)含量測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法,速效鉀(Available kalium,AK)含量測定采用醋酸銨浸提-火焰光度法。土壤pH測定采用電極電位法,有機質(Organic matter,OM)含量測定采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法[13]。

1.6 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0進行數據統計分析,并進行Duncan’s差異顯著性分析和Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 連續3 a生草處理對果園土壤理化性狀的影響

由表2可以看出,隨著生草時間的延長,除有效磷外,各生草處理的土壤養分含量總體呈上升趨勢,pH呈下降趨勢。連續生草3 a,白三葉和長柔毛野豌豆處理的蘋果園土壤堿解氮含量均顯著提高,分別由2018年的18.38 mg/kg和42.26 mg/kg提升至2020年的70.16 mg/kg和61.94 mg/kg;黑麥草和長柔毛野豌豆處理的土壤速效鉀含量均顯著提高;黑麥草、白三葉和長柔毛野豌豆處理的土壤有機質含量均顯著提高;自然生草處理的土壤養分含量隨著生草年限的延長呈現波動趨勢。

表2 連續3 a生草處理的蘋果園土壤理化性狀

2.2 連續3 a生草對果園土壤微生物多樣性指數的影響

2.2.1 連續3 a生草處理對果園土壤細菌多樣性指數的影響 由表3可以看出,連續3 a生草,各生草處理的土壤細菌Shannon和Simpson指數差異不大, Chao1和ACE指數呈先上升后下降的趨勢,且3個人工生草處理的Chao1和ACE指數整體高于自然生草處理。

表3 連續3 a生草處理土壤細菌多樣性指數的變化

2.2.2 連續3 a生草處理對果園土壤真菌多樣性指數的影響 由表4可以看出,連續生草3 a,自然生草(NG)處理的真菌Shannon指數變化不大,3個人工生草處理的Shannon指數隨著年份的推移逐漸下降。其中長柔毛野豌豆(VVR)處理的下降幅度最小,由7.77降至6.91,白三葉處理降低幅度最大,由7.24降至4.65。各處理Simpson指數總體差異不大。長柔毛野豌豆處理的Chao1和ACE指數整體高于其他處理。

表4 連續3 a生草處理土壤真菌多樣性指數的變化

2.3 連續3 a生草處理對果園土壤微生物群落結構的影響

2.3.1 連續3 a生草處理對果園土壤細菌相對豐度的影響 由圖1可以看出,連續3 a生草處理,各處理的芽孢桿菌Bacillus相對豐度呈下降趨勢,鞘氨醇單胞菌Sphingomonas相對豐度整體呈上升趨勢,溶桿菌Lysobacter呈先上升后下降趨勢。

A.Acidibacter酸桿菌;B.Bacillus芽孢桿菌;C.Subgroup_10未識別;D.Sphingomonas鞘氨醇單胞菌;E.Bryobacter未識別;F.unidentified_Chloroplast未識別葉綠體;G.Lysobacter溶桿菌;H.UTCFX1未識別;I.RB41未識別;J.MND1未識別

2.3.2 連續3 a生草處理對果園土壤真菌相對豐度的影響 由圖2可以看出,連續生草處理 3 a,白三葉(TRL)和長柔毛野豌豆(VVR)處理可顯著提高果園土壤木霉屬Trichoderma真菌的相對豐度。黑麥草(LPL)、白三葉和自然生草(NG)可在一定程度上提高果園土壤白粉菌屬Blumeria的相對豐度。

A.Battarrea未識別;B.Fusarium鐮刀菌屬;C.Sarocladium帚枝霉屬;D.Mortierella被孢霉屬;E.Mycena小菇屬;F.Ramicandelaber未識別;G.Conocybe錐蓋傘屬;H.Unidentified未識別;I.Blumeria白粉菌屬;J.Trichoderma木霉屬

2.4 果園生草處理土壤微生物相對豐度與理化性質的相關性

2.4.1 果園生草處理土壤細菌相對豐度與理化性質的相關性 由圖3可以看出,在生草條件下,蘋果園土壤氣單胞菌屬Arenimonas相對豐度與有效磷(AP)呈顯著正相關;青枯菌屬Ralstonia相對豐度與有效磷和pH呈顯著正相關;鞘氨醇單胞菌Sphingomonas相對豐度與pH呈顯著負相關;芽孢桿菌Bacillus相對豐度與有效磷呈顯著正相關,與pH呈極顯著正相關;溶桿菌Lysobacter相對豐度與有效磷呈顯著正相關。

A.Nocardioides類諾卡氏屬;B.Opitutus豐佑菌屬;C.Flavobacterium黃桿菌屬;D.Unidentified_Vicinamibaceriaies未識別;E.Pir4_lineage未識別;F.Ohtaekwangia未識別;G.Skermanella未識別;H.Solirubrobacter未識別;I.AKYG587未識別;J.SWB02未識別;K.Arenimonas氣單胞菌屬;L.Polycyclovorans未識別;M.Microvirga微小桿菌;N.Hassallia未識別;O.Arthrobacter節細菌屬;P.Adhaeribacter未識別;Q.Ralstonia青枯菌屬;R.Terrimonas未識別;S.Ramlibacter分枝菌;T.Ellin6067未識別;U.Sphingomonas鞘氨醇單胞菌;V.Pirellula小梨形菌屬;W.Dongia未識別;X.Steroidobacter未識別;Y.Bacillus芽孢桿菌;Z.Gaiella未識別;AA.Haliangium未識別;AB.Acidibater酸桿菌;AC.Subgroup_10未識別;AD.Bryobacter未識別;AE.unidentified_Chloroplast未識別葉綠體;AF.Lysobacter溶桿菌;AG.UTCFX1未識別;AH.RB41未識別;AI.MND1未識別

2.4.2 果園生草處理土壤真菌相對豐度與理化性質的相關性 由圖4可以看出,鏈格孢屬Alternaria相對豐度與pH呈顯著正相關,巨孢囊霉屬Gigaspora相對豐度與速效鉀(AK)呈顯著正相關,與堿解氮(AN)呈極顯著正相關,與pH呈顯著負相關,與有效磷呈極顯著負相關;刺盤孢屬Colletotrichum相對豐度與有機質(OM)呈顯著負相關,與速效鉀呈極顯著負相關;葡萄穗霉屬Stachybotrys相對豐度與有機質呈顯著負相關;假裸囊菌屬Pseudogymnoascus相對豐度與pH呈顯著正相關;帚枝霉屬Sarocladium相對豐度與速效鉀呈顯著負相關;錐蓋傘屬Conocybe相對豐度與有效磷呈顯著正相關,與堿解氮呈顯著負相關;被孢霉屬Mortierella相對豐度與pH呈顯著正相關;白粉菌屬Blumeria相對豐度與堿解氮呈極顯著正相關,與有效磷呈極顯著負相關。

3 討 論

3.1 果園生草對土壤肥力的影響

中國果園面積位居世界首位,早在1998年便將果園生草作為綠色果品生產的主要技術措施在全國推廣[14]。吳家森等[15]和錢進芳等[16]報道,山核桃林生草能夠有效提高土壤養分含量和微生物功能多樣性,促進土壤修復。岳泰新等[17]報道,行間生草可以改善葡萄園土壤的微生物學指標,其中以白三葉和紫花苜蓿效果較為明顯。王倩等[18]報道,旱地蘋果園生草覆蓋可以顯著提高土壤有機質含量和微生物數量。孫計平等[19]報道,長期生草可以有效增加梨園表層土壤的微生物數量和腐殖酸含量。

生草模式和草種選擇是果園生草成功的前提和基礎[20]。錢雅麗等[21]報道,隴東旱作果園種植鴨茅Dactylisglomerata可以促進土壤氮素積累,種植白三葉和紫花苜蓿Medicagosativa的芽孢桿菌相對豐度較高。Wang等[22]報道,人工種植白三葉處理對果樹根際微生物增殖和堿解氮積累的促進效果高于自然生草。Pott等[23]報道,覆蓋植物長柔毛野豌豆可以降低作物對土壤氮素養分的消耗,且在一定程度上提高作物產量。

同一生草模式的不同生草年限對土壤養分及微生物群落結構的影響也并不完全相同。付學琴等[24]報道,南豐蜜橘園自然生草2 a堿解氮、速效磷、速效鉀含量明顯低于清耕對照,而生草8 a則較對照增加了25.98%、3.1%和90.57%。王艷廷等[7]報道,梨園自然生草處理4 a的土壤碳源利用高于生草6 a和9 a處理。

本研究以自然生草為對照,系統評價連續3 a種植黑麥草、白三葉和長柔毛野豌豆處理對土壤微生物群落結構及理化性質的影響。發現隨著生草年限的延長,各生草處理的土壤堿解氮、速效鉀及有機質含量總體呈上升趨勢,pH呈下降趨勢。連續生草3 a,白三葉和長柔毛野豌豆處理的蘋果園土壤堿解氮含量均顯著提高,其中白三葉處理的堿解氮含量由2018年的18.38 mg/kg提升至2020年70.16 mg/kg,這可能與豆科植物的固氮作用有關;黑麥草和長柔毛野豌豆處理的土壤速效鉀含量均顯著提高;人工生草處理的土壤有機質含量顯著提高;自然生草處理的土壤養分含量隨著生草年限的延長波動較大,這可能與覆蓋植物種類及覆蓋度變化有關。

3.2 果園生草對土壤微生物群落的影響

土壤微生物是陸地生態系統的重要組成部分,其參與調節大部分土壤生物化學過程,在養分循環中發揮著重要作用[25]。微生物多樣性指數、優勢度指數、均勻度指數和豐富度指數是表征群落多樣性的常用指數,可以揭示土壤微生物種類和功能的差異[26]。Shannon和Simpson指數主要反映樣品中物種分布的多樣性和均勻度,群落多樣性越高,物種分布越均勻,Shannon和Simpson指數越大。Chao1指數主要用于估計樣品中包含的物種總數[27]。ACE指數反映了樣品中物種的豐度和物種在樣品中出現的概率[28]。

姚城城等[29]報道,自然生草能夠提高蘋果園土壤細菌多樣性,改良群落結構和組成。徐惠昌等[30]報道,栗園種植鼠茅草可促進土壤紅菇屬的增殖,光葉紫花苕可促進粒毛盤菌屬和單頂孢屬的增殖。本研究發現,對細菌而言,蘋果園連續 3 a生草,各處理的土壤Shannon和Simpson指數差異不大, 3個人工生草處理的Chao1和ACE指數整體高于自然生草處理;對真菌而言,自然生草處理的真菌Shannon指數隨生草年限變化不大,3個人工生草處理的Shannon指數隨著年份的推移逐漸下降,長柔毛野豌豆處理的Chao1和ACE指數整體高于其他處理?？梢娙斯ど輰ν寥兰毦亩鄻有院途恍杂绊懖淮?但在一定程度上降低真菌的多樣性和均一性,長柔毛野豌豆處理可在一定程度上提高蘋果園土壤的真菌 總數。

微生物相對豐度分析發現,連續3 a生草處理,各處理的鞘氨醇單胞菌Sphingomonas相對豐度整體呈上升趨勢,溶桿菌Lysobacter呈先上升后下降趨勢;白三葉和長柔毛野豌豆處理可顯著提高果園土壤木霉屬Trichoderma真菌的相對豐度;黑麥草、白三葉和自然生草可在一定程度上提高果園土壤白粉菌屬Blumeria的相對豐度?？傮w比較可以發現,長柔毛野豌豆生草處理可在一定程度上提高鞘氨醇單胞菌、木霉菌等有益菌的相對豐度,但對白粉菌等有害菌不表現刺激作用,對果園土壤微生態環境有益。

土壤微生物相對豐度與理化性質的相關性分析發現,青枯菌屬Ralstonia與有效磷和pH呈顯著正相關;鞘氨醇單胞菌Sphingomonas與pH呈顯著負相關;芽孢桿菌Bacillus與有效磷呈顯著正相關,與pH呈極顯著正相關;溶桿菌Lysobacter與有效磷呈顯著正相關;鏈格孢屬Alternaria相對豐度與pH呈顯著正相關;白粉菌屬Blumeria相對豐度與堿解氮呈極顯著正相關,與有效磷呈極顯著負相關。同時,刺盤孢屬Colletotrichum相對豐度與有機質呈顯著負相關,與速效鉀呈極顯著負相關;葡萄穗霉屬Stachybotrys相對豐度與有機質呈顯著負相關?？梢?在生草條件下,適當提高果園土壤有效磷含量、降低pH,可在一定程度上降低青枯菌、白粉菌等病原菌的相對豐度,提高芽孢桿菌、溶桿菌等有益菌的相對豐度;適當提高土壤有機質含量,可在一定程度上降低刺盤孢屬、葡萄穗霉屬等病原菌的相對豐度,進一步改良土壤微生態環境。

4 結 論

土壤理化性狀測定發現,蘋果園連續生草 3 a,可顯著提高果園土壤養分含量、降低土壤pH。其中長柔毛野豌豆處理可以顯著提高土壤堿解氮、速效鉀含量,白三葉處理可以顯著提高堿解氮含量,黑麥草處理可以顯著提高土壤速效鉀含量。

微生物相對豐度分析發現,長柔毛野豌豆生草處理可在一定程度上提高鞘氨醇單胞菌、木霉菌等有益菌的相對豐度,對果園土壤微生態環境有益。

相關性分析發現,在生草條件下,適當提高果園土壤有效磷和有機質含量及降低pH,可在一定程度上降低青枯菌、白粉菌、刺盤孢屬、葡萄穗霉屬等病原菌的相對豐度,提高芽孢桿菌、溶桿菌等有益菌的相對豐度,有助于改良土壤微生態 環境。