代謝工程改造微生物利用甲酸研究進展

程真真，張健，高聰，劉立明，陳修來

（1 江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122； 2 江南大學，食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫 214122）

傳統化工行業依賴于化石燃料或糖類資源，在實際生產過程中不僅產生了大量溫室氣體，對環境造成了巨大壓力，而且還會與食品行業競爭，影響糧食安全［1?2］。近年來，隨著微生物細胞工廠的開發與應用，二氧化碳（CO2）、一氧化碳（CO）、甲烷（CH4）、甲醇與甲酸等一碳資源的生物煉制備受關注。相比于化石燃料與傳統碳源，一碳資源天然儲備豐富且生產成本相對低廉，因此，一碳資源有望成為下一代原料用于制備高附加值化學品［3?5］，如生物能源［6?7］、生物基材料［8?9］、生物醫藥［10?11］等，從而推動碳資源的可持續循環利用。CO2、CO 與CH4作為氣態底物，在氣液傳質上具有一定的局限性［4，12］，不利于微生物的細胞生長與產物合成；甲醇與甲酸作為液態底物，很好地繞過了這些限制條件［13］。甲醇作為一種大宗化學品，產能豐富且生產成本低，但是受到易燃性的限制，甲醇在微生物培養過程中的安全性明顯低于甲酸［14］。因此，甲酸的工業應用逐步展現出了巨大的潛能［15］，從而凸顯了甲酸生物經濟的優勢。

甲酸生物經濟的發展關鍵在于甲酸營養型微生物的構建與應用。目前，甲酸營養型微生物的構建方式主要有兩種：①優化天然甲酸利用微生物，提高甲酸代謝能力。例如，在鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）中，采用低能耗的異源還原性甘氨酸途徑取代高能耗的本源卡爾文循環，有效提高了菌株的甲酸代謝潛力［16］。雖然天然甲酸利用微生物具有一定的甲酸代謝基礎，能夠進行代謝工程改造，但是天然甲酸利用微生物的分子遺傳學操作工具與方法相對較少，從而在很大程度上限制了其改造與應用的空間。②構建人工甲酸利用微生物，人工賦予模式微生物甲酸代謝能力。例如，通過在大腸桿菌（Escherichia coli）中引入還原性甘氨酸途徑與能量再生模塊，使得工程菌株能夠利用甲酸為唯一碳源和能源進行細胞生長［17?18］。類似地，通過在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中強化還原性甘氨酸途徑，獲得的工程菌株可以同化利用甲酸與CO2［19］。相比于天然甲酸利用微生物，模式微生物的代謝工程改造難度小且應用范圍廣，但是卻面臨甲酸代謝能力不足與生長速率偏低等問題，因此，需要采用合適的代謝工程策略進行相應的改造與優化，提高甲酸的利用效率。

本綜述圍繞微生物同化利用甲酸過程中的關鍵問題，從甲酸利用的微生物、代謝路徑和代謝工程策略三個方面，闡述了微生物同化利用甲酸的改造與優化策略，并展望了甲酸生物經濟進一步發展與應用的方向。

1 甲酸利用的微生物

甲酸生物經濟的發展有利于推動一碳生物煉制的工業化進程，現階段甲酸生物經濟的首要任務是開發出能夠高效利用甲酸的微生物。然而，在提高微生物的甲酸利用效率方面仍然存在很多挑戰，如：天然甲酸利用微生物的甲酸代謝機制研究尚不完善、代謝工程改造的微生物甲酸耐受性偏低等。因此，需要在解析微生物甲酸代謝機制的基礎上，結合代謝改造策略進一步強化微生物甲酸耐受性，提高微生物的甲酸利用效率。

1.1 天然甲酸利用微生物

天然甲酸利用微生物廣泛存在于各種環境中，能夠通過多種代謝途徑，以甲酸為碳源或能源進行細胞生長（圖1，表1）。近年來，隨著甲酸生物經濟的快速發展，天然甲酸利用微生物展現出了廣闊的開發空間與獨特的研究價值，不僅可以進行代謝改造提高甲酸利用效率與目標代謝物生產能力，而且還能借鑒所具有的天然甲酸利用路徑，拓展模式微生物的代謝工程改造空間。

表1 天然甲酸利用微生物Table 1 Natural formate?utilizing microorganisms

圖1 天然甲酸利用微生物CBB cycle-Calvin?Benson?Bassham循環；THF-四氫葉酸；THMPT-四氫甲基蝶呤Fig. 1 Natural formate?utilizing microorganismsCBB cycle-Calvin?Benson?Bassham cycle; THF-tetrahydrofolate; THMPT-tetrahydromethanopterin

1.1.1 產乙酸菌

產乙酸菌（acetogen）為專性厭氧微生物，可以利用還原性乙酰輔酶A途徑進行CO2固定，在完成終端電子接受和能量代謝的同時，將CO2轉化為乙酰輔酶A［20］［圖1（a）］。甲酸作為還原性乙酰輔酶A 途徑中的重要代謝物之一，對于產乙酸菌的生長與代謝具有重要意義，可以被多種產乙酸菌同化利用，如伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii）、永達爾梭菌（Clostridium ljungdahlii）和熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica）等［20，37］。近年來，隨著甲酸營養型微生物的開發與研究，產乙酸菌可天然利用甲酸的這一特征引起了研究人員的極大重視。其中，以A. woodii作為產乙酸菌模式菌株，通過定量生理學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝模型計算等策略，分析了菌株的甲酸利用水平與甲酸代謝路徑，結果表明A. woodii具有良好的單一營養/混合營養型甲酸利用能力與能量利用效率［21?22］，從而充分證明了A. woodii作為甲酸天然利用微生物所具有的巨大應用潛能。

1.1.2 產甲烷菌

產甲烷菌（methanogen）是一種專性厭氧的古菌，可將CO2、甲酸、乙酸或含甲基的簡單化合物等還原為CH4，并從中獲取能量［23］［圖1（b）］。根據代謝底物類型的不同，可將產甲烷菌分為氫營養型、甲基營養型和乙酸營養型［38］。其中，氫營養型產甲烷菌具有最高的產能效率［39］，部分氫營養型產甲烷菌可以利用甲酸作為主要的電子供體，將CO2還原為CH4進行細胞生長［38，40?41］。氫營養型海沼甲烷球菌（Methanococcus maripaludis）作為產甲烷菌的模式菌株，不僅能利用氫氣與甲酸作為電子供體，還能以高轉化率將甲酸轉化為氫氣［24］。目前，基于M. maripaludis已經開發出了一系列分子遺傳學操作工具與技術［25?26］，如基于CRISPR/Cas9 系統［42］與CRISPR/Cas12a 系統［43］的基因編輯工具，充分顯示出了產甲烷菌進行代謝工程改造的潛能與應用優勢。

1.1.3 硫酸鹽還原菌

硫酸鹽還原菌（sulfate?reducing bacteria，SRB）為專性厭氧微生物，能夠以有機物、氫氣等作為電子供體，以硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等作為末端電子受體，通過異化作用獲取能量來進行細胞生長［圖1（c）］。部分SRB可以利用甲酸作碳源或電子供體，如普通脫硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris）［44］、巴氏脫硫弧菌（Desulfovibrio baarsii）［45］、脫硫脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）［46］和巴氏脫硫菌（Desulfarculus baarsii）［47］等。在SRB 可利用的眾多底物中，甲酸被認為是生物制氫的最佳底物之一［27?28］。以D. vulgaris作為SRB 的模式菌株，驗證了以甲酸為底物驅動產氫的可行性［27，29，48］，證明了SRB 在生物制氫方面所具有的優勢與未來發展空間。

1.1.4 甲基桿菌

甲基桿菌屬（Methylobacterium）細菌為好氧或兼性厭氧的甲基營養型微生物，能夠在甲酸、甲醛、甲醇或甲胺等一碳化合物上進行生長，也能利用二碳、三碳和四碳等多碳化合物進行生長［30］［圖1（d）］。扭脫甲基桿菌AM1（Methylobacterium extorquensAM1）為甲基桿菌的模式菌株，能夠利用甲醇作唯一碳源和能源。以往關于M. extorquensAM1 的研究，多集中于以甲醇為底物生產聚羥基丁酸酯、有機酸和精細化學品等［49］。近年來，隨著甲酸為底物的優勢逐步凸顯出來，M. extorquensAM1 可通過絲氨酸循環利用甲酸的特性也引起了研究人員的重視［31］。特別是對M. extorquensAM1的5，10?次甲基四氫葉酸環化酶的研究，為甲酸同化分子機制的研究奠定了生物化學基礎［50］。另外，通過甲醇與甲酸的耦合利用，提高了M. extorquensAM1的甲羥戊酸產量、產率和甲醇消耗速率［32］，充分體現了M. extorquensAM1 代謝利用甲酸的優勢，為一碳化合物轉化為高附加值化學品提供了一種切實可行的途徑。

1.1.5 其他天然微生物

除了上述天然甲酸利用微生物之外，近年來研究人員逐步分離與鑒定出更多新的天然甲酸利用微生物，如能夠通過絲氨酸循環同化甲酸合成單細胞蛋白的共生副球菌MA5 （Paracoccus communisMA5）［51］，這在一定程度上拓寬了甲酸利用微生物的應用范圍。另外，除了還原性乙酰輔酶A 途徑、絲氨酸循環以及還原性甘氨酸途徑之外，部分天然甲酸利用微生物還可以通過還原性磷酸戊糖循環利用甲酸，如C. necatorH16［33?34］、苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）［52］、亞硝酸鹽氧化細菌（Nitrolancetus hollandicus）［53］、嗜二氧雜環乙烷假諾卡氏菌CB1190（PseudonocardiadioxanivoransCB1190）［54］和嗜硫偶氮螺旋菌（Azospirillum thiophilum）［55］等，它們都具有甲酸脫氫酶，能夠在甲酸氧化為CO2的同時產生還原力，并通過還原性磷酸戊糖循環固定CO2進行細胞生長與代謝［圖1（e）］。C. necatorH16作為這一類型微生物的模式菌株，已經開發出一系列相應的分子遺傳學操作工具與技術，并結合代謝工程改造策略將其應用于開發微生物細胞工廠生產多種代謝產物［35?36］，極大地拓寬了生物固碳與甲酸生物經濟的發展空間。

1.2 代謝工程改造的微生物

天然甲酸利用微生物具有同化甲酸的代謝途徑，可以直接將甲酸作為碳源或能源。然而，大多數天然甲酸利用微生物并不像E. coli、S. cerevisiae等模式微生物適用于代謝工程改造與工業化生產。與代謝工程改造模式微生物相比，天然甲酸利用微生物仍然存在一定的不足，如：對環境條件更為敏感、培養條件更加復雜、生長速度較為緩慢等。此外，由于天然甲酸利用微生物的代謝機制研究尚不清晰，因此對其進行代謝工程改造仍然存在挑戰。相比而言，E. coli、S. cerevisiae等模式微生物（圖2，表2）的研究更加充分，不僅更適用于代謝工程改造與工業化生產，而且更有利于甲酸生物經濟的進一步發展。

表2 代謝工程改造的微生物Table 2 Metabolically engineered microorganisms

圖2 代謝工程改造的微生物PAOX1-醇氧化酶啟動子；THF-四氫葉酸Fig. 2 Metabolically engineered microorganismsPAOX1-alcohol oxidase 1 promoter; THF-tetrahydrofolate

1.2.1 大腸桿菌

E. coli作為常用的原核模式微生物，近年來已有多項研究聚焦于改造E. coli利用甲酸。在這些研究中，通過構建甲酸利用路徑［圖2（a）］，并結合代謝工程策略與實驗室適應性進化等策略，使得E. coli能夠利用甲酸（或甲酸與CO2）進行細胞生長［56］，充分體現了實驗室改造模式微生物利用甲酸的可行性。然而，這種甲酸營養型E. coli的生長速率與細胞密度顯著低于使用常規碳源培養的E.coli，主要原因在于甲酸營養型E. coli對甲酸的同化效率與耐受性均偏低。

1.2.2 釀酒酵母

相比于E. coli，S. cerevisiae作為真核模式微生物，雖然生長周期較長，但是其擁有高效的內源性NAD+依賴型甲酸脫氫酶，因此對甲酸的耐受性更高。此外，已有研究表明S. cerevisiae中存在還原性甘氨酸途徑所需的酶，將該途徑所涉及的酶進行強化表達之后，能夠實現S. cerevisiae同化利用甲酸與CO2［圖2（b）］，并且在1～500 mmol/L甲酸范圍內生長速率均能保持恒定［19］，這表明S.cerevisiae具有成為高效利用甲酸宿主的潛力。

1.2.3 其他微生物

甲酸營養型微生物的開發與應用在一碳生物煉制方面展現出了巨大潛能。除了E. coli與S.cerevisiae之外，通過改造其他模式微生物進行甲酸代謝，有利于開發更高效的甲酸營養型微生物細胞工廠。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為天然的甲基營養型酵母，在一碳生物煉制方面有望成為代謝工程改造的關鍵底盤微生物。甲醇作為誘導物，可以觸發P. pastoris的醇氧化酶（alcohol oxidase 1，AOX1）啟動子PAOX1所調控的異源蛋白表達。然而，由于甲醇具有一定的毒性、易燃性和爆炸性，從而限制了P. pastoris在食品與生物醫藥等產業的大規模應用。與甲醇相比，甲酸被認為是更安全的PAOX1的誘導物［68］。利用甲酸作為誘導物，可以增強P. pastoris木聚糖酶的表達［圖2（c）］，體現了該系統在異源蛋白表達與安全性方面的潛力［68?69］。此外，通過在惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中引入異源的還原性甘氨酸途徑［圖2（d）］，并結合模塊化工程、代謝工程改造與實驗室適應性進化等多項策略，獲得了能夠同化利用甲酸的工程菌株［70］，從而證明了P. putida在甲酸利用方面的潛能。

2 甲酸利用的代謝路徑

甲酸代謝路徑是甲酸營養型微生物利用甲酸的基礎，根據甲酸代謝路徑的來源與特點可分為3 類：天然的甲酸利用路徑、重構與優化的甲酸利用路徑以及人工設計的甲酸利用路徑。然而，天然的甲酸利用路徑存在明顯的應用局限性，人工設計的甲酸利用路徑則面臨路徑酶催化效率低等問題。因此，現階段甲酸代謝路徑的研究仍聚焦于天然甲酸利用路徑的重構與優化。

2.1 天然甲酸利用路徑

根據微生物利用甲酸的方式，可將天然甲酸利用路徑分為2類（圖3）：①甲酸分子并不直接參與到細胞代謝中，而是在氧化為CO2過程中產生還原力，從而為微生物的生長與固碳代謝提供能量，如還原性磷酸戊糖循環；②甲酸分子作為碳源，被直接同化進入到微生物的中心代謝之中，但是部分甲酸分子仍可能被氧化用于供能，如絲氨酸循環、還原性乙酰輔酶A 途徑和還原性甘氨酸途徑。

2.1.1 還原性磷酸戊糖循環

還原性磷酸戊糖循環（reductive pentose?phosphate cycle），也稱為Calvin?Benson?Bassham（CBB）循環，是唯一已知的能夠利用甲酸進行微生物自養生長的天然碳同化途徑［71］。CBB 循環主要包括三個過程［圖3（a）］：首先是羧化作用，在關鍵酶核酮糖?1，5?二磷酸羧化酶/加氧酶的作用下，1 分子CO2與1，5?二磷酸核酮糖（ribulose?1，5?bisphosphate，RuBP）分子進行反應，生成一個不穩定的六碳化合物，隨之分解為2分子3?磷酸甘油酸；其次是還原作用，2 分子3?磷酸甘油酸先轉化為2 分子1，3?二磷酸甘油酸，隨之生成2 分子3?磷酸甘油醛；最后是RuBP 的再生，在經過一系列多碳糖之間復雜的生物轉化后，5 分子3?磷酸甘油醛先轉化為1 分子5?磷酸核酮糖，隨之再生得到1分子RuBP。綜上所述，每輪CBB 循環固定1 分子CO2，三輪循環后生成1 分子3?磷酸甘油醛，共計消耗6 分子NAD（P）H 與9 分子ATP。CBB 循環依賴型微生物可以將甲酸作為唯一碳源和能源進行細胞生長。然而，CBB 循環途徑仍然存在一定的不足，如該循環是ATP 利用效率最低的固碳途徑之一［72］。與甲酸直接同化相比，甲酸的氧化供能存在著能量浪費，因為電子從甲酸轉移到氧化還原載體的過程需要消耗額外的能量［71］。因此，CBB 循環依賴型微生物的細胞生長速率與生產潛能仍然不夠高，與實際的工業化生產仍然存在差距。

2.1.2 絲氨酸循環

絲氨酸循環（serine cycle）是多種甲基營養型微生物（如M. extorquensAM1［31］）同化利用甲酸的代謝途徑。該循環包含了二碳、三碳及四碳化合物之間的相互轉化［圖3（b）］：首先是四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，簡稱THF）循環，即甲酸分子在甲酸四氫葉酸連接酶、次甲基四氫葉酸環水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶的先后作用下，生成5，10?亞甲基四氫葉酸，隨后5，10?亞甲基四氫葉酸的甲基轉移到二碳化合物甘氨酸上，生成三碳化合物絲氨酸；其次，絲氨酸依次轉化為羥基丙酮酸、甘油酸、2?磷酸甘油酸與磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），隨后PEP 經羧化作用固定1 分子CO2生成四碳化合物草酰乙酸；然后，草酰乙酸依次轉化為蘋果酸與蘋果酰輔酶A；最后，蘋果酰輔酶A 裂解為兩個二碳化合物乙酰輔酶A 與乙醛酸，其中乙醛酸能夠再次轉化為甘氨酸用于維持絲氨酸循環。綜上所述，每輪絲氨酸循環能夠同化1分子甲酸并固定1分子CO2，最終生成1分子乙酰輔酶A，共計消耗3分子NAD（P）H與3 分子ATP。與甲酸氧化供能相比，絲氨酸循環可以同化甲酸并固定CO2，不僅避免了碳損失，而且還能在一定程度上減少能量浪費。通過在E. coli中引入異源的天然絲氨酸循環，同時結合實驗室適應性進化策略，獲得了能夠同化利用甲酸合成乙醇的工程菌株［73］，從而驗證了絲氨酸循環在模式微生物中同化利用甲酸的可行性。然而，天然絲氨酸循環所涉及的酶和代謝反應比較多，且ATP利用效率仍然比較低，因此，利用該循環同化甲酸的微生物，目標代謝物的產量偏低，目前還不適合用于工業化生產。

2.1.3 還原性乙酰輔酶A途徑

還原性乙酰輔酶A 途徑（reductive acetyl?CoA pathway），也稱為Wood?Ljungdahl（WL）途徑，是一種廣泛存在于產乙酸菌、產甲烷菌與硫酸鹽還原菌等厭氧微生物中的固碳途徑。不同類型的厭氧微生物所具有的WL 途徑結構相似但有所差別，如產乙酸菌與產甲烷菌的WL途徑存在著一碳載體、輔酶與路徑酶等方面的差異［74］。以產乙酸菌的WL 途徑為例［圖3（c）］，WL 途徑由甲基分支與羰基分支兩條支路組成。在甲基分支中，甲酸到5，10?亞甲基四氫葉酸的部分與絲氨酸循環一致，隨后5，10?亞甲基四氫葉酸先轉化為5?甲基四氫葉酸，再實現甲基與鈷鐵硫蛋白（corrinoid ironsulfur protein，CoFeSP）間的連接，生成5?甲基鈷鐵硫蛋白；在羰基分支中，CO2在一氧化碳脫氫酶的作用下轉化為CO；最后，甲基分支的產物5?甲基鈷鐵硫蛋白提供甲基，羰基分支的產物CO 提供羰基，兩者連接生成乙酰輔酶A。綜上所述，WL 途徑能夠同化1 分子甲酸與1 分子CO2，最終生成1分子乙酰輔酶A，共計消耗3 分子NAD（P）H 與1分子ATP。與絲氨酸循環相比，WL 途徑生成1 分子乙酰輔酶A 僅僅消耗了1 分子ATP，且該途徑不存在碳損失，是ATP 利用效率最高的天然甲酸同化路徑。然而，WL 途徑的蛋白質組學十分復雜，且包含對氧氣非常敏感的路徑酶，因此，該途徑僅僅能夠在嚴格厭氧的條件下運行，且代謝改造難度比較大［75?76］，實現工業應用仍然存在挑戰。

2.1.4 還原性甘氨酸途徑

還原性甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，簡稱為rGly 途徑），主要存在于硫酸鹽還原菌（如D. desulfuricans）［46］和產乙酸菌（如梭狀芽孢桿菌Clostridium drakei）［77］中。該途徑主要包括三個模塊［圖3（d）］：首先，由甲酸到5，10?亞甲基四氫葉酸的轉化；其次，5，10?亞甲基四氫葉酸在甘氨酸裂解系統（glycine cleavage system，GCS）的催化下，固定1 分子CO2生成甘氨酸；最后，甘氨酸可通過兩種路線轉化為丙酮酸，一種為還原甘氨酸（reductive glycine，RG）路線，即5，10?亞甲基四氫葉酸的甲基轉移到甘氨酸上生成絲氨酸，隨后絲氨酸脫氨基形成丙酮酸，另一種為甘氨酸還原酶（glycine reductase，GR）路線，即甘氨酸依次轉化為乙酰磷酸、乙酸與乙酰輔酶A，隨后固定1 分子CO2生成丙酮酸。綜上所述，依賴于RG 路線的rGly 途徑能夠同化2 分子甲酸和1 分子CO2，最終生成1分子丙酮酸，共計消耗3分子NAD（P）H與2 分子ATP；依賴于GR 路線的rGly 途徑能夠同化1 分子甲酸和2 分子CO2，最終生成1 分子丙酮酸，共計消耗2分子NAD（P）H與1分子ATP。rGly途徑是一種能夠高效同化甲酸的代謝路徑，具有許多優勢：rGly 途徑對ATP 的利用效率僅次于WL途徑；rGly 途徑為線性途徑，降低了代謝改造的難度，且多種微生物具有內源性的rGly 途徑［78］；rGly 途徑與中心代謝途徑的重疊較少，因此異源引入或改造內源rGly 途徑對本源代謝網絡的干擾比較??；與絲氨酸循環和WL途徑相比，rGly途徑具有更高的代謝物靈活性，可以進一步轉化為多種化學品?；谏鲜鰞瀯?，rGly 途徑成為目前最具發展潛力的甲酸代謝路徑，與此同時，對路徑關鍵酶GCS 的深入研究［79?80］，有望進一步優化rGly 途徑。然而，對于具有天然rGly 途徑的微生物研究仍然較少，還不能滿足現階段甲酸生物經濟的發展要求。

2.2 重構與優化甲酸利用路徑

目前，對于天然甲酸利用路徑的應用，還存在著許多缺點與限制條件，因此，為了提高甲酸利用路徑的效率與應用潛能，研究人員在E. coli等模式微生物中重構與優化了天然甲酸利用路徑，獲得了一系列新型甲酸利用路徑（圖4），并分析了新型路徑的特點與可行性。

2.2.1 重構的卡爾文循環

通過在E. coli中重構卡爾文循環，首次實現了異養微生物向自養微生物的轉化［57］。通過敲除糖酵解途徑中的磷酸果糖激酶和戊糖磷酸途徑中的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶，并異源表達核酮糖?1，5?二磷酸羧化酶、磷酸核酮糖激酶、碳酸酐酶和甲酸脫氫酶，實現了在E. coli中重構卡爾文循環［圖4（a）］。重構的卡爾文循環（reconstructed Calvin cycle）可以固定CO2合成生物量，同時氧化甲酸實現供能。在此基礎上，將該循環與實驗室適應性進化相結合，進化獲得了自養型E. coli，這種基于甲酸供能的生物固碳模式在甲酸生物經濟發展和未來工業生物制造方面具有極大的潛力［81］。此外，隨著近年來電化學法還原CO2生產甲酸［82?84］的深入研究，該自養系統中由于甲酸氧化速率高于固碳速率而導致的CO2凈排放也有望得到優化與解決。

2.2.2 改良的絲氨酸循環

基于源自M. extorquensAM1 的天然絲氨酸循環，通過在E. coli中進行表達與改良絲氨酸循環，獲得的工程菌株能夠利用甲醇、甲酸和CO2合成乙酰輔酶A［58］。改良的絲氨酸循環（modifed serine cycle）同化甲酸的過程主要分為以下幾個步驟［圖4（b）］：首先，甲酸在甲酸四氫葉酸連接酶和5，10?亞甲基四氫葉酸合成酶的作用下轉化為5，10?亞甲基四氫葉酸，隨后在絲氨酸羥甲基轉移酶的催化下，5，10?亞甲基四氫葉酸的甲基轉移至甘氨酸上，生成絲氨酸；其次，絲氨酸在絲氨酸脫氨酶的催化下脫氨生成丙酮酸，再經PEP 合成酶、PEP 羧化酶的作用，固定1 分子CO2生成草酰乙酸；再次，草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和蘋果酸硫激酶的作用下轉化為蘋果酰輔酶A；最后，蘋果酰輔酶A經蘋果酰輔酶A裂解酶的催化，裂解為乙醛酸與乙酰輔酶A。其中，乙酰輔酶A作為該循環的輸出產物，而乙醛酸則轉化為甘氨酸用于完成新一輪循環。綜上所述，當甲酸作為底物時，改良的絲氨酸循環與天然絲氨酸循環一致，每輪循環能夠同化1 分子甲酸并固定1 分子CO2，最終生成1 分子乙酰輔酶A，共計消耗3 分子NAD（P）H與3 分子ATP。相比于天然絲氨酸循環，改良的絲氨酸循環具有一定生物優勢。通過甲醇脫氫酶和甲醛脫氫酶，不僅簡化了甲醇轉化為甲酸的路徑，而且還利用丙氨酸?乙醛酸轉氨酶、谷氨酸?丙酮酸轉氨酶和谷氨酸脫氫酶進行氨同化，以丙氨酸代替絲氨酸成為氨基供體，從而避免了有毒中間代謝物羥基丙酮酸的生成。然而，改良的絲氨酸循環路徑比較復雜，涉及多個酶促反應，且與中心代謝途徑的重疊較多。因此，仍存在ATP 利用效率偏低的問題，不利于進一步的代謝工程改造與工業應用。

2.2.3 高絲氨酸循環

基于絲氨酸循環，在E. coli中構建了高絲氨酸循環（homoserine cycle）［59］［圖4（c）］。首先，甲酸在乙酰輔酶A 合成酶和乙醛脫氫酶的作用下轉化為甲醛，甲醛作為一種高活性化合物，更易于被同化進入代謝系統［56，85］；其次，在絲氨酸醛縮酶的作用下，甲醛與甘氨酸反應生成絲氨酸，隨之絲氨酸脫氨形成丙酮酸；然后，另一分子甲醛與丙酮酸在4?羥基?2?氧代丁酸（4?hydroxy?2?oxobutanoate，HOB）醛縮酶的作用下，生成非天然代謝物HOB；隨后，氨基被結合到HOB 上生成高絲氨酸，高絲氨酸在高絲氨酸激酶與蘇氨酸合成酶的作用下轉化為蘇氨酸；最后，在蘇氨酸醛縮酶的催化下，蘇氨酸裂解為甘氨酸與乙醛。其中，甘氨酸重新進入循環，而乙醛分子經乙醛脫氫酶的催化，生成乙酰輔酶A 并輸出循環。綜上所述，每輪高絲氨酸循環能夠同化2分子甲酸，最終生成1 分子乙酰輔酶A，共計消耗1 分子NADH與3 分子ATP。高絲氨酸循環是在改良絲氨酸循環的基礎上，對天然絲氨酸循環進行的更深層的優化，具有明顯的優勢：以甲醛替代CO2進入同化路徑，改善了羧化反應所造成的限速作用，減少了還原力的使用，有利于支持更高的生物量產量；該循環路徑所涉及的酶均為E. coli的內源酶，保證了酶的催化活性；相比于絲氨酸循環，該循環所包含的酶促反應較少，且與中心代謝途徑的重疊也較少［59］。然而，甲醛與高絲氨酸對E. coli都具有一定的毒性作用。因此，深入探究E. coli的毒性機理與解毒機制［86?88］，對于進一步優化高絲氨酸循環具有重要意義。

2.2.4 重組THF循環?反向甘氨酸裂解途徑

近年來，依賴于RG 路線的rGly 途徑已被應用于多種微生物的代謝改造。在這些研究中，rGly途徑通常被分為兩個模塊［圖4（d）］：重組THF循環（reconstructed THF cycle，rTHF）模塊與反向甘氨酸裂解（reverse glycine cleavage，rgcv）模塊。通過組合rTHF 模塊與rgcv 模塊，驗證了甲酸同化在E. coli中的可行性。隨后，rTHF?rgcv 途徑以及關鍵模塊被進一步從E. coli拓展到多種微生物中，通過組合和優化異源路徑酶與微生物內源酶之間的適配性，實現了rTHF?rgcv 途徑在多種微生物中的應用（表3），從而證明了該途徑所具有的優勢與工業應用潛能。

表3 rTHF?rgcv途徑的路徑酶來源Table 3 Source of pathway enzymes of the rTHF?rgcv pathway

2.3 人工設計甲酸利用路徑

隨著計算機輔助路徑設計［90］與酶工程［91?92］等技術的發展，研究人員在開發新型甲酸利用路徑（圖5）時不再局限于自然界已有的酶促反應，這不僅有利于簡化甲酸利用路徑，而且還能夠拓展甲酸營養型微生物的改造空間。

圖5 人工設計甲酸利用路徑Acdh-乙醛脫氫酶；Acs-乙酰輔酶A合成酶；Acps-乙酰磷酸合成酶；Dhak-二羥基丙酮激酶；Fls-甲醛酶；Gals-乙醇醛合成酶；Pta-磷酸轉乙酰酶（綠色底色的化合物為路徑底物，粉色底色的化合物為路徑產物）Fig. 5 Artificial formate?utilizing pathwaysAcdh-acetaldehyde dehydrogenase; Acs-acetyl?CoA synthase; Acps-acetyl phosphate synthase;Dhak-dihydroxyacetone kinase; Fls-formolase; Gals-glycolaldehyde synthase; Pta-phosphate acetyltransferase(compounds with a green background are pathway substrates, compounds with a pink background are pathway products)

2.3.1 甲醛酶途徑

以熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的苯甲醛裂解酶為基礎，設計并優化獲得了一種新酶：甲醛酶（formolase）［93］。在此基礎上，重構了一條新型甲酸同化路徑，即甲醛酶途徑（formolase pathway），該途徑由四步酶促反應組成［圖5（a）］：首先，甲酸在乙酰輔酶A 合成酶與乙醛脫氫酶的作用下轉化為甲醛；其次，在甲醛酶的催化作用下，3 分子甲醛縮合生成1 分子二羥基丙酮；最后，二羥基丙酮在二羥基丙酮激酶的作用下轉化為微生物的中心代謝物磷酸二羥丙酮。綜上所述，該路徑能夠同化3 分子甲酸生成1 分子磷酸二羥丙酮，共計消耗3 分子NADH 與4 分子ATP。甲醛酶路徑為線性反應路徑，僅需4 種酶即可完成路徑催化，然而，甲醛酶的酶促反應效率比較低，從而限制了該路徑的應用潛能。通過酶工程策略對甲醛酶途徑的甲醛酶與乙醛脫氫酶進行改造，能夠有效提高該路徑對甲酸的利用效率［94?95］。

2.3.2 合成乙酰輔酶A途徑

通過定向進化P. putida的苯甲酰甲酸脫羧酶，獲得了乙醇醛合成酶（glycolaldehyde synthase）［67］。在此基礎上，構建了一條合成乙酰輔酶A 途徑（synthetic acetyl?CoA pathway），該途徑僅有3 步酶促反應［圖5（b）］：首先，在乙醇醛合成酶的作用下，兩個甲醛分子縮合生成1 分子乙醇醛；其次，在乙酰磷酸合成酶的催化下，實現了乙醇醛到乙酰磷酸的轉化；最后，乙酰磷酸在磷酸轉乙酰酶的催化下生成乙酰輔酶A。綜上所述，該路徑能夠同化2 分子甲醛生成1 分子乙酰輔酶A，且不存在ATP與還原力的消耗。合成乙酰輔酶A途徑同樣為線性反應路徑，僅需3種酶即可完成路徑催化。然而，該途徑尚未被拓展到直接利用甲酸作為路徑的起點，尚需參考甲醛酶途徑以實現甲酸到甲醛的轉化。另外，由于甲醛毒性以及乙醇醛合成酶和乙酰磷酸合成酶對底物的親和力比較差，因此在E. coli中引入合成乙酰輔酶A途徑后，菌株的生物量偏低［67］，從而限制了該路徑在現階段的應用范圍。

3 甲酸利用的代謝工程策略

代謝工程改造在提高微生物細胞工廠的應用方面具有重要意義。甲酸營養型微生物的工業應用主要面臨著甲酸同化路徑效率低、甲酸利用微生物生長速率緩慢等問題。因此，需要開發合適的代謝工程策略，提高甲酸同化路徑的代謝效率，改善甲酸利用微生物的細胞生長，從而推動甲酸生物經濟的發展。

3.1 提高甲酸同化路徑的代謝效率

甲酸同化路徑的代謝效率決定了微生物利用甲酸的效率。然而，不同類型的甲酸利用微生物具有不同的代謝特征，因此，需要選擇合適的代謝工程策略來提高甲酸同化路徑的代謝效率。近年來，提高甲酸同化路徑代謝效率的策略，主要包括：路徑基因表達水平優化、路徑關鍵酶改造、競爭路徑阻斷、輔因子再生系統重構、路徑模塊化優化等。

3.1.1 路徑基因表達水平優化

甲酸同化路徑的構建方式主要包括兩種：一種是將異源路徑基因與微生物的內源基因進行理性組合；另一種是僅對微生物內源基因進行系統優化。然而，上述兩種構建方式均會影響微生物的本源代謝網絡，從而影響甲酸同化效率。因此，需要對路徑基因的表達水平進行合理優化［圖6（a）］。采用的策略主要包括兩種：①選擇合適的異源基因，用于構建甲酸同化路徑。例如，當在E. coli中引入甲酸四氫葉酸連接酶（Ftl）、次甲基四氫葉酸環水解酶（Fch）和亞甲基四氫葉酸脫氫酶（Mtd）等基因構建THF 循環［圖4（d）］時，同時將源自C. ljungdahlii和A. woodie的基因操縱子Cl和Aw 分別引入絲氨酸營養缺陷型菌株中，結果顯示Cl 操縱子可以回補菌株的絲氨酸營養缺陷，使其以甲酸為碳源進行生長，但是Aw 操縱子卻不能實現上述效果。上述結果表明，Cl操縱子有利于異源Ftl、Fch 和Mtd 以及內源絲氨酸羥甲基轉移酶（GlyA）的催化作用，實現甲酸到絲氨酸的轉化［61］。然而，上述研究所構建的THF 循環對甲酸的同化效率明顯低于源自M. extorquens的THF 循環［62?63］，這也進一步證明了選擇合適的異源基因對于構建甲酸同化路徑的重要性。②優化路徑基因水平，實現路徑與宿主的最優適配。例如，采用高拷貝數、中拷貝數和低拷貝數的質粒，在E. coli中表達Ftl、Fch、Mtd 與兩種甲酸脫氫酶，結果顯示含有低拷貝數質粒的菌株生長速率明顯高于中含有高拷貝數的菌株。上述結果表明，低拷貝數質粒有利于實現菌株路徑基因的最優表達［18］。除了利用不同拷貝數的質粒外，啟動子工程也可以用于優化路徑基因表達水平。例如，通過將不同啟動子組合的質粒pC1（表達Ftl、Fch、Mtd）和pC2（表達GCS）分別導入E. coli甘氨酸營養缺陷型菌株，結果顯示當采用弱啟動子時菌株生長最好。上述結果表明，弱啟動子組合有利于實現路徑基因的最優表達［16］。另外，值得注意的是，雖然使用質粒過表達路徑基因相對簡捷，但是過多質粒的使用會影響微生物的生長，相比而言基因組的過表達更加穩定。例如，首先在E. coli的基因組上過表達GCS，隨后導入rTHF 循環，獲得了菌株E. coliRG3。與使用質粒過表達GCS 的菌株E. coliRG2相比，E. coliRG3 具有更高的生長速率與產物產率［63］。

圖6 提高甲酸同化效率的關鍵方法FDH-甲酸脫氫酶；Hint-H蛋白的氨甲基化形式；Hox-H蛋白的氧化形式；Hred-H蛋白的還原形式；TCA cycle-三羧酸循環；THF-四氫葉酸Fig. 6 Key methods to improve the efficiency of formate assimilationFDH-formate dehydrogenase; Hint-aminomethylated form of H protein; Hox-oxidized form of H protein;Hred-reduced form of H protein; TCA cycle-tricarboxylic acid cycle; THF-tetrahydrofolate;

3.1.2 路徑關鍵酶改造

甲酸同化路徑的代謝流通量受到路徑關鍵酶活性的直接影響。因此，結合路徑關鍵酶的催化特點并進行理性改造，能夠減少甚至消除路徑表達的限制性因素，從而提高甲酸同化路徑的催化效率。以rTHF?rgcv 途徑的關鍵酶GCS 為例，GCS是由四種蛋白質（T/H/P/L）組成的多酶復合體，催化的甘氨酸代謝為可逆反應［圖6（b）］，但是在E. coli等多數微生物中的GCS更傾向于催化甘氨酸的裂解而非合成，因此，在構建rTHF?rgcv 途徑的過程中，不僅需要改造GCS 的催化反應方向，而且還需要提高GCS 的催化活性。例如，通過在E.coli中過表達內源GCS 和敲除gcvR基因（抑制編碼蛋白T/H/P 的基因轉錄），工程菌株E. coliRG1能夠更好地轉化甲酸與CO2生成甘氨酸，從而證明了改造GCS 有利于提高甲酸同化路徑的代謝通量［63］。

3.1.3 競爭路徑阻斷

由于甲酸同化路徑與微生物的本源代謝網絡存在一定的交叉性，所以不可避免地存在著路徑代謝流的泄露，因此，需要對甲酸同化路徑的競爭路徑進行合理阻斷。以rTHF?rgcv 途徑為例［圖6（c）］，一方面阻斷本源代謝網絡中能夠合成甲酸同化途徑中間產物的路徑。例如，通過在serA基因（編碼3?磷酸甘油酸脫氫酶）缺陷型E.coli中構建rTHF?rgcv 途徑，促進5，10?亞甲基四氫葉酸的合成，使得rTHF?rgcv 途徑的丙酮酸合成通量達到了總丙酮酸合成通量的12.9%，而在未敲除serA基因的菌株中僅為7.3%［63］。另一方面阻斷能夠代謝甲酸同化途徑中間產物的路徑。例如，C.necator能夠通過乙醛酸路徑同化甘氨酸，即甘氨酸先氧化生成乙醛酸，隨后乙醛酸通過甘油酸途徑轉化為生物量。然而，相比于rTHF?rgcv 途徑中的絲氨酸路徑，乙醛酸路徑同化甘氨酸的效率更低，故絲氨酸路徑取代乙醛酸路徑更有利于菌株在甲酸上生長［16］。

3.1.4 輔因子再生系統重構

輔因子NAD（P）H 可以為甲酸同化路徑提供還原力，而甲酸能夠在甲酸脫氫酶（Fdh）的催化下將NAD（P）+轉化為NAD（P）H，從而無需添加其他底物即可完成還原力供應［圖6（d）］。因此，輔因子再生系統重構不僅有利于提高甲酸同化路徑的催化效率，而且對于甲酸營養型微生物的還原力和能量供給至關重要。例如，通過在E. coli中異源引入能夠再生NADH 的Fdh（來自博伊丁假絲酵母Candida boidinii）和能夠再生NADPH 的Fdhmut（來自擬南芥Arabidopsis thaliana），構建了能夠將NAD（P）+轉化為NAD（P）H 的能量再生模塊，結合rTHF?rgcv 途徑，使得工程菌株能夠利用甲酸為唯一碳源和能源進行生長［18］。

3.1.5 路徑模塊化優化

路徑模塊化優化作為一種理性的代謝工程策略，通過將甲酸同化路徑劃分為幾個代謝模塊，并利用相應的營養缺陷型菌株測試各個模塊的活性與限制性瓶頸，通過解除瓶頸最終實現甲酸同化路徑的整體優化與適配［96］［圖6（e）］。例如，借助模塊化工程策略，通過組合rTHF模塊與絲氨酸?蘇氨酸循環，驗證了甲酸同化在E. coli中的代謝可行性［60］。首先，通過在一碳與甘氨酸營養缺陷型菌株中過表達異源Ftl，甲酸能夠回補菌株的一碳營養缺陷，從而證明了一碳模塊的活性；其次，通過在絲氨酸營養缺陷型菌株中過表達rTHF 模塊的Fch/ Mtd 雙功能酶（FolD）與GlyA，工程菌株實現了在甲酸與甘氨酸上進行生長；最后，通過在絲氨酸營養缺陷型菌株中引入絲氨酸?蘇氨酸循環，使工程菌株能夠在甲酸與葡萄糖上進行細胞生長，不再需要提供外源甘氨酸。上述研究為后續甲酸同化路徑的構建提供了重要參考，模塊化工程不僅實現了甲酸營養型E. coli的構建［17］，而且還完成了P. putida甲酸代謝改造［70］等，從而拓展了同化甲酸的底盤微生物。

3.2 改善甲酸利用微生物的細胞生長

為了充分發揮甲酸利用微生物在工業生產中的應用潛能，需要甲酸利用微生物在保持較高細胞生長水平的前提下進行目標產物的高效合成。因此，研究人員采用了一系列代謝工程與生化工程策略用于提高甲酸利用微生物的細胞生長水平，主要包括實驗室適應性進化、強化甲酸營養型微生物的細胞生長、提高微生物協同利用甲酸的能力等。

3.2.1 實驗室適應性進化

實驗室適應性進化（adaptive laboratory evolution，ALE）是工業微生物領域常用的方法之一，能夠在實驗室條件下模擬自然進化對有益的遺傳突變進行富集［97］［圖7（a）］。與理性代謝工程策略相比，ALE 無需對微生物復雜的代謝系統進行改造，不僅在一定程度上減少了工作量，而且還能夠繞開現階段代謝工程改造的理論與技術限制（尤其是非模式微生物）。因此，ALE 在甲酸營養型微生物的構建與應用方面具有明顯優勢，主要包括兩種進化方式：①ALE 用于推動甲酸利用路徑在代謝網絡中的運行，在提高路徑代謝流通量的同時改善菌株的細胞生長［57，64］。例如，在E. coli中引入異源Ftl（來自克氏梭菌Clostridium kluyveri）后，采用Turbidostat 培養方法對菌株進行定向進化，提高了重構rTHF?rgcv 途徑在代謝網絡中的代謝流通量，最終獲得的菌株E. coliG4670和E. coliG4671 能夠利用甲酸和CO2合成甘氨酸和絲氨酸［64］。在此基礎上，通過進一步的長期進化，獲得的菌株E. coliG5222 和E. coliG5225 能夠利用甲酸與CO2為唯一碳源進行細胞生長［65］。②ALE用于提高菌株在甲酸上的細胞生長與代謝能力，主要針對經過一系列代謝改造后具有一定甲酸代謝能力的工程菌株［16?17，70，73］，或者本身不經改造即可天然利用甲酸的菌株（如C. necatorH16［36］）。例如，通過在E. coli中構建rTHF?rgcv 途徑與能量再生模塊，實現了菌株利用甲酸為唯一碳源和能源進行細胞生長。隨后，在補料?分批模式下對菌株進行短期進化，在13 個進化周期內，菌株的倍增時間縮短至不到8 h，生物量產量提高至2.3 g CDW/mol甲酸［17］。在此基礎上，采用類似的進化方式，將菌株的倍增時間進一步縮短至6 h，生物量產量提高至3.3 g CDW/mol甲酸，同時也提高了菌株對甲酸的耐受性［66］。

圖7 改善甲酸利用微生物細胞生長的關鍵方法Fig. 7 Key methods to improve the cell growth of formate?utilizing microorganisms

3.2.2 強化甲酸營養型微生物的細胞生長

對于人工構建的甲酸營養型菌株而言，合適的培養條件對于提高菌株對甲酸的耐受性與利用效率至關重要。甲酸營養型微生物的培養條件優化主要包括兩種方式［圖7（b）］。①培養基成分的調整。例如，基于以甲酸為唯一碳源和能源進行生長的E. coli工程菌株，通過在培養基中添加100 mmol/L的碳酸氫鈉，可以使菌株在更高的甲酸濃度下進行生長，甚至可以耐受300 mmol/L 甲酸。菌株對甲酸耐受性的增加可能是由于含有碳酸氫鹽的溶液具有更好的pH 緩沖性能，從而減少了由于甲酸消耗所引起的生長環境局部pH 波動［17］。②培養過程的優化。例如，通過在E. coli中構建rTHF?rgcv途徑與能量再生模塊，并降低菌株的培養溫度（由37 ℃降至32 ℃），提高了菌株細胞色素Cyo的表達水平并降低了Cyd 的表達水平，使得還原力NAD（P）H 能夠更有效地轉化為ATP，從而解決了菌株生長過程中能量供應不足的問題［18］。

3.2.3 提高微生物協同利用甲酸的能力

利用甲酸與其他碳源對微生物進行共底物培養也是實現甲酸有效利用的方法之一，如甲酸與其他一碳化合物（如甲醇和甲醛等）可以實現協同代謝。在甲酸與甲醇的協同代謝過程中，甲醇脫氫酶能夠催化甲醇轉化為甲醛，而甲醛經甲醛脫氫酶的催化可進一步轉化為甲酸，上述過程均能夠產生還原力，從而為甲酸營養型微生物的生長提供更多能量。然而，傳統碳源（如葡萄糖和蔗糖等）與甲酸的協同代謝具有更大的優勢，不僅有利于傳統生物經濟向甲酸生物經濟的過渡，而且更加適用于現階段的工業應用［圖7（c）］。曼氏產琥珀酸菌（Mannheimia succiniciproducens）是公認的高效生產琥珀酸的菌種之一，以阻斷副產物合成途徑的M. succiniciproducens為底盤微生物，通過過表達源自M. extorquens的甲酸脫氫酶后，實現了工程菌株協同代謝葡萄糖（或蔗糖）和甲酸，使得琥珀酸得率達到了1.41 mol/mol，接近于琥珀酸的最大理論得率1.5 mol/mol［98］。另外，傳統碳源與甲酸的協同代謝也拓展了模式微生物（如E. coli）的工業應用范圍。例如，通過在E. coli中構建能夠協同代謝葡萄糖和甲酸的合成途徑SMGF，使得工程菌株由葡萄糖合成丙酮酸的得率達到了理論糖酵解得率的94%（達到1.88 mol/mol）［95］。

4 結 語

針對微生物利用甲酸的研究，研究人員采用合成生物學與代謝工程等策略，提高了天然甲酸利用微生物的甲酸同化能力，賦予了模式微生物甲酸代謝能力，推動了甲酸生物經濟的發展。然而，目前微生物利用甲酸的研究尚處于初始階段，仍然存在許多不足，例如：微生物利用甲酸的效率偏低，細胞生長速率較慢，目標代謝物產量尚未達到工業化要求等。因此，未來的研究重點可以繼續圍繞甲酸利用的微生物、代謝路徑和代謝工程策略三個方面進行。

在甲酸利用的微生物方面，深入探究天然甲酸利用微生物的甲酸代謝機制，針對微生物的生化特征與代謝特性，開發相應的分子遺傳學操作工具與檢測技術，如高通量測序技術［99］與同位素標記檢測技術［100］等，從而拓展天然甲酸利用微生物的應用空間。目前，模式微生物利用甲酸的研究主要聚焦于E. coli，需要進一步拓展至改造與提高其他模式微生物（如S. cerevisiae與P. pastoris等）的甲酸代謝能力。此外，通過挖掘與開發新型甲酸利用微生物，也能夠進一步拓寬甲酸利用微生物底盤與代謝產物范圍。

在甲酸利用的代謝路徑方面，結合新型的基因編輯工具與路徑酶改造技術，進一步優化現有的甲酸利用路徑與路徑酶。結合生物信息學與計算機算法，進一步設計與構建更加簡單高效的甲酸利用路徑。另外，通過構建微生物細胞微區室等方式，提高氧氣敏感性路徑酶在甲酸同化過程中的可實用性。在E. coli中設計能夠封存丙酮酸甲酸裂解酶和磷酸?；D移酶的微區室，可以有效地將甲酸和乙酰磷酸轉化為丙酮酸［101］。這類微生物細胞微區室的構建，不僅能夠降低其他路徑對甲酸同化路徑的代謝干擾，而且對氧氣敏感性路徑酶在需氧生物中的應用具有重要的借鑒意義。

在甲酸利用的代謝工程策略方面，開發更有效的代謝工程改造策略，優化微生物的甲酸代謝網絡。通過探究sRNA 對微生物基因表達的微調機制，并將該機制應用于微生物的甲酸代謝網絡改造，有利于進一步優化相關基因在甲酸同化過程中的表達水平，從而提高甲酸營養型微生物的甲酸同化效率［102?103］。此外，通過優化甲酸脫氫酶的催化性能、建立能夠評估輔因子再生系統的微生物體內平臺等策略，進一步完善甲酸代謝的能量再生機制。例如，通過在E. coli中敲除二氫硫辛酸脫氫酶基因，消除了丙酮酸脫氫酶和α?酮戊二酸脫氫酶的活性，從而構建了NADH 和ATP 的營養缺陷型菌株，并用于評估NAD+依賴型甲酸脫氫酶和甲醇脫氫酶，為甲酸代謝的能量機制評估提供了一種有效的策略［104］。在此基礎上，進一步采用實驗室適應性進化等策略，提高甲酸利用微生物的工業化生產潛能。