N6-甲基腺苷修飾在腎臟疾病中的研究進展

林 瑤 綜述 曾彩虹 審校

N6-甲基腺苷(m6A)修飾是指在RNA的腺苷N6位點添加一個甲基,是真核 RNA 中最普遍、最豐富和最保守的內部共轉錄修飾,在轉錄后水平的RNA剪接、轉運、穩定性和翻譯等下游分子事件和生物學功能的調節中發揮著關鍵作用。m6A修飾的失調與代謝異常、心血管疾病、糖尿病及腫瘤等有關。最近對人類、動物模型和細胞水平的研究揭示了m6A修飾在腎臟相關疾病中的關鍵作用。全面了解腎臟疾病中m6A調控的復雜性將有助于我們了解腎臟疾病的發病機制。本文簡述了m6A修飾在腎臟疾病中的調節作用及其臨床意義。

m6A修飾

表觀遺傳學是對 DNA、組蛋白和RNA水平的可逆、動態修飾,主要包括DNA甲基化、組蛋白乙?；?、RNA修飾和染色質重排[1]。在表觀遺傳學的修飾中,DNA甲基化和組蛋白修飾已經得到深入研究,而RNA修飾則是一個新興領域。細胞RNA[包括核糖體(rRNA)、轉運RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)和長鏈非偏碼RNA(lncRNA)]中存在100多種轉錄后修飾[2],主要包括 m6A、N1-甲基腺苷 (m1A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿苷(Ψ)、N7-甲基鳥苷(m7G)等,這些修飾在調控RNA的翻譯、穩定、剪切、轉運及定位等方面發揮重要作用[3-4]。

RNA甲基化修飾是真核生物中最常見的RNA修飾類型,占總RNA修飾的60%。其中以m6A 修飾最常見,約占所有甲基化核糖核苷酸的50%。據估計,m6A存在于0.1%～0.4%的腺苷中,能夠修飾哺乳動物細胞中的7 000 多個mRNA[5],被認為是最普遍、可逆和動態的真核mRNA轉錄修飾。

m6A修飾是一種可逆的動態修飾,主要涉及3種蛋白(圖1):甲基轉移酶、去甲基化酶、結合蛋白。其中,甲基基團的安裝是通過高度保守的甲基轉移酶復合物(MTC) 完成的,該復合體包括含有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結合基序的甲基轉移酶3(METTL3)、甲基轉移酶14(METTL14)和穩定MTC定位、底物募集的調節亞基——Wilms腫瘤 1相關蛋白(WTAP)[6-9]。去甲基化酶介導甲基化的逆轉,主要包括ALKB同源物5(ALKBH5)和 ALKB亞家族的肥胖相關基因(FTO),它們以Fe2+和 a-酮戊二酸依賴性方式催化m6A的去甲基化[10]。結合蛋白主要包括 YT521-B 同源結構域家族(YTHDF1/2/3、YTHDC1/2)、異質核核糖核蛋白(HNRNPA2/B1)和胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白(IGF2BP1/2/3),通過識別 m6A 修飾的靶向 RNA 發揮作用[11]。最近的研究表明,m6A修飾普遍存在于真核生物RNA上,且在生理和病理條件下都發揮著重要作用,因此,m6A甲基化修飾在腎臟疾病中的作用機制值得探究。

圖1 m6A甲基化修飾

m6A甲基化修飾與腎臟疾病

越來越多的研究證實m6A甲基化參與腎臟疾病的發生和發展。例如,在順鉑誘導的急性腎損傷(CI-AKI)體內外模型中,發現m6A的水平顯著升高[12]。同時結合CI-AKI小鼠腎組織的RNA甲基化測序(MeRIP-seq)結果、基因調控及GO富集分析和KEGG通路分析,研究人員還發現了顯著改變的m6A修飾主要富集在代謝、細胞死亡、氧化還原和轉運過程中,而這些恰好是CI-AKI的生物學和病理學基礎[13],這為AKI的研究和治療方案的創新提供了新思路。

此外,Wang等[14]發現在慢性腎臟病(CKD)患者外周血單個核細胞中m6A水平顯著降低,為CKD相關細胞功能障礙的潛在機制提供了新的見解。在狼瘡性腎炎(LN)中,研究人員利用LASSO-Logistic回歸分析、單樣本基因集富集分析和基因集變異分析等研究手段發現,m6A調控因子在腎小球中的差異表達最顯著,并與自然殺傷細胞激活、免疫微環境等相關,其中7種m6A相關蛋白被證實與腎小球濾過率(GFR)有顯著相關性,提示其可能是潛在的預后生物標志物,這為LN新治療方案的研發提供了基礎[15]。研究人員還比較了正常葡萄糖耐受者、2型糖尿病(T2DM)患者和糖尿病腎病(DN)患者尿液中m6A水平,發現DN患者尿液中m6A水平發生了顯著下調,并隨DN的惡化而進一步降低,這提示尿液中m6A水平可作為診斷DN的前瞻性生物標志物[16]。同時,Yin等[17]利用GEO數據庫中的差異表達基因、CIBERSORT算法和加權基因共表達網絡分析篩選出DN患者m6A甲基化相關的43個關鍵基因,其中一些關鍵基因的異常表達與腎臟肥大、蛋白尿和腎小球硬化的發生有關,為DN的診斷和治療提供了依據。此外,還有研究證實了多種m6A調控因子,如WTAP、RBM15、FTO等能夠調節各種lncRNA的甲基化和表達,影響M1巨噬細胞的表達,參與DN的炎癥和免疫過程[18]。

盡管m6A在腎臟疾病中的作用、機制和潛在靶點備受關注,但目前對m6A的研究仍處于初步和前沿探索階段,靶點的功能復雜且不確定。因此,全面描述m6A與腎臟疾病的相關性,即其在腎臟疾病相關的細胞過程中特定位點的改變,有望為腎臟疾病潛在靶點的識別和治療策略的建立提供重要指導。

甲基轉移酶與腎臟疾病

METTL3 最近,Wang等[19]在AKI患者腎活檢組織和體內外模型中發現了METTL3表達的上調,并且上調的METTL3通過依賴IGF2BP2的方式增強了轉化生長因子β(TGF-β)激活激酶1結合蛋白3(TAB3)mRNA的m6A修飾,增強了TAB3 mRNA的穩定性以促進其表達,通過促進炎癥反應加速AKI的進展;同時,METTL3的遺傳學和藥理學抑制均能夠減輕腎臟炎癥和損傷,表明METTL3/TAB3軸是治療AKI的潛在靶點。還有一項研究表明,METTL3能夠直接結合mmu-lncRNA 121686和hsa-lncRNA 520657的m6A位點,并增強其修飾和表達,從而促進lncRNA對miR-328-5p的直接抑制作用,加重了高溫需求因子a3(Htra3)介導的管狀上皮細胞凋亡和缺血性、膿毒癥和萬古霉素誘導的AKI。這一發現再次驗證了METTL3介導的m6A修飾在AKI進展中的靶點潛力和干預價值[20]。

Liu等[21]在梗阻性腎病(ON)患者腎纖維化組織中發現了人肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)表達的上調,緊接著他們利用RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)、RNA甲基化免疫共沉淀 (MeRIP)、生物信息學分析和熒光素酶報告基因實驗證實,METTL3介導的MALAT1的m6A修飾能夠促進MALAT1的表達,從而通過MALAT1/miR-145/FAK通路參與TGF-β1誘導的體內和體外腎纖維化。因此,調控METTL3能夠以m6A依賴的方式激活MALAT1/miR-145/FAK軸,從而促進腎臟纖維化,這為ON的研究提供了新的線索。此外,在ON體內體外模型中,研究人員發現高表達且核局域化的METTL3也能在HNRNPA2B1的協助下介導pri-miR-21多個位點的m6A修飾,從而能夠促進迪喬治綜合征危象區基因8(DGCR8)對pri-miR-21的招募、切割和成熟以及miR-21-5p的形成。隨后,miR-21-5p激活SPRY1/ERK/NF-κB信號通路,驅動炎癥,促進管狀結構塌陷、膠原沉積和ON[22]。上述研究結果為探索腎臟纖維化提供了更深入的見解,顯示靶向調控因子介導的m6A修飾在腎臟纖維化治療中的重要潛力。

Jiang等[23]在DN患者和糖尿病小鼠的腎臟中發現了METTL3介導的m6A修飾的顯著上調。并且還發現METTL3通過依賴IGF2BP2的方式促進了組織金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP2)mRNA的m6A修飾,增強了TIMP2 mRNA的穩定性,促進其翻譯。而TIMP2的上調能夠激活Notch信號通路,誘發足細胞凋亡和炎癥反應,引起足細胞損傷和丟失,促進蛋白尿和腎小球病變,從而促進DN進展。因此干預METTL3的表達對足細胞損傷、腎臟炎癥和蛋白尿的產生以及DN的發展具有潛在價值。

此外,還有研究發現,飲食中限制蛋氨酸或SAM的攝入會顯著降低METTL3的表達,從而降低c-Myc和精氨酸加壓素受體2(Avpr2)mRNA的m6A水平,抑制其翻譯和信號傳導,最終抑制蛋白質合成和囊腫增殖[24]。通過飲食限制靶向調控METTL3和m6A修飾,為多囊腎以及腎臟疾病的治療提供了一種新的策略和獨特的見解。

METTL14 研究發現METTL14通過m6A依賴性機制增強Yes相關蛋白1(YAP1)mRNA的甲基化,并通過加速YAP1 mRNA的衰減來降低其表達水平,從而抑制YAP1-TEAD信號,促進缺血缺氧性AKI的進展[25]。Lu等[26]在局灶節段性腎小球硬化和DN患者腎活檢樣本及蛋白尿性腎病的體內體外模型中發現了m6A 和METTL14水平的顯著上調;更深入的研究表明,METTL14通過YTHDF2依賴的方式增加了抗衰老酶1(Sirt1)mRNA的m6A修飾,引起Sirt1 mRNA的降解和蛋白表達的下調。而Sirt1的下調會抑制自噬,促進足細胞凋亡和炎癥反應,最終加重DN中蛋白尿和足細胞病變的進展。Xu等[27]還發現低水平的METTL14能夠直接降低磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(PTEN)mRNA的甲基化,導致PTEN mRNA和蛋白水平的顯著下調,從而激活PI3K/Akt信號通路,引起組蛋白脫乙?；?(HDAC5)的上調并促進其所介導的小管細胞上皮間質轉化(EMT)和DN進展。此外,METTL14還能增強α-klotho mRNA的m6A修飾,抑制其mRNA和蛋白表達,從而加重高糖誘導的腎小球內皮細胞損傷和炎癥,促進DN進展[28]。METTL14的敲除或過表達可通過m6A依賴機制逆轉異常變化,故靶向METTL14介導的m6A有望成為治療腎臟疾病足細胞和小管細胞損傷的靶點。

去甲基化酶與腎臟疾病

FTO在CI-AKI的體內外研究中,FTO抑制劑甲氯芬那酸(MA)能夠進一步降低受抑制的FTO,增強m6A修飾,促進p53 mRNA和蛋白的表達,加速腎小管細胞凋亡和AKI的發生[12]。相反,FTO的過表達可降低m6A修飾水平和p53蛋白表達,最終減少腎小管凋亡和逆轉腎損傷。此外,FTO還被發現通過影響多個基因的m6A修飾,促進纖維化反應、EMT和ON的發展[29];Li等[30]在TGF-β1處理的細胞模型和單側輸尿管梗阻的小鼠模型中,發現FTO mRNA和蛋白質表達的上調,能夠減少lncRNA GAS5的m6A修飾,促進人腎皮質近曲小管上皮細胞(HK-2)的EMT和炎癥反應,引起腎臟間質纖維化。在酒精誘導的腎臟損傷中,FTO的低表達以YTHDF2依賴的方式增加過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)mRNA的m6A修飾,最終導致NLRP3炎癥小體的激活和腎臟中NF-κB驅動的炎癥反應[31]。在T2DM患者外周血中發現FTO mRNA表達水平升高,而m6A顯著降低,提示低表達的m6A可能是T2DM的一種新的潛在生物標志[32]。最近,Sun等[33]對DN患者腎組織進行組織病理學的高維度單細胞分析以及成像質譜流式分析,發現FTO的顯著減少抑制了細胞因子信號傳導抑制蛋白1(SOCS1)mRNA和蛋白質的表達,促進Janus激酶2(JAK2)和信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)的磷酸化,引起腎臟的炎癥反應和損傷。以上這些研究為與m6A相關腎臟疾病的治療提供了新的潛在靶點和證據。然而,還需要更深入的實驗來驗證。

ALKBH5最近的一項研究表明[34],在ON小鼠模型中,低水平的ALKBH5會增加腎組織總m6A水平,從而促進EMT和炎癥病理過程,最終影響腎臟間質纖維化。此外,染料木黃酮可減少腎組織中ALKBH5的損失,減少總m6A修飾,從而在一定程度上降低腎纖維化相關蛋白的表達、EMT和炎癥反應,從而抑制ON的進展。重要的是,這些變化與沉默和過表達ALKBH5的結果是一致的,進一步顯示了ALKBH5在阻塞性腎纖維化研究中的潛力。然而,目前還缺乏對其完整的全鏈機制的探索。

結合蛋白與腎臟疾病

結合蛋白主要與發生了m6A甲基化修飾的位點結合,從而介導其功能的實現。目前對結合蛋白的研究主要是在甲基轉移酶和去甲基化酶的基礎上開展的。然而,最近有研究表明,閱讀蛋白在腎臟纖維化過程中起著重要作用。在阻塞性和大劑量葉酸誘導的纖維化腎臟中,YTHDF1的表達顯著升高,并與纖維化程度和YAP水平呈正相關[35]。在此基礎上,降低YTHDF1可顯著抑制YAP的表達,抑制纖維化相關分子的上調,從而緩解纖維化進展,這提示抑制YTHDF1可能是緩解腎臟纖維化的潛在靶點。

總結和展望

m6A是RNA最主要的表觀遺傳修飾類型,幾乎參與RNA代謝的所有過程。大量的研究表明其參與多種疾病的發生和發展,為相關疾病的臨床早期防治提供了靶點和方向。高糖、氧化應激、腎毒性物質等刺激能夠引起腎臟內m6A修飾水平的改變,通過調控 RNA的轉運、穩定性和可變剪接等,引起細胞狀態及內環境的改變,這些生物學功能改變與AKI、ON、DN等疾病的進程密切相關。雖然目前 m6A修飾與腎臟疾病的聯系仍有許多空白有待填補,其在相關疾病中的具體作用和分子機制也有待闡明,但是隨著對表觀遺傳學的了解以及高通量測序技術的發展,相信未來靶向m6A修飾因子的研究可以為腎臟疾病的診斷、治療及預后評估提供幫助。