6株鴨源沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗

劉 莉,董洪燕,朱善元*,張 燕,鄭東宇

(1.江蘇農牧科技職業學院,江蘇泰州 225300;2.揚州大學獸醫學院,江蘇揚州 225009;3.江蘇省疾病預防控制中心,江蘇南京 210009)

沙門氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌之一[1],可污染食品和引起食物中毒[2],其血清型超過2 500種,具有重要的公共衛生學意義。鴨源沙門氏菌病是由一種或者幾種沙門氏菌(主要包括鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌等)引起的急性或慢性疾病的總稱[3]。經研究表明,鴨源沙門氏菌感染在鴨的原發性,繼發性或者混合感染中也較為嚴重,給養鴨業帶來巨大的經濟損失[3]?？咕幬镌邙喖毦》乐沃衅鹬匾饔?但因臨床的不規范使用,造成鴨源沙門氏菌多重耐藥現象的頻繁發生[4],這也給鴨源細菌病的防控帶來挑戰,因此加強鴨源沙門氏菌耐藥性監測,對臨床治療以及控制該病的流行提供依據。細菌分子分型可用于追溯不同來源或不同地區細菌分離株之間的流行病學關系,為細菌病的防控奠定基礎,目前脈沖場凝膠電泳分子分型法(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)仍是國際上細菌分子分型的金標準[5]。本研究采自徐州不同養鴨場患病鴨的病料,進行細菌分離鑒定、藥敏試驗。旨在分析6種鴨源沙門菌的血清型、耐藥性以及基因分型情況,同時建立徐州市鴨源沙門氏菌基因數據庫,從而為該市的沙門氏菌病的溯源和預警提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料為2020年不同養鴨場的發病鴨的心臟、肝臟、腎臟等。

1.1.2 主要試劑 LB培養基、麥康凱培養基、MH培養基,陸橋公司產品;GN生化鑒定卡,法國梅里埃公司產品;2×ESTaqMaster Mix,北京康為世紀公司產品;DNA Marker、XbaⅠ,TaKaRa公司產品;沙門氏菌診斷血清,泰國S&A公司產品;藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司產品;Sodium Lauroyl Sarcosine、SDS、蛋白酶K,Amresco公司產品;SeaKem Gold Agarose瓊脂糖,Lonza公司產品;5×TBE、Tris-cl、EDTA,索萊寶公司產品;GelRed染劑,Biotium公司產品。

1.1.3 主要儀器設備 PCR儀、瓊脂糖水平電泳儀、CHEF Mapper電泳儀以及凝膠成像系統,美國Bio-Rad公司產品;比濁儀、VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統,法國梅里埃公司產品;高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離鑒定 用接種環無菌采取患病鴨心臟、肝臟、腎臟等病料劃線接種于麥康凱鑒別培養基中,37℃培養24 h觀察菌落形態,再挑取疑似菌株分別轉接于TSB培養基,37℃、180 r/min培養18 h,其鑒定的方法按吳曉君等方法進行[6],其PCR結果送擎科生物科技有限公司測序后進行序列的比對分析。

1.2.2 生化和血清學鑒定 將分離到的6株鴨源沙門氏菌運用GN生化鑒定卡經VITEK微生物生化鑒定儀進行鑒定;血清型按泰國S&A公司沙門氏菌診斷血清試劑盒相關步驟以及結果判定標準進行判定。

1.2.3 藥敏試驗 采用世界動物衛生組織推薦的瓊脂擴散法 進行,首先選取27種藥敏紙片包括氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢吡肟、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、四環素、諾氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、氯霉素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、復方新諾明、磺胺異噁唑、多黏菌素B、克林霉素、利福平和甲氧芐氨嘧啶,再將分離株新鮮菌液涂布于MH瓊脂平板,用無菌鑷子將藥敏片貼于培養基表面,37℃培養24 h,同時設大腸埃希菌ATCC 25922作對照,根據判定結果分為敏感株、中介(中等耐藥株) 、耐藥株。

1.2.4 PFGE分型 參照美國PulseNet公布的沙門氏菌PFGE標準化方案進行[7],將沙門氏菌分離株經 SeaKemGlod Agarose包埋后,運用限制性內切酶XbaⅠ酶切后進行脈沖場凝膠電泳,最后經Gelred染色成像經Bionumerics5.1軟件聚類分析。

2 結果

2.1 細菌的分離鑒定

經PCR鑒定結果(圖1)表明,6株分離株均擴增出250 bp的目的條帶,經測序比對分析結合生化試驗結果(葡萄糖、麥芽糖、甘露醇產酸產氣,MR和枸櫞酸鹽試驗為陽性,不發酵乳糖、蔗糖,吲哚和VP試驗為陰性),表明共分離到6株沙門氏菌。

M.DNA標準DL 2 000; 1～6.鴨源沙門氏菌分離菌株

2.2 血清學鑒定

6株鴨源沙門氏菌分離株經血清型鑒定,結果表明3株為鼠傷寒沙門氏菌,占50%;剩余3株分別為切徹斯沙門氏菌(16.67%)、圖莫迪沙門氏菌(16.67%)、格洛斯特沙門氏菌(16.67%)。

2.3 藥敏試驗結果

6株鴨源沙門氏菌運用21種常用抗菌藥物藥敏試驗結果(表1)顯示,6株鴨源沙門氏菌對克林霉素耐藥性最高,為100%,其次是頭孢吡肟、頭孢拉定、慶大霉素、紅霉素、復方新諾明、多黏菌素B,為66.67%;對甲氧芐氨嘧啶最敏感,達100%,其次是氯霉素、四環素,達83.33%。

表1 6株鴨源沙門氏菌分離株對不同藥物的敏感性比例

6株鴨源沙門氏菌分離株都具有多重耐藥性(圖2),最高達18種抗菌藥物耐藥,多重耐藥性達5重及以上的,占100%。

圖2 鴨源沙門氏菌多重耐藥性圖

2.4 鴨源沙門氏菌PFGE分型

6株鴨源沙門菌的 PFGE 圖譜經 Bionumerics5.1 軟件分析表明(圖3),共6種帶型,相似度達 53.8% 以上。3株鼠傷寒沙門氏菌(2020XZ-1SM、2020XZ-2SM、2020XZ-3SM)共有3種帶型,相似度達53.8%,其中2020XZ-2SM和2020XZ-3SM相似度達78.3%;而3種不同血清型的分離株相似度達62.9%,其中2020XZ-4SM和2020XZ-6SM相似度達76.9%。

3 討論

沙門氏菌是重要的人畜共患病病原之一。攜帶沙門氏菌的動物性食品包括肉、蛋類等也是沙門氏菌傳播的重要傳染源,鴨肉具有低脂肪和高蛋白的特點,更有利于沙門氏菌的存在[8];同時鴨獨特的生活特性使其更容易成為隱性帶菌者[1],因此,加強鴨源沙門氏菌病的研究具有重要意義。本研究通過PCR鑒定結合生化試驗,確定共分離到6株鴨源沙門氏菌。血清學試驗表明6株沙門氏菌分離株的優勢血清型為鼠傷寒沙門氏菌,這與其他地區不同[9],具有區域性。

沙門氏菌病在臨床治療時,因使用抗菌藥物的廣泛使用以及濫用導致其耐藥性特別是多重耐藥性在世界范圍內暴發并擴散,給全球公共衛生帶來了巨大威脅[10]。研究發現河南與浙江地區沙門氏菌分離株對頭孢哌酮、四環素、諾氟沙星、吡哌酸、甲氧芐氨嘧啶耐藥率高[11];對四川遂寧某鴨場分離的沙門氏菌進行耐藥性試驗表明,4 株沙門氏菌分離株對四環素、復方新諾明、阿莫西林耐藥性最高[2];對云南不同地區鴨源沙門氏菌分離株研究表明,其對林可霉素、青霉素、土霉素、強力霉素、紅霉素、羅紅霉素耐藥[12]。本研究6株鴨源沙門氏菌分離株主要對林可酰胺類(克林霉素)耐藥性最高,其次是對頭孢類(頭孢吡肟、頭孢拉定)、氨基糖苷類(慶大霉素)、大環內酯類(紅霉素)、磺胺類(復方新諾明)以及多肽類(多黏菌素B),同時多重耐藥性嚴重,達100%;對甲氧芐氨嘧啶、氯霉素、四環素較敏感。因此,各地區耐藥譜和多重耐藥性情況都存在差異,這跟各地藥物選擇、藥物使用頻率和藥物使用合理度都有關,通過藥敏試驗選擇合適的抗菌藥物仍是治療鴨源沙門氏菌的最佳選擇。

PFGE是一種非常有效的細菌分子分型的方法,可用于分析不同來源或不同地區菌株之間的遺傳多樣性,從而發現暴發、識別傳染源(污染源)及推測流行范圍[13]。對廈門139株不同來源的沙門氏菌進行分子分型表明優勢帶型為PT51,包含的菌株均為腸炎沙門氏菌帶型[14];對90株人源沙門氏菌進行PFGE分型發現以鼠傷寒沙門氏菌以及腸炎沙門氏菌的帶型為主[15]。本研究的6株鴨源沙門氏菌分離株共6種帶型,基因型成多樣性,相似度大于50%,具有流行相關性,但目前未有暴發流行株,這可能與本研究分離的菌株較少,未得出該地區的鴨源沙門氏菌的流行趨勢有關,試驗也將繼續收集鴨源沙門氏菌,努力豐富該地區的鴨源沙門氏菌數據庫,爭取為鴨源沙門氏菌的防控提供更多依據。