脂多糖對牛乳腺上皮細胞自噬和凋亡的影響

張 興,高英魁,郝中華,劉靜靜,張華強,歸 榮,張珂菲,周廣薇,鄧立新,王學兵,2*,童 超,2*

(1.河南農業大學動物醫學院,河南鄭州 450002;2.河南農業大學動物免疫學國際聯合研究中心,河南鄭州 450046)

奶牛乳腺炎給奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失[1],造成產奶量降低、奶牛淘汰和治療費用等。發病因素主要以細菌性感染為主,分為傳染性和環境性乳腺炎。前者主要由大腸埃希氏菌(E.coli)、鏈球菌(S.aureus)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)和支原體(Mycoplasma)感染等。在擠奶過程中,通過手、毛巾或者被細菌污染的擠奶器將將病菌傳染給了健康母牛。環境性乳腺炎發病原因主要是奶牛周圍環境的污染,如墊料、土壤、排泄物、污水等[2]。該病發病率高流行廣泛,對全球奶牛生產都產生了嚴重的影響[1]。據統計,奶牛乳腺炎的發病率高達50%,且在全球每年造成的損失高達約350億美元[3]。預防和治療奶牛乳房炎是國內外亟待解決的問題。

脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是一種位于革蘭氏陰性菌細胞壁上的糖脂質,包括核心多糖、類脂A和O-抗原[4],是革蘭氏陰性菌的主要致病性物質。類脂A是 LPS的關鍵毒性部位,它能誘導細胞對 LPS產生應答,進而導致炎癥和細胞凋亡。細胞外LPS的刺激可以被細胞膜上的TLR4/MD-2受體復合物識別,使髓樣分化因子 88與TLR4結合,導致NF-κB活化后進入細胞核內誘導特定基因的轉錄和表達,從而引起炎癥反應和細胞凋亡信號的活化[5-7]。LPS的刺激可以激活促凋亡因子BAK、BAX過表達,導致細胞色素C和其他蛋白進入細胞質,活化caspase-3、caspase-9引起細胞凋亡[8-9]。也有其他研究表明,LPS可通過TIR結構域銜接蛋白信號途徑誘導上皮細胞凋亡,TIR結構域銜接蛋白的連接蛋白IRAK-1能與Fas死亡結構域相關蛋白結合,激活 caspase凋亡相關蛋白酶,從而誘導細胞凋亡[10-12],但是LPS誘導上皮細胞凋亡的確切機理尚待深入探討。

細胞自噬在演化過程中表現出高度的保守性,其發生和發展受許多與自噬相關的基因控制[13]。哺乳動物的自噬誘導機制主要是由Atg12的結合和LC3的修飾作用引起的[14]。Atg12的結合作用是一個類似泛素化的過程,需要泛素活化酶E1、E2的參與。Atg12先被Atg7 (E1樣酶)激活,然后用Atg10(E2樣酶)將其轉移到Atg5,最終與Atg16結合形成多聚體復合體,并參與自噬擴展[15-16]。LC3 前體形成后,被Atg4 加工成胞漿可溶性的 LC3-Ⅰ,在Atg7和Atg3的作用下形成LC3-Ⅱ參與自噬體膜的延伸直到自噬溶酶體的形成,因此LC3-Ⅱ被作為自噬形成的標志物,也是目前唯一發現定位于自噬泡膜上多種信號傳導的調節蛋白[17-18]。本試驗以不同濃度的LPS處理MAC-T細胞誘導自噬和凋亡,檢測LPS對MAC-T細胞自噬和凋亡的影響,為大腸埃希氏菌誘導牛乳腺炎發生機制的研究提供參考,為臨床應用奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 牛乳腺上皮細胞(MAC-T)來自河南農業大學生理生化實驗室。

1.1.2 主要試劑 連翹酯苷A(純度>98%),成都普飛德生物科技有限公司產品;脂多糖(LPS),美國Sigma公司產品;Trizol、反轉錄試劑盒,南京諾唯贊公司產品;2×RealStar Fast染料法qPCR預混液,北京康潤公司產品;qPCR引物,上亞生物科技有限公司產品。試驗所用抗體LC3α/β、P62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3,萬類生物科技公司產品。

1.1.3 主要儀器 CO2培養箱,美國Thermo公司產品;冷凍離心機,Eppendorf公司產品;超凈工作臺,蘇州金燕凈化設備廠產品; 酶標儀,Tecan公司產品;倒置相差顯微鏡,Leica公司產品; 蛋白電泳儀,Bio-Rad公司產品;qPCR設備,德國Analytik-Jena公司產品;顯影儀,上海Tanon公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組 試驗前從液氮罐中取出凍存的MAC-T牛乳腺上皮細胞,復蘇后在含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養液、37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。2～3 d傳代1次,取處于對數生長期MAC-T細胞用于自噬和凋亡模型的建立,用 LPS(0、50、100、200 μg/mL)不同濃度處理MAC-T細胞12 h,查看自噬和凋亡基因和蛋白的表達。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力 按細胞計數板法計數,以1×104細胞/cm2的密度將MAC-T細胞接種于96孔板。根據使用說明,采用CCK-8試劑盒對細胞活性進行測定。將 LPS加入到細胞中12 h和24 h后,加入10 μL CCK-8溶液在37℃的遮光環境中培養1 h～4 h。用酶標儀測定450 nm波長的吸光度,檢測細胞的活性。

1.2.3 LDH法檢測細胞上清液中乳酸脫氫酶含量 以1×104細胞/cm2的密度將MAC-T細胞接種于96孔板,收集細胞培養液并以1 100 r/min離心5 min,取20 μL培養液上清于全新的96孔板中。向各孔中加入25 μL基質緩沖液和5 μL輔酶溶液,輕微震蕩混勻后,放入37℃恒溫水浴鍋溫浴15 min。加入25 μL 2,4-二硝基苯肼混勻后繼續37℃水浴15 min。加入250 μL 0.4 mol/L的NaOH溶液混勻,室溫靜置5 min。使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度,每個處理組6個重復,取平均值記錄。按照說明書要求將2 μmol/mL的丙酮酸標準品用雙蒸水分別稀釋200倍、100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍,按照上述操作測得吸光度后繪制標準曲線。計算各處理組LDH的含量。

1.2.4 RT-qPCR(熒光定量PCR) 用移液槍吸棄4組樣本的細胞培養上清,用PBS洗細胞2次,加入1 mL Trizol溶液,吹打混勻,靜止10～15 min使細胞充分裂解。裂解后的細胞移到1.5 mL的EP管中,12 000 r/min、4℃離心5 min,移液槍吸取上清液至新的1.5 mL的EP管中,管中加0.2 mL氯仿,混勻,靜置,12 000 r/min、4℃離心15 min,加1 mL異丙醇,混勻,靜置,12 000 r/min、4℃離心10 min,接下來棄上清,加入1 mL的DEPC水配制的750 mL/L的乙醇,7 500 r/min、4℃離心5 min,用移液槍小心的把上層乙醇吸出只留下沉淀,將EP管倒扣在吸水紙上使乙醇揮發,加20 μL的DEPC水將沉淀溶解,測定各樣品RNA濃度,4組樣品濃度稀釋至1 000 ng/μL,根據反轉錄體系合成cDNA。采用兩步法進行RT-qPCR擴增。20 μL體系,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,2×RealStar Fast染料法qPCR預混液10 μL,無菌無酶水8 μL,以上所有步驟均在冰上進行,引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.5 蛋白質免疫印跡分析 使用RIPA裂解液提取細胞的總蛋白,用BSA試劑盒測定總蛋白濃度,在SDS凝膠電泳每孔上樣30 μg進行電泳后,將蛋白轉印到PVDF膜上,在37℃下用50 g/L的脫脂奶粉進行封閉,一抗孵育4℃過夜,用二抗孵育1 h,然后用ECL顯色液檢測膜上的信號,并通過Tanon 5200收集數據。

1.3 數據處理

數據采用SPSS 24.0進行統計分析,各組試驗數據均用“平均值±標準差”表示。組間比較采用單因素方差分析,差異顯著性以P<0.05表示。

2 結果

2.1 細胞活性的測定

在12 h處理組中,50 μg/mL～100 μg/mL LPS處理細胞活力無明顯變化,在150、200、250 μg/mL處理下細胞活力顯著下降。在LPS 24 h處理組中,50、100、150、200、250 μg/mL LPS處理下MAC-T細胞活力顯著下降(圖1)。表明MAC-T細胞的活力會隨著LPS濃度和處理時間增加而下降。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 LPS對MAC-T細胞上清LDH的含量影響

與對照組相比,用50、100、150、200、250 μg/mL LPS處理的細胞,細胞上清中的LDH顯著升高,呈現出梯度依賴性,表明隨著LPS濃度的增加,對細胞的損傷程度加重(圖2)。

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.3 LPS對MAC-T細胞核形態的影響

Hoechst33342染色觀察不同濃度的LPS(0、50、100、200 μg/mL)處理12 h對MAC-T細胞核的影響(圖3)。對照組細胞核呈卵圓形,染色質均勻分布,LPS處理后,細胞核形態出現異型性,染色質碎裂、固縮(圖3白色箭頭)。隨著LPS濃度增加,形態異常細胞核數目逐漸增多。

白色箭頭指示發生形態變化的細胞核White arrows indicate morphologically altered nuclei

2.4 LPS處理MAC-T細胞自噬和凋亡相關基因的表達

與對照組相比,不同濃度LPS(50～100 μg/mL)處理后,自噬相關基因LC3B、P62、ATG5、ATG7、Beclin-1的mRNA表達量極顯著上升(P<0.01),與LPS 100 μg/mL濃度對比,在200 μg/mL濃度LPS處理組,LC3B、P62、ATG5、ATG7、Beclin-1的mRNA表達量極顯著下降(P<0.01)(圖4A～圖4E)。凋亡相關基因在不同濃度LPS(50、100、200 μg/mL)處理后,BAX和caspase-3表達極顯著升高(P<0.01),BCL-2表達呈現出極顯著下降(P<0.01)(圖4F～圖4H)。

A.LC3B mRNA; B.p62 mRNA; C.ATG5 mRNA; D.ATG7 mRNA; E.Beclin-1 mRNA; F.BAX mRNA; G caspase-3 mRNA; H.BCL-2 mRNA;與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,##P<0.01

2.5 LPS處理MAC-T細胞自噬和凋亡相關蛋白的表達

與對照組相比,LPS(50、100 μg/mL)處理下自噬相關蛋白LC3B、P62、ATG5、ATG7和Beclin-1的表達極顯著上升(P<0.01),與LPS 100 μg/mL濃度對比,在200 μg/mL濃度LPS處理組,自噬相關蛋白LC3B、ATG5、ATG7和Beclin-1的表達呈現下降趨勢(圖5A～圖5E)。與對照組相比,凋亡相關到蛋白在不同濃度LPS(50、100、200 μg/mL)處理后,BAX和caspase-3表達顯著升高,BCL-2表達呈現出極顯著下降(圖5F～圖5H)。

A.LC3B protein; B.p62 protein; C.ATG5 protein; D.ATG7 protein; E.Beclin-1 protein; F.BAX protein; G.Caspase-3 protein; H.BCL-2 protein;與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,##P<0.01

3 討論

乳腺上皮細胞是乳腺天然免疫屏障的主要組成成分,是研究泌乳機制、乳腺炎發病機制的重要細胞模型。本研究以MAC-T細胞為研究對象,探究不同濃度的LPS對MAC-T細胞自噬和凋亡的影響。自噬在真核細胞中是一種獨特的現象,是細胞在饑餓時通過循環利用細胞質的物質來補充自己的能量,自噬分為4種,微自噬、分子伴侶介導的自噬、非典型自噬及巨自噬[19],本文主要適用于巨自噬。自噬對維持細胞的結構具有重要意義,ATG5、ATG7和Beclin-1在巨自噬中是必須的基因[20]。體外試驗表明,ATG5作為自噬的關鍵樞紐,被敲除后可以抑制自噬的發生并且促進細胞凋亡[21],還可以激活NF-κB信號通路產生一系列炎癥損傷[22]。ATG7敲除會影響自噬體的形成及線粒體的形變,產生自噬性的損害。本文研究顯示,LPS可以使LC3和p62蛋白水平升高,證明了LPS可以提升MAC-T細胞自噬的水平,p62的下降代表自噬流順暢[23-24],p62升高代表自噬小體降解受到抑制,可以推測LPS在引起MAC-T細胞自噬增加的同時,阻滯細胞內自噬溶酶體的降解。研究發現,在巨噬細胞中LPS的刺激可以使p62升高,與本試驗研究結果一致。在內皮細胞中低于1 μg/mL的LPS造成p62表達上升,高于1 μg/mL的LPS會使p62表達下降[25]。這種差異可能與細胞種類和LPS的濃度不同有關。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種類型,分為內源性和外源性兩種途徑[26],這兩種途徑均可以導致caspase-3的激活,促進細胞色素C的釋放,產生凋亡小體誘導caspase-9的活化并最終產生細胞凋亡[27]。ATG5在凋亡細胞中起到了關鍵的作用,在細胞凋亡發生時ATG5會被鈣蛋白酶切割導致其N端片段進入線粒體和BCL-2家族受體結合相互作用,導致細胞色素C的釋放促進細胞凋亡[28],且內質網中的BCL-2可以和Beclin-1的BH3結構域結合從而抑制自噬的發生,也可以被caspase-3、6、7、8、9、10進行剪切,C末端進入線粒體導致細胞色素C的釋放從而導致促進凋亡的發生[29]。在本研究中200 μg/mL的LPS濃度對比100 μg/mL濃度處理MAC-T細胞自噬相關蛋白表達水平下降,很可能是凋亡的發生抑制了自噬的進程,細胞自噬不足以挽救細胞從而過度到了凋亡階段。

綜上所述,低濃度LPS(50～100 μg/mL)處理增加MAC-T細胞自噬,高濃度的LPS(200 μg/mL)可抑制此過程。同時伴隨著LPS濃度梯度的上升(50～200μg/mL),細胞凋亡逐漸增加。