短期饑餓脅迫對攝入紅棗提取物的虹鱒非特異性免疫相關基因表達的影響

劉旭昊， 汪小將， 劉 飛

（洛陽師范學院， 河南洛陽 471934）

虹鱒是我國重要的高端冷水魚之一，廣受大眾歡迎，近年來一直保持高速增長，即使2018年遭遇了“改名危機”，虹鱒產量依然保持了正增長，與2015年相比，2019年鱒魚產量幾乎翻了一倍，達39373 t[1]。水產動物基本上無法避開致病菌和寄生蟲，一旦發病往往會造成較大損失，所以提高非特異性免疫能力對于水產養殖業來說是至關重要的[2]。目前虹鱒對各種疾病尚無特效藥物，其抗性主要源于非特異性免疫[3]。而中草藥常被用于提高水產的非特異性免疫能力和抗氧化能力，研究表明多種中草藥可提高虹鱒的抗氧化能力、白細胞吞噬能力以及其它多種非特異性免疫指標[4]。

虹鱒漁場多建于高山峽谷之間，生長階段、飼料的時空分布、暫養、轉場乃至后勤保障等種種原因導致虹鱒短期饑餓脅迫很難避免，所以提高虹鱒的饑餓耐受性及其非特異性免疫能力、減少因而造成的損失是虹鱒養殖面臨的新課題。虹鱒是冷水魚研究模式魚種，故了解中草藥在虹鱒面臨饑餓脅迫下對免疫相關指標的影響就顯得尤為必要，可為以虹鱒為代表的冷水魚在饑餓脅迫下采取何種預防性對策提供理論依據。

紅棗是我國傳統的藥食兩用食物，具有抗衰老、補血、抗氧化、抗腫瘤、保肝、調節免疫力等作用，其活性成分被不同機構進行了深入細致的研究[5,6]。另有研究表明，適量添加紅棗提取物可以促進虹鱒抗氧化能力，提高虹鱒的非特異性免疫能力[7]。故本文深入研究短期饑餓脅迫對攝入紅棗提取物后虹鱒幼魚非特異性免疫相關基因表達的影響，以評價紅棗提取物攝入對虹鱒非特異性免疫能力促進的持續性和耐饑餓脅迫能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗用虹鱒幼魚自四川省眉山市東坡區天貴養殖場采購，于本院冷水魚養殖工程研究中心循環養殖系統飼養缸（1 m×1m）暫養馴化14 d后，選取體型大小一致（7.2～8.4 cm）、游動迅捷靈活、無病無傷的虹鱒幼魚備用。

1.2 實驗用飼料

紅棗提取物（20:1）購自陜西森弗天然制品有限公司。以豆粕、魚粉為N源，豆油加魚油為脂肪源配制基礎飼料，配方見表1；飼料原料購自中糧飼料（新沂）有限公司。根據前期試驗結果，分別添加質量百分比為0%、0.25%、0.5%的紅棗提取物，配制成等氮等脂試驗用飼料（粗蛋白46.2%；粗脂肪13.7%）并制粒，粒徑1.5～2.5 mm，陰干后于-20℃冰箱保存備用，用前自然升溫至室溫。

表1 虹鱒基礎飼料配方（%）

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 虹鱒養殖

1.3.1 紅棗提取物攝入試驗處理

取備用虹鱒幼魚，隨機分為三組，每組3個平行缸，每缸30尾；分別投喂紅棗提取物添加比為0%、0.25%、0.50%的試驗用飼料，連續飼養8周，期間24h充氣泵運行，每日適度換水，水體循環過濾，并保持水溫在13±2℃、pH7.2±0.2，DO＞8 mg/L。每日早中晚三次定點定時投喂（投喂量：2-5%體重飽食），投喂后及時清理殘餌和糞便。

1.3.2 饑餓試驗處理

前處理飼養階段完成后，所有各試驗缸留下10尾在饑餓脅迫條件下飼養2周，除禁食外，其它條件不變。

1.4 采樣

饑餓試驗后所有各實驗組隨機選取虹鱒幼魚各6尾，用70%乙醇脫脂棉球消毒，于冰盤上解剖，分別取頭腎、脾臟于凍存管中暫存，并盡快轉移至-80℃冰箱中凍存。

1.5 抗氧化基因表達情況測定

從-80℃冰箱中取出備用樣品，進行總RNA提?。ㄉ虾ｏw捷總RNA極速提取試劑盒）；然后進行反轉錄（東洋紡生物科技有限公司試劑盒）得到cDNA，然后用超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX1）、谷胱甘肽巰基轉移酶（GSTA）、溶菌酶（LZM）、補體C3（C3）、腫瘤壞死因子（TNF-α）目的基因和內參基因的上下游引物，按照Bestar SybrGreen qPCR mastermix （德國DBI公司）說明書進行實時熒光定量PCR，反應程序設置如下：95℃2 min；95℃10 s，55℃30 s，72℃30 s，40 cycles；95℃1 min，55℃1 min，55-98℃（10s/cycle，0.5℃/cycle，共86cycles）。循環結束后提取各基因Cq值，用2—ΔΔt法計算各目的基因的相對表達值。

1.6 數據統計與分析

數據分析采用Excel 2013進行處理，使用平均值±標準差表達計算結果精度；使用SPSS13.0進行單因素方差分析，用Duncan′s法進行處理組和對照組之間的平均數比較，在α=0.05水平檢驗。

2 結果與分析

2.1 紅棗提取物對饑餓條件下脾臟非特異性免疫基因表達的影響

不同饑餓試驗組虹鱒脾臟非特異性免疫相關基因（含抗氧化基因和免疫基因）的相對表達量結果見圖1。從圖中可看出，進行14天饑餓后，SOD，GPX1,GSTA,LZM,C3均在0.25%組與對照組相比表現為表達量增加，其中除LZM外均在0.50%組轉為下降。經單因素方差分析結果表明：GPX1、GSTA和C3基因表達在0.50%組顯著或極顯著下調，但LZM基因表達在0.50%組顯著上調，C3基因表達在0.25%組極顯著上調；其他各紅棗提取物組的這些基因的表達量均與對照組相比無顯著變化。

圖1 不同饑餓組虹鱒脾臟非特異性免疫相關基因相對表達量

2.2 紅棗提取物對饑餓條件下頭腎非特異性免疫基因表達的影響

不同饑餓試驗組虹鱒頭腎非特異性免疫相關基因（含抗氧化基因和免疫基因）的相對表達量結果見圖2。從圖中可看出，相對于對照組，兩個紅棗提取物添加組各基因表現的表達情況無統一的趨勢，但所測定的三個免疫直接相關基因0.25%組表達量要高于對照組和0.50%組。經單因素方差分析結果表明：GPX1基因表達在0.25%組極顯著下調，在0.50%組顯著上調；C3基因表達在0.25%組極顯著上調；其他各紅棗提取物添加組在這幾個基因的表達量上均與對照組之間無顯著差異。

圖2 不同饑餓組虹鱒頭腎非特異性免疫相關基因相對表達量

3 討論

從本研究結果來看，投喂添加紅棗提取物的虹鱒短期饑餓脅迫后脾臟受到的影響更大，7組非特異性免疫相關基因表達中GPX1、GSTA、LZM、C3出現了顯著或極顯著波動，而頭腎受到的影響相對小一些，僅GPX1和C3出現了極顯著波動。另外有研究表明虹鱒飼料添加物可以增強頭腎SOD、C3[8]、CAT[7]基因的表達和脾臟SOD、GPX1、GSTA基因的表達[7]，本研究中在短期饑餓脅迫后相對于對照組虹鱒兩種組織的響應能力均出現下降，其中頭腎SOD、CAT基因表達差異喪失、脾臟SOD基因表達差異喪失，表明不同非特異性免疫基因在不同組織的作用持續時間有一定差異。頭腎是魚類主要的造血和免疫器官，脾臟是虹鱒最主要的免疫器官之一。脾臟和頭腎的結構、功能存在顯著差異，提示其對紅棗提取物的器官反應也可能有所不同，也反映了中草藥在配伍應用上應當注意器官效應。

動物細胞的抗氧化酶系主要包括CAT、SOD、GPX、GSTA等，饑餓脅迫下通常會降低抗氧化基因的表達或其酶活性。從本研究看，相對于對照組，主要受影響的脾臟中GPX1、GSTA基因表達在低濃度組（0.25%）還均表現為一定程度的上升趨勢，而高濃度組（0.5%）則均表現為進一步的顯著或極顯著下降。已有研究表明一定濃度紅棗提取物添加能提高虹鱒機體的抗氧化能力，顯著提升虹鱒脾臟GSTA基因表達[7]。這表明飼料添加一定濃度紅棗提取物對虹鱒促抗氧化能力持續效應不明顯，而且過高濃度（0.5%）添加反而在抗饑餓脅迫時降低機體抗氧化能力。

魚類的非特異性免疫機制包括溶菌酶、補體、干擾素、吞噬細胞等，其中溶菌酶（LZM）在抵抗病原入侵中起重要作用；補體系統介導溶裂反應來促進吞噬、溶解靶細胞，是機體內重要的非特異性免疫調節系統，因三條激活途徑均包含C3，所以C3是非特異性免疫的重要標志。儲辛伊等研究結果表明饑餓脅迫也會導致補體含量下降，同時認為補體C3在饑餓脅迫下活化可以清除機體中可溶性免疫復合物，抑制炎癥反應[9]。饑餓脅迫可導致魚類各種非特異性免疫指標下降[7，10]。本試驗中添加紅棗提取物后短期饑餓脅迫下虹鱒脾臟LZM基因表達呈上升趨勢，在高濃度（0.5%）下表達顯著增強；低濃度組（0.25%）C3基因無論在脾臟還是頭腎均極顯著上調表達，但在高濃度組（0.5%）仍然顯著下調。這表明飼料添加一定濃度紅棗提取物對虹鱒促免疫能力具有一定的持續效應，也一定程度增強了機體的抗脅迫能力。

綜上，一定濃度的紅棗提取物攝入后，對虹鱒非特異性免疫能力促進具有一定的持續性，主要表現在對脾臟組織和非特性免疫直接相關基因（如LZM、C3）上，一定程度上也表明其攝入能提升機體的抗饑餓脅迫能力。同時結合上述對非特異性免疫直接基因表達及相關的抗氧化基因的表達影響結果的綜合分析來看，在虹鱒飼料中添加較低濃度（0.25%）紅棗提取物為宜。