千金子二萜醇調控TGF-β/Smad4通路調節腎癌小鼠Th1/Th2免疫平衡

周磊 宋圣佑 邰倫偉 蔣俊玲 王蒙蒙 潘世杰 趙俊峰

(河南中醫藥大學 1第二臨床醫學院,河南 鄭州 450002;2第二附屬醫院)

腎細胞癌(RCC)簡稱腎癌,起源于腎小管上皮細胞,占所有癌癥的2%～3%〔1〕。有研究表明,RCC的發生發展與Th1/Th2免疫平衡有很大關系〔2～4〕。另有研究表明,中藥千金子的許多相關提取物可以抑制肺癌〔5〕、肝癌〔6〕、宮頸癌〔7〕、白血病〔8〕等腫瘤的進展;本課題組前期研究發現,千金子二萜醇可抑制RCC細胞的增殖、轉移和侵襲,并通過體內實驗證實其可減緩腫瘤進展、通過調控核因子(NF)-κB活性抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)表達和通過調節轉化生長因子(TGF)-β1/Smad通路活化影響腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-17表達〔9～11〕。但其是否具有調節腎細胞癌Th1/Th2免疫平衡的作用仍不清楚。本研究旨在分析千金子二萜醇調控TGF-β/Smad4信號通路調節腎癌小鼠Th1/Th2免疫平衡及其可能機制。

1 材料與方法

1.1試劑 千金子二萜醇(WKQ-0000424,四川維克奇生物科技有限公司);RPMI1640、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)和Phosphate Buffered Saline(以色列BI公司);青-鏈霉素混合液(索萊寶公司)、無血清凍存液(C40100,新賽美);高效RIPA裂解液(組織/細胞)(R0010,索萊寶公司)和ECL顯影液(索萊寶公司);PEG-300和LY2109761(Med Chem Express公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司);蛋白電泳凝膠制備試劑盒Ⅱ型(PE008-2,陜西中暉赫彩生物醫藥科技有限公司);TGF-βR Ⅱ Polyclonal antibody(27212-1-AP,武漢三鷹有限公司);SMAD4 Polyclonal antibody(51069-2-AP,武漢三鷹有限公司);Beta Actin Polyclonal antibody(20536-1-AP,武漢三鷹有限公司);HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00001-2,武漢三鷹有限公司);三色預染蛋白Marker(WJ103,上海雅酶生物醫藥科技有限公司)IFN-γ Mouse Uncoated ELISA Kit(EK280/3-96,聯科生物科技有限公司);鼠IL-4 High Sensitivity ELISA Kit(EK204HS-96,聯科生物科技有限公司);柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒(B518651-0100,生工生物工程(上海)股份有限公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(RR047A,寶日醫生物技術(北京)有限公司);TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(RR820A,寶日醫生物技術(北京)有限公司);

1.2細胞及實驗動物 腎癌細胞(北納創聯生物技術有限公司);6～8 周齡雄性SPF級BALB/c小鼠(北京斯貝福生物技術有限公司),體質量18～22 g,于25 ℃、12 h光照/12 h黑暗實驗動物中心常規飼養,正常飲食飲水。動物實驗經河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)倫理委員會批準。

1.3腎癌細胞培養 將完全培養基中的腎癌細胞恒溫培養對數生長期,胰蛋白酶消化,離心,進行細胞計數并制備1×107個/ml細胞懸液用于后續實驗。

1.4小鼠分組、腎癌模型構建及給藥 取雄性SPF級BALB/c小鼠18只,隨機分為模型組(腎癌組)、實驗組(模型+千金子二萜醇組)和TGF-β/Smad通路抑制劑組(模型+LY2109761組),每組6只。3組小鼠腋窩(右前肢)皮下組織注射0.2 ml細胞懸液。造模過程在SPF級小鼠飼養室環境中飼養,自由飲水進食。待瘤塊體積大于5 mm后,實驗組給予25 mg/kg千金子二萜醇溶液灌胃,1次/d;通路抑制劑組給予25 mg/kg LY2109761溶液灌胃,每3 d 1次。給藥21 d結束后(實驗組給藥21次;通路抑制劑組給藥7次),腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠,眼科彎頭鑷摘除小鼠眼球后取血,離心后取上清,置于超低溫冰箱冷凍保存,剝離小鼠皮下移植瘤塊并置于液氮中冷凍保存,分離各組小鼠完整的脾臟置于液氮中冷凍保存。

1.5瘤塊體積增長率計算 灌胃期間測量小鼠第3天和第21天瘤塊的長徑L(mm)、短徑W(mm)。腫瘤體積(mm3)=π/6×L×W2,瘤塊增長率=(第21天腫瘤體積-第3天腫瘤體積)/第3天腫瘤體積×100%,并進行分析。

1.6Western印跡檢測小鼠脾臟組織蛋白表達 取米粒大小的小鼠脾臟組織放入蛋白裂解液中提取總蛋白,采用BCA法定量蛋白濃度。將蛋白液轉移至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),依次進行分離、轉膜、取膜和清洗,隨后加入一抗、二抗孵育,最后采用ECL顯色法顯影并檢測蛋白質條帶,以β-actin為內參,分析條帶灰度值,檢測TGF-βR Ⅱ和smad4蛋白含量。

1.7ELISA檢測IL-4和IFN-γ水平 從超低溫冰箱取出小鼠血清,將ELISA試劑盒及實驗物品平衡至室溫,采用ELISA檢測血清IL-4和IFN-γ水平,嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

1.8RT-qPCR檢測各個蛋白的mRNA 根據柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒操作步驟提取小鼠脾臟組織的mRNA,根據PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將所提取的mRNA逆轉錄合成cDNA。用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進行目的基因TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA(以β-Actin為內參)的qPCR擴增,引物序列為:β-actin mRNA正義:5′-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′,反義:5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′;TGF-βR Ⅱ mRNA正義:5′-GACCTCAAGAGCTCTAACATCC-3′,反義:5′-GTCATCCACAGACAGAGTAGG-3′;Smad4 mRNA正義:5′-AGTTCACAATGAGCTTGCATTC-3′,反義:5′-TTCAAAGTAAGCAATGGAGCAC-3′;IFN-γ mRNA正義:5′-CTTGAAAGACAATCAGGCCATC-3′,反義:5′-CTTGGCAATACTCATGAATGCA-3′;IL-4 mRNA正義:5′-TACCAGGAGCCATATCCACGGATG-3′,反義:5′-TGTGGTGTTCTTCGTTGCTGTGAG-3′。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據2-△△Ct進行TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA表達的相對定量分析。

1.9統計學分析 使用Graphpad Prism9.5軟件進行單因素方差(非參數檢驗)分析。

2 結 果

2.1各組腫瘤體積增長率比較 與模型組比較,實驗組和LY2109761組腫瘤體積增長率均顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 各組腎癌小鼠腫瘤體積增長率,血清IFN-α、IL-4,脾臟組織TGF-βRⅡ、Samd4蛋白表達比較

2.2各組血清IFN-γ和IL-4水平比較 與模型組比,實驗組IFN-γ顯著升高,IL-4水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4蛋白表達比較 與模型組比較,實驗組和LY2109761組TGF-βR Ⅱ、Samd4和蛋白水平均顯著降低(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4蛋白表達水平

2.4各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA表達比較 與模型組相比,實驗組TGF-βR Ⅱ、Smad4 mRNA表達顯著降低(P<0.05,P<0.01); LY2109761組TGF-βR Ⅱ mRNA表達水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,實驗組IFN-γ mRNA表達水平顯著升高(P<0.05), IL-4 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01),見表2。

表2 各組脾臟組織TGF-βR Ⅱ、Samd4、IL-4、IFN-γ mRNA的表達水平

3 討 論

20%～30%的腎癌患者在診斷早期發生轉移,5年存活率極低〔12〕。許多傳統中草藥能穩定腫瘤生長,對改善腎癌的防治有重要臨床意義。研究報道,某些中藥和相關活性化合物具有有效的抗癌特性〔13〕,千金子二萜醇是傳統中草藥千金子Semen euphorbiae lathyridis中的主要抗癌單體。已有研究表明,千金子二萜醇通過調控上皮間質轉化過程顯著抑制非小細胞肺癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力〔5〕,通過調節細胞凋亡、增殖分化、轉錄、細胞周期等多種途徑來治療白血病〔8〕。本課題組前期研究也發現千金子二萜醇可以通過誘導腎癌細胞凋亡及阻斷其在細胞生長周期的G0/G1期來抑制腎癌細胞的增殖〔9,14〕。

癌癥的發展通常伴隨著Th1/Th2免疫失衡發生〔15〕。Th1向Th2漂移是惡性腫瘤的特有現象,Th2型細胞因子的優勢狀態將導致機體抗腫瘤免疫功能減弱,保護腫瘤細胞逃逸免疫監視和免疫攻擊,這可能是腎癌發生發展的免疫機制之一〔16〕。 Th1細胞介導、參與細胞免疫和局部炎癥反應,其分泌的INF-γ具有多種免疫調節作用,可以抑制腫瘤細胞生長〔17〕,Th2細胞產生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,介導體液免疫,并與超敏反應的發生密切相關〔17〕,可通過抑制IL-12、IFN-γ的產生,防止NK細胞活化,減少腫瘤細胞抗原表達等方式抑制細胞免疫的抗腫瘤效應。本研究結果說明千金子二萜醇觸發了Th1/Th2失衡,并將Th1/Th2免疫平衡向Th1轉移。

TGF-β/Smad4是細胞內重要的信號通路,參與調控多種重要的生物學過程,在多種腫瘤中均發揮重要作用。在TGF-β信號傳導的第一步中,TGF-β配體與Ⅱ型受體(TGF-βR Ⅱ)和Ⅰ型受體(TGF-βR Ⅰ)的異聚體復合物結合,3種異構體均以同源二聚體的形式結合到TGF-βR Ⅱ上,TGF-βR Ⅱ磷酸化并激活TGF-βR Ⅰ。激活的TGF-βR Ⅱ依次磷酸化并激活受體激活的Smads(R-Smads)、Smad2和Smad3。Smad7與R-Smads競爭與TGF-βR Ⅰ的相互作用,從而阻止R-Smad激活和信號的正確傳播?；罨腞-Smads與TGF-βR Ⅰ分離,與共同的介體Smad4形成復合物。三聚體復合物易位到細胞核,在細胞核里與高親和力DNA結合轉錄因子和染色質重塑蛋白結合,促進或抑制靶基因的轉錄〔18〕。LY2109761是一種新型的選擇性TGF-βR Ⅰ/Ⅱ 型抑制劑,能選擇性通過抑制TGF-βR Ⅰ和TGF-βR Ⅱ的結合發揮作用〔19〕。本研究結果說明LY2109761抑制TGF-βR Ⅱ可能在翻譯水平,LY2109761組Smad4蛋白水平表達降低,可能是由于膜受體蛋白TGF-βR Ⅱ表達量降低,阻止了信號從膜外向膜內的信號轉導,導致Smad2/3和Smad4蛋白表達量降低,同時抑制型Smad7表達量上升,進一步抑制了信號向核內的傳遞,從而有效抑制了TGF-β1/Smads信號通路〔20〕。說明千金子二萜醇調節腎癌小鼠Th1/Th2免疫平衡的機制可能與TGF-β/Smad4信號通路有關。

綜上,腎癌會引起IFN-γ降低和IL-4升高,從而影響機體免疫反應誘發免疫抑制,而千金子二萜醇可以影響Th1/Th2的免疫平衡,將Th1/Th2免疫平衡向Th1轉移,促進IFN-γ的分泌和抑制IL-4的分泌,解除免疫抑制,進而影響腎癌進展,其機制可能與TGF-β/Smad4信號通路有關。