柞蠶免疫蛹粉、柞蠶抗菌肽對扇貝生長、免疫力的影響

馬淑慧,田 斌,孫永欣,李學軍,米 銳,溫志新,孟 楠,李亞潔,李樹英,都興范

( 1.遼寧省海洋水產科學研究院,遼寧 大連 116023; 2.大連市現代農業生產發展服務中心,遼寧 大連 116023 )

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)屬軟體動物門瓣鰓綱珍珠貝目扇貝科,具有營養豐富、味道鮮美的優點[1]。20世紀80年代初遼寧省海洋水產科學研究院率先引進蝦夷扇貝親貝并進行相關研究,目前主要養殖在遼寧大連,山東青島、威海等沿海城市,蝦夷扇貝在我國的養殖歷史已近40年,其養殖規模與產量得到飛速發展[2]。大規模養殖過程中,防止細菌性疾病的暴發對扇貝養殖的管理至關重要。

近年來,抗菌肽因其對病原體的抗病能力而被研究人員廣泛關注[3]。自20世紀80年代初首次從人工誘導的天蠶免疫血淋巴中分離出第一種抗菌肽——天蠶素以來[4-5],抗菌肽逐漸成為昆蟲免疫學及分子生物學的研究熱點[6-9]?？咕氖撬拗魈烊环烙闹匾獏⑴c者,屬于機體第一道免疫防線,在抵抗外來病原菌及微生物入侵方面發揮關鍵作用?？咕木哂蟹€定、水溶性好、對高等動物正常細胞幾乎無害的特點,是新一代綠色飼料添加劑[10-12]。迄今為止,抗菌肽已被應用于飼喂蝦、魚等水生動物,研究結果均表現出顯著的質量增加和免疫促進作用[13-16]。飼喂添加含有抗菌肽的柞蠶免疫活性蛹粉飼料,在仿刺參(Apostichopusjaponicus)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)和紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)中已取得較好效果[17-19],但在蝦夷扇貝養殖應用上尚未見報道。筆者以柞蠶蛹粉、柞蠶免疫蛹粉和柞蠶抗菌肽作為飼料添加劑飼喂蝦夷扇貝,考察蝦夷扇貝體質量和免疫指標變化,以期為拓展柞蠶資源高值化利用及開發新型免疫增強劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

微藻飼料購于山東濱州金海岸水產有限責任公司,試驗用蝦夷扇貝均來自旅順浮筏養殖。柞蠶蛹粉、柞蠶免疫蛹粉、柞蠶抗菌肽均為實驗室自備,粒徑48 μm,制備步驟為:在4 ℃條件下、8000 r/min(離心半徑20 cm)離心破蛹去殼,冷凍干燥,得到柞蠶蛹粉;在無菌條件下取指數生長期(37 ℃培養18～20 h,次日轉管繼續培養6～7 h)的益生菌菌液,用生理鹽水稀釋20倍后注射到柞蠶蛹體內,注射劑量為50 μL/個。注射后的柞蠶蛹置22～24 ℃培養4 d,其血清抗菌活性達到高峰時(平板檢測法),4 ℃下,8000 r/min(離心半徑20 cm)將蠶蛹離心破碎,再經去殼、收集勻漿液和冷凍干燥,形成柞蠶免疫蛹粉。同條件下注射的柞蠶蛹在抗菌活性高峰時采集蛹血,沸水浴10 min后離心取上清液,冷凍干燥獲得柞蠶抗菌肽粉末[20-21]。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的配制

選擇初始體質量(54.75±0.07) g的蝦夷扇貝進行飼養試驗。暫養7 d后,以螺旋藻為基礎飼料飼喂蝦夷扇貝作為對照組,在基礎飼料中分別添加2%質量分數柞蠶蛹粉、2%質量分數柞蠶免疫蛹粉、2%質量分數柞蠶抗菌肽作為試驗組。

1.2.2 試驗設計及飼養管理

試驗共4組,分別于4個玻璃鋼水槽(20 m3水體/水槽)底部分布養殖,每組80個蝦夷扇貝。每日上午清理殘餌和糞便,全部換水后投喂1次,下午投喂1次,日飼喂量8 mg/L,投餌0.5 h后水色變淡且無假糞現象發生。水溫17～21 ℃,溶解氧質量濃度8 mg/L,鹽度31,全天充氣養殖,試驗周期為30 d。

1.2.3 樣品采集

自每組隨機選取6只蝦夷扇貝作為測定混合樣本,用1 mL一次性注射器心臟取血,4 ℃凝結6 h后,4000 r/min(離心半徑 8 cm)、4 ℃離心10 min,吸取上清液獲得血清樣品,-80 ℃冷凍備用。

1.2.4 血清酶活性測定

溶菌酶、酸性磷酸酶、總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.2.5 特定生長率

試驗結束后,稱量各組蝦夷扇貝的體質量并記錄,計算其特定生長率(RSG):

RSG/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中,mt和m0為蝦夷扇貝的終末體質量和初始體質量(g),t為試驗時間。

1.2.6 死亡率

在試驗過程中,每日記錄各組蝦夷扇貝的死亡個數,最后統計累計死亡個數。

1.3 數據處理及統計分析

應用SPSS 21.0軟件對4組蝦夷扇貝的體質量、溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶數據進行單因素方差分析,用鄧肯法進行組間多重比較,數值均以平均值±標準差表示,P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 不同添加組蝦夷扇貝的生長情況

飼喂不同添加劑對蝦夷扇貝生長情況影響見表1。柞蠶抗菌肽組蝦夷扇貝體質量最高,其次是對照組和柞蠶免疫蛹粉組,柞蠶蛹粉組最低。統計學分析表明,柞蠶抗菌肽組蝦夷扇貝體質量顯著高于對照組(P<0.05),并極顯著高于柞蠶蛹粉組和柞蠶免疫蛹粉組(P<0.01)。

表1 不同組別蝦夷扇貝的生長

2.2 酶活性測定

2.2.1 溶菌酶活性

經過30 d飼養試驗,柞蠶抗菌肽處理組和對照組蝦夷扇貝血清中溶菌酶活性較其他兩組顯著升高(P<0.05),柞蠶抗菌肽處理組較對照組也顯著升高,而柞蠶蛹粉組和柞蠶免疫蛹粉組活性顯著下降(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同試驗組蝦夷扇貝血清溶菌酶活性Fig.1 The lysozyme activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.2.2 酸性磷酸酶活性

添加不同飼料對蝦夷扇貝血清中酸性磷酸酶活性的影響見圖2,柞蠶抗菌肽組蝦夷扇貝血清中酸性磷酸酶活性較其他各組顯著升高(P<0.05),柞蠶免疫蛹粉組和柞蠶蛹粉組酸性磷酸酶活性降低。

圖2 不同試驗組蝦夷扇貝血清酸性磷酸酶活性Fig.2 The acid phosphatase activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.2.3 超氧化物歧化酶活性

經過30 d飼養試驗,4組蝦夷扇貝血清中超氧化物歧化酶活性均存在顯著性差異,其中柞蠶抗菌肽處理組較其他3組顯著升高,柞蠶蛹粉組和柞蠶免疫蛹粉組較對照組顯著降低(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同試驗組蝦夷扇貝血清超氧化物歧化酶活性Fig.3 The superoxide dismutase activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.2.4 過氧化氫酶活性

柞蠶抗菌肽處理組蝦夷扇貝血清中過氧化氫酶活性較對照組升高,柞蠶蛹粉組和柞蠶免疫蛹粉組較對照組減少,但均差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖4 不同試驗組蝦夷扇貝血清過氧化氫酶活性Fig.4 The catalase activity of Yesso scallop P. yessoensis in different groups

2.3 死亡率

經過30 d飼養試驗,各組累計死亡數最高的為柞蠶蛹粉組18個,對照組13個,柞蠶免疫蛹粉組12個,柞蠶抗菌肽組最低,為10個。從發病持續時間來看,柞蠶抗菌肽組在試驗的第27 d停止死亡。相比之下,柞蠶免疫蛹粉組死亡現象持續到試驗第28 d,而柞蠶蛹粉組和對照組死亡現象持續到試驗結束,柞蠶抗菌肽組和柞蠶免疫蛹粉組較對照組和蛹粉組死亡率降低,且柞蠶抗菌肽組死亡率最低(圖5)。

圖5 飼喂不同飼料添加劑后蝦夷扇貝累計死亡統計Fig.5 The mortality of Yesso scallop P. yessoensis fed different feed additives

3 討 論

3.1 飼喂柞蠶免疫蛹粉和柞蠶抗菌肽對蝦夷扇貝生長的影響

柞蠶在受到病原微生物、化學物質、物理因子或創傷等刺激后,其體內能合成一系列生物活性物質,包括柞蠶抗菌肽、溶菌酶、凝集素、防御素等[22]。誘導后的柞蠶免疫蛹粉和柞蠶抗菌肽中含有這些生物抗菌成分,本研究團隊之前的研究表明,柞蠶免疫蛹粉可提高仿海參、紅鰭東方鲀和凡納濱對蝦的體質量及抗病能力。筆者將柞蠶免疫蛹粉應用到蝦夷扇貝飼喂上,并首次采用柞蠶抗菌肽飼喂海產品,結果表明,飼喂柞蠶抗菌肽組蝦夷扇貝特定生長率顯著增加、體質量增加,表明柞蠶抗菌肽提高了蝦夷扇貝的抗病力。柞蠶蛹粉組和柞蠶免疫蛹粉組蝦夷扇貝特定生長率降低,試驗結束后,解剖蝦夷扇貝,在這2組蝦夷扇貝消化道中發現未消化顆粒狀殘渣,表明飼喂蛹粉可能引起蝦夷扇貝消化功能降低,阻礙腸道對餌料吸收。如果海水中再懸浮顆粒物的濃度過高,扇貝的濾水率和攝食率也會降低,進而影響貝類的生長[23]。

3.2 飼喂柞蠶免疫蛹粉和柞蠶抗菌肽對蝦夷扇貝血清非特異性免疫酶活性的影響

扇貝免疫系統屬于先天性非特異性免疫防御系統,溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶直接反映了非特異性免疫防御能力,因此經常被用作衡量機體免疫功能的指標[24-27]。本試驗中,柞蠶抗菌肽飼喂蝦夷扇貝后血清溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性對比其他組顯著增高,說明柞蠶抗菌肽可以被血淋巴吸收,從而誘導溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性的增加。進一步說明添加2%柞蠶抗菌肽的螺旋藻可提高蝦夷扇貝的免疫力。飼喂4種不同飼料的蝦夷扇貝,其過氧化氫酶活性無明顯差異,可能與抗菌肽誘導氧自由基產生的機制不同有關,有待于進一步研究細胞吞噬和氧自由基的產生,以確定蝦夷扇貝的抗氧化機制。柞蠶蛹粉組和柞蠶免疫蛹粉組溶菌酶、酸性磷酸酶活性有所降低,可能高蛋白飼料抑制了蝦夷扇貝消化道的吸收功能,導致蝦夷扇貝機體代謝紊亂。

3.3 飼喂柞蠶免疫蛹粉和柞蠶抗菌肽對蝦夷扇貝抗病能力的影響

存活率直接反映動物的抗病力,因此養殖試驗中通過攻毒試驗測試受試動物抗病力較為普遍,但本試驗開始時蝦夷扇貝就出現發病死亡現象,因此最后采取統計死亡率考察蝦夷扇貝抗病力。本試驗中,最早出現發病死亡的是柞蠶免疫蛹粉組,緊接著是柞蠶蛹粉組和對照組,各組未出現暴發性死亡,但死亡現象一直持續到養殖結束。發病后,蝦夷扇貝外套膜外緣以及外套膜和貝殼表面接觸處呈現褐色,外套膜收縮,感染疾病癥狀類似于膿胞病[28]。柞蠶抗菌肽處理組蝦夷扇貝死亡現象程度較低,且發病持續時間最短。這充分表明,蝦夷扇貝攝食柞蠶抗菌肽后,抗病力得到顯著提高?？咕脑趧游矬w內發揮了抗菌作用,可降低其死亡率,這一結果與Mi等[29-30]抗菌肽可抑制細菌增長、提高蝦夷扇貝免疫力的研究結果一致。

4 結 論

本試驗結果表明,不同添加劑螺旋藻粉投喂蝦夷扇貝30 d后,添加2%柞蠶抗菌肽能顯著提高蝦夷扇貝特定生長率、免疫力和抗病能力,降低死亡率。添加2%柞蠶蛹粉和2%柞蠶免疫蛹粉對蝦夷扇貝的增長和免疫力起到阻礙作用。根據試驗結果推測,蝦夷扇貝質量增加、免疫力和抗病力的提高與添加物質的抗菌能力有關,其抗菌機制有待于進一步研究。本試驗結果對于蝦夷扇貝種貝室內人工促熟進行營養和免疫強化具有一定借鑒意義。