基于線粒體COⅠ基因的河南省境內鋸齒新米蝦種群遺傳多樣性研究

馬志剛，馮夢霞，湯永濤，劉如垚，閆雪朦，胡博，聶國興，周傳江，

（1. 河南師范大學水產學院，河南省水產動物養殖工程技術研究中心，水產動物疾病控制河南省工程實驗室，河南新鄉 453007；2. 河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007）

鋸齒新米蝦Neocaridina denticulata是一種體型偏小的淡水蝦類，對水域環境適應能力較強，但分布范圍較狹窄，據記載，其在國內僅分布于太湖區、福建等特定區域，后被移養至新疆、巴楚等地的部分區域（梁象秋，2004），在新米蝦屬Neocaridina的修訂中首次系統、詳細地描述了新米蝦屬的分類地位及其形態特征，為相關研究提供了理論依據。隨著更多物種的發現和分類學研究的深入（蔡奕雄，1996；梁象秋等，1999；梁象秋，2004），鋸齒新米蝦、大衛米蝦Caridina davidi和異足新米蝦N. heteropoda的分類命名存在一定沖突和爭議，Klotz 等（2013）的研究認為，大衛米蝦、鋸齒新米蝦大衛亞種N. denticula davidi、鋸齒新米蝦中華亞種N. denticula sinensis是異足新米蝦的同物異名，其有效物種名為N. davidii。

鋸齒新米蝦作為一種形態體色多變的常見小型淡水蝦，常被用作觀賞蝦類進行交易和養殖。為了培育更多體色增加其觀賞價值，米蝦屬Caridina和新米蝦屬中許多種被人工雜交和選育（林師，2017）。此外，鋸齒新米蝦的環境適應性較強，有學者對其低溶解氧脅迫的耐受能力、水體污染的生態響應進行研究報道（李典寶，2015；薛毓才等，2022），為后續鋸齒新米蝦環境適應相關研究奠定了基礎。

河南省地處中原腹地，地跨長江、淮河、黃河、海河4 大流域，境內有1 500 多條主干河流縱橫交錯，水系資源豐富，地形復雜。對河南省境內的蝦類資源調查結果顯示，相較于其他淡水蝦類而言，鋸齒新米蝦在河南境內4大水系均有分布，且數量較大，但缺乏遺傳多樣性的研究報道。目前，DNA分子標記是進行群體遺傳多樣性研究的主要手段之一，線粒體COⅠ基因已被廣泛應用于魚類、蝦類種群遺傳多樣性的研究（馮建彬等，2008；公月月，2017）。本研究基于線粒體COⅠ基因對河南境內19 個野生鋸齒新米蝦群體的149 尾樣本進行遺傳多樣性分析，評估河南境內鋸齒新米蝦種質資源現狀，為其種質資源保護、可持續發展等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2012—2020 年于河南省4 大水系的干流及其部分支流中采集鋸齒新米蝦，標本浸泡于95%乙醇中帶回實驗室保存。選取其中19 個地理群體149尾樣本作為研究對象（表1）。

1.2 COⅠ基因的獲取

取適量樣本肌肉組織（約0.01 g），采取酚-氯仿法提取DNA（Sambrooket al.，1989）。用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 微量紫外分光光度計分別檢測基因組DNA的質量與濃度，-20 ℃保存備用。

擴增線粒體COⅠ基因引物為LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，HCO21 98：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’（Folmeret al.，1994），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應體系為30 μL：2×Es Taq Master Mix 15 μL，正、反向引物各1.5 μL，DNA模板1 μL，無菌雙蒸水11 μL。PCR 反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存（馮建彬等，2008）。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 數據分析

測序獲得的DNA序列采用Lasergene 7.1的SeqMan（Swindell & Plasterer，1997）進行人工核查、校正及組裝拼接。拼接完成的序列用BioEdit（Tippmann，2004）進行多重比對，獲得一致序列備用。用DnaSP 5.0（Librado & Rozas，2009）計算DNA 序列的單倍型數、單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（π）等遺傳多樣性參數。用MEGA 7.0（Sudhiret al.，2016）計算序列堿基組成、變異位點、簡約信息位點和組內、組間遺傳距離等參數。

用Arlequin 3.5（Excoffieret al.，2005）進 行AMOVA 估算遺傳變異在不同水系間的分布和遺傳分化系數（FST），進而評估不同水系鋸齒新米蝦群體的遺傳分化程度；為探究其種群歷史動態，進行Fu’sFs和Tajima’s D 中性檢驗及錯配分布分析，評估群體是否發生種群擴張。根據長臂蝦科Palaemonidae 的系統發育關系，以細足米蝦C. nilotica gracilipes（GenBank 登錄號：MK190025）為外群（李新正等，2003），Bootstrap 設置為1 000檢驗置信度，構建鋸齒新米蝦19 個群體的ML 系統發育樹，以分析各群體之間系統進化關系及地理分化情況。采用Network 5.0（Bandeltet al.，2000）中的Median-Joining 法構建鋸齒新米蝦的單倍型網絡圖，以分析其單倍型演化關系。用BEAST 1.7.4（Heled & Drummond，2010）進行貝葉斯天際線點（Bayesian skyline plot，BSP）分析估算鋸齒新米蝦種群歷史動態的變化，采用1.4%COⅠ基因進化速率（Knowlton & Weigt，1998），由Tracer 1.5（Rambaut & Drummond，2009）生成BSP圖。

2 結果與分析

2.1 COⅠ基因序列基本特征

19個地理群體149條鋸齒新米蝦的COⅠ基因序列長632 bp，其中包括變異位點43 個（6.8%），簡約信息位點32 個，單變異位點11 個，轉顛換位點數的比值為2.628∶1；T、C、A 和G 的平均含量分別為33.4%、20.7%、27.2%和18.7%，表現出顯著的AT偏倚性。

2.2 種群遺傳多樣性

鋸齒新米蝦樣品共包含35 個單倍型，其中，24 個為獨享單倍型，11 個為群體間共享，Hap6被長江、黃河、淮河10 個群體33 尾個體共享。各 水系 的Hd為0.773～0.924，平 均0.922，其中，淮河水系的最低（Hd=0.773），長江水系的最高（Hd=0.924）；各水系的π 為0.002 28～0.006 37，平均為0.006 32，其中，淮河水系的最低（π=0.002 28），長江水系的最高（π=0.006 37）。整體上，長江水系群體顯示出更高的遺傳多樣性（Hd=0.924，π=0.006 37），遠高于其他3 個水系（表2）。

表2 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

2.3 種群遺傳結構

4 大水系群體內遺傳距離為0.002 29～0.006 45，其中，淮河水系的最?。?.002 29），長江水系的最大（0.006 45）；兩兩水系間的遺傳距離為0.004 71～0.008 87，其中，長江水系與淮河水系的最?。?.004 71），海河水系與長江水系的最大（0.008 87）。4 大水系間的FST為0.104 68～0.586 00，4 大水系之間均存在顯著的遺傳差異：黃河水系和長江水系的最高（0.586 00），且存在極顯著遺傳差異；黃河水系與海河水系的最低（0.104 68），且存在顯著差異（表3）。

表3 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體遺傳結構Table 3 Genetic structure of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

海河水系中，E02 與C02、E05，E04 與C02 的遺傳分化較低（FST＜0.25），其余群體與所有群體的遺傳分化程度均較高（FST＞0.25），且分化程度均達到顯著或極顯著水平；海河水系的5個群體之間也存在一定遺傳差異，除E02與E04、E05之間的遺傳分化程度沒有達到顯著差異水平外，其他幾個群體之間的遺傳分化程度均達到了顯著或極顯著水平。FST分析與成對遺傳距離分析結果一致，均表明C02、E01、E02 和E04 群體與其他各鋸齒新米蝦群體間存在較大遺傳分化（表4）。

表4 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體遺傳結構Table 4 Genetic structure of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

AMOVA 結果顯示，鋸齒新米蝦的遺傳變異主要源自其群體內的個體間，且群體內鋸齒新米蝦個體間的變異占總變異的38.10%，群體間的變異則占35.71%（表5）。

表5 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體AMOVA分析Table 5 Analysis of molecular variance among Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

鋸齒新米蝦19個群體的ML系統發育樹（圖1：a）顯示，各水系不同群體間系統進化關系成交叉式嵌套，無明顯水系和地理分化。單倍型網絡圖顯示，鋸齒新米蝦群體各水系35 個單倍型之間總體上并未呈現出明顯的水系交叉，除Hap1、Hap4、Hap6存在不同水系鋸齒新米蝦樣品之間單倍型共享的情況外，其他各個鋸齒新米蝦群體形成了比較明顯的地理結構，不同水系的群體間多為特有單倍型；此外，35 個單倍型中，除Hap1、Hap27 和Hap29 拓展出少量的單倍型外，Hap6 的拓展單倍型最多（圖1：b）。

圖1 基于COⅠ基因構建的河南境內4大水系鋸齒新米蝦的ML系統進化樹（a）及單倍型網絡圖（b）Fig. 1 ML phylogenetic tree （a） and network of haplotypes （b） of Neocaridina denticulata from four river systems in Henan Province based on COⅠ gene sequences

2.4 種群歷史動態

河南省鋸齒新米蝦群體的Tajima’sD檢驗值和Fu’sFS檢驗值均為負數（Tajima’sD=-1.692 13，Fu’sFS=-1.167 07），均未達到顯著差異水平（表2）；錯配分布分析表明，群體的錯配分布曲線呈現出多峰狀態（圖2），推測河南省鋸齒新米蝦種群相對穩定，近期未發生過種群擴張事件。BSP分析結果顯示，鋸齒新米蝦群體整體保持穩定趨勢，并未經歷種群擴張或瓶頸效應（圖3）。

圖2 河南境內4大水系鋸齒新米蝦群體錯配分布分析Fig. 2 Mismatch distribution analysis of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

圖3 河南境內4大水系鋸齒新米蝦群體總貝葉斯天際線點圖Fig. 3 Bayesian skyline plots of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

3 討論

3.1 河南境內鋸齒新米蝦的遺傳多樣性

采集的河南境內149 尾鋸齒新米蝦群體平均遺傳多樣性指數（Hd=0.922，π=0.006 32）均低于河南境內日本沼蝦M. nipponense群體（Hd=0.785 74，π=0.010 59），但是略高于掌肢新米蝦N. palmata palmata群體（Hd=0.557±0.025，π=0.000 98±0.000 07）（鄭小壯等，2019）?？傮w而言，河南境內鋸齒新米蝦與河南境內日本沼蝦群體、掌肢新米蝦（鄭小壯等，2019）、4 個海域口蝦蛄Oratosqilla oratoria群體（董鑫等，2015）及紫貽貝Mytilus galloprovincialis群體（沈玉幫等，2011）均表現出單倍型多樣性較高、核苷酸多樣性較低的特點。

遺傳多樣性分析結果顯示，長江水系鋸齒新米蝦群體顯示出更高的遺傳多樣性（Hd=0.924，π=0.006 37），均遠高于其他3 個水系，表明長江水系鋸齒新米蝦群體目前具有較高的遺傳多樣性，這與河南境內日本沼蝦群體的遺傳多樣性現狀（鄭小壯等，2019）相一致。而淮河水系和黃河水系因采樣點多為半封閉水體，群體間可能存在基因交流，導致結果偏低。

3.2 河南境內鋸齒新米蝦的遺傳結構

淮河水系的遺傳距離最小，長江水系與其他水系之間的遺傳距離均較大。其次是黃河水系和海河水系，海河遺傳距離也相對較大。FST值差異顯著性檢驗顯示，海河水系與其他各水系的群體均存在顯著或極顯著的遺傳差異（P＜0.05，P＜0.01），達到高度遺傳分化（FST＞0.25），就海河水系內部來看，其5個群體之間也存在一定遺傳學差異?；蛞蚝：铀瞪婕? 個采樣點（E02、E04、E05）為水庫，其他2個采樣點則位于林州市太行山脈中，與其他幾個地理群體存在一定地理隔離和基因交流障礙，從而導致了該水系鋸齒新米蝦群體與其他群體產生了差異。

單倍型Hap6 在10 個種群中共享，且以其為中心直接拓展出10個單倍型，呈明顯的星形輻射狀，占據除海河以外的其他3個水系，為分布最廣泛的單倍型，推斷Hap6 是一個存在時間較為久遠的主要單倍型。

3.3 河南境內鋸齒新米蝦的種群歷史動態

中性檢測結果顯示，河南境內鋸齒新米蝦群體的平均Fu’Fs值和Tajima’sD值均為負值但未達顯著差異水平；錯配分布分析顯示其群體錯配分布圖為多峰泊松分布；BSP分析結果顯示鋸齒新米蝦群體整體上保持穩定趨勢。推測河南境內鋸齒新米蝦種群整體比較穩定，未經歷過種群擴張及瓶頸效應。

鋸齒新米蝦作為一類古老的小型淡水蝦類，在我國除了分布于幾個已知的區域（梁象秋，2004）外，在貴州（鄧一德，吳本壽，1997）、江西（李文浩等，2016）、湖北三峽（楊振冰等，2018）等多個地方記錄有分布。鋸齒新米蝦不同地理群體間的遺傳距離雖然較小，但多存在單獨的遺傳結構和一定的地理格局，推測其原因可能有以下幾點：首先，采集樣點的設置和采樣方法的不同均會對分析結果產生一定的影響，如水庫等靜水與溪流等流水的群體可能存在因為生存環境的不同和基因交流的阻礙而產生遺傳分化現象；其次，由于鋸齒新米蝦個體較小，且大多生活在靜水或水體流動性較小的水體，遷移能力相對較弱，因此，不同水系鋸齒新米蝦群體之間可能因為地理、水系上的隔離而存在一定的交流障礙，從而造成群體之間的分化；最后，氣候和環境等不同也會引起其局部適應性的改變，捕撈、放流等人為因素造成鋸齒新米蝦不同地理群體及其棲息環境之間存在一定的差異。為了適應不同的水域環境，不同群體之間可能會發生一定程度的進化或變異（易嘯等，2018；鄭小壯等，2019）。

本研究對河南省境內鋸齒新米蝦遺傳多樣性進行了系統研究，對進一步評價河南省淡水蝦類物種多樣性和淡水蝦類廣布種的遺傳多樣性現狀，豐富河南省境內關于淡水蝦類的相關研究，完善境內淡水蝦類的物種名錄和后續相關研究提供了理論依據和參考。