DNA 條形碼在三峽庫區魚類多樣性研究中的應用

賀楊，陳文俊，陳潔瓊，曾文文，張雪晶，楊婷，翟東東， ，劉紅艷， ，熊飛， ，王瑩，

（1. 江漢大學生命科學學院，湖北省漢江流域特色生物資源保護開發與利用工程技術研究中心，武漢 430056；2. 江漢大學持久性有毒污染物環境與健康危害湖北省重點實驗室，武漢 430056）

三峽工程是世界上最大的水利工程之一，1997 年實現長江截流，經過多次蓄水，庫區水位由135 m 上升到175 m（楊志等，2015）。三峽大壩的建設使位于重慶市東部和湖北省宜昌市西部之間形成了長約600 km、面積約1 084 km2的峽谷河道型水庫。已有研究成果表明，三峽水庫蓄水后，庫區水生生境由原來單一的河流生境轉變為靜水-緩水-流水梯次排列的復雜生境，使庫區魚類物種數急劇減少，魚類群落結構也發生了顯著變化（Yanget al.，2012；鄒家祥，翟紅娟，2016；Gaoet al.，2019；魏念等，2021）。20 世紀80 年代前，三峽庫區江段有140～200 種 魚 類（Fanet al.，2006）；吳 強 等（2006）在三峽庫區長江干流及主要支流共監測到魚類108 種。董純等（2019）在三峽庫區干流魚類資源現狀與物種多樣性保護的調查中獲得84種魚類。因此，全面了解三峽庫區現有魚類組成和評估魚類的遺傳多樣性并提出保護措施非常必要。

自2006 年建立魚類條形碼數據庫Fish-BOL（http：//www.fishbol.org）以來，魚類DNA 條形碼數據量呈指數級上升（Ward，2012）。不少研究顯示DNA 條形碼技術能很好地進行魚類物種鑒定：Khedkar 等（2014）基于印度納爾默達河流域314 條魚類的COⅠ條形碼，發現5 個隱存種和43 種該地區未報道魚類；Chen等（2015）研究了怒江1 139個樣品的COⅠ條形碼，建立了怒江魚類DNA 條形碼數據庫，驗證了COⅠ條形碼在魚類鑒別上的可行性；Wang 等（2021）探討了DNA 條形碼技術在向家壩庫區魚類鑒定中的應用；郜星晨和姜偉（2021）初次構建了三峽庫區常見小型魚類DNA 條形碼數據庫，但其研究的物種數目較少。

本研究一方面利用DNA 條形碼技術對三峽庫區漁獲物進行鑒定，探討DNA 條形碼在三峽庫區魚類輔助鑒定中的適用性，構建三峽庫區魚類DNA 條形碼數據庫，另一方面對一些魚類進行了初步的遺傳多樣性分析，以期為三峽庫區魚類資源監控、保護和管理提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與形態學鑒定

2019 年8—11 月和2020 年5—8 月，在三峽庫區及各支流（太平溪、香溪河、小江、云陽、萬州、豐都、涪陵、巴南、箭灘河、涪江、嘉陵江）設置11個采樣點（圖1），漁具選擇地籠（網目1.2 cm）和單層多網目復合刺網等。在各采樣點進行捕撈、現場鑒定、記錄魚類體長及體重等生物學性狀。參考《中國鯉科魚類志》（伍獻文等，1982）、《四川魚類志》（丁瑞華，1994）和《Fishes of the World》（Nelsonet al.，2016）等對物種進行形態學鑒定。

圖1 三峽庫區魚類采樣點Fig. 1 Fish sampling sites in the Three Gorges Reservoir Area

共采集魚類標本18 466 尾，為獲取各物種不同地理種群的樣本，選取其中946 尾PCR 擴增，每個樣本取適量鰭條和肌肉保存于95%乙醇中用于COⅠ條形碼分析，隨后所有樣品用10%甲醛溶液浸泡成標本，保存于江漢大學動物遺傳學實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

取約100 mg 魚類肌肉組織或鰭條，采用高鹽法提取基因組DNA，COⅠ基因序列擴增引物序列為：F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’和R1：5’-TAGACTTCTGGGTGGGCCAAAGAATC-3’（Wardet al.，2005）。PCR 反應體系（30 μL）：2×Taq Master Mix（含Taq-DNA-Polymerase、PCR-Buffer 和dNTP，上海捷瑞）10.3 μL，正、反向引物（10 mmol·L-1）各1.5 μL，DNA 模板1.5 μL，雙蒸水15.2 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，31 個循環；72 ℃ 10 min；16 ℃ 20 min 或者結束后4 ℃保存。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天一輝遠生物科技有限公司完成純化回收和序列測定。

1.3 數據分析

通過DNAStar 中的SeqMan 對測序峰圖進行校對和拼接（Swindell & Plasterer，1997），獲得有效的樣本序列；利用MEGA 7.0 進行多序列比對和截取同源序列（Kumaret al.，2016），分析序列變異位點、信息位點、堿基組成情況，基于K2P 雙參數模型計算遺傳距離，可靠性經過1 000 次自舉檢驗；通過MEGA 7.0 計算分類學分辨率（種間平均遺傳距離/種內平均遺傳距離）；利用DNASP 5.0 計算物種單倍型數目（Librado & Rozas，2009）；通過MrBayes 3.2.3 構建貝葉斯系統進化樹（Ronquistet al.，2012），利用Tracer 1.6 檢查貝葉斯推測的飽和度（Suchardet al.，2018）；通過DNASP 5.0 計算采 樣點≥2，且樣本量≥30 魚類樣本的單倍型數目（Nh）、單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）。參考NCBI 和BOLD 數據庫檢索所有形態物種的COⅠ基因序列，將物種序列相似度≥97%的標本定義為同一物種（Wong & Hanner，2008），最后將測序序列提交至GenBank數據庫。

2 結果

2.1 物種形態鑒定結果

946 尾標本經形態學鑒定隸屬于6 目14 科55 屬71 種（附錄Ⅰ），鯉形目Cypriniformes 鯉科Cyprinidae 物種最多（39 種，55%），其次是鲿科Bagridae（8種，11%）。

2.2 DNA條形碼序列分析

PCR 擴增獲得946 條COⅠ基因序列，共計303個單倍型，去除兩端不可靠的堿基后得到長度為639 bp 的COⅠ基因序列矩陣，將上述序列儲存在GenBank 數據庫（附錄Ⅰ）。NCBI 和BOLD 數據庫比對結果顯示，926 尾有98.12%以上的相似性，屬于66個物種；20 尾的相似性為91.34%～95.74%，鑒定到屬水平，定義為5 個未命名物種，DNA 條形碼鑒定率為93%。MEGA 7.0 分析表明，946 條COⅠ基因序列中包含變異位點287 個，簡約信息位點273 個，平均堿基組成T（28.7%）、C（27.8%）、A（25.3%）、G（18.2%），呈A+T偏倚性。

在K2P 模型下，種內遺傳距離為0～3.39%，平均為0.36%，銀飄魚Pseudolaubuca sinensis的最大，為3.39%（圖2）；屬內種間遺傳距離為2.41%～14.83%，平均為6.88%，洞庭小鰾Microphysogobio tungtingensis與樂山小鰾Microphysogobio kiatingensis之間的遺傳距離最小，為2.41%，光唇蛇Saurogobio gymnocheilus與 蛇Saurogobio dabryi的最大，為14.83%；屬間遺傳距離為6.25%～24.49%，平均為15.57%；科間遺傳距離為13.70%～26.68%，平均為19.97%。種間遺傳距離是種內遺傳距離的19.11倍（表1）。

表1 三峽庫區捕獲的71個物種在不同分類階元間基于K2P的遺傳距離Table 1 Genetic distance of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area within various taxonomic levels based on K2P

圖2 三峽庫區捕獲的71個物種的DNA條形碼間隙Fig. 2 DNA barcoding gaps of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area

2.3 系統發育與遺傳多樣性分析

基于GTR+I+G 模型構建的303條COⅠ單倍型序列的貝葉斯系統進化樹顯示（圖3），303 條COⅠ單倍型序列形成了71 個分支，同種序列都形成了具有較高支持率的單分支（后驗概率=1.00）。在屬水平上，除黃顙魚屬Tachysurus未聚為一支外，其余54 屬在屬水平上均各自聚為一支，支持率均為1.0。黃顙魚屬、屬Leiocassis和擬鲿屬Pseudobagrus聚為一支；在科水平上，鯉科的高體鳑鲏Rhodeus ocellatus、鳑鲏屬未命名種Rhodeussp.和大鰭Acheilognathus macropterus未聚在鯉科大支中；在目水平上，鱸形目Perciformes 未聚成單系。結果顯示，COⅠ基因序列適用于物種水平上的分類，不適用于屬及更高水平的分類。

選取三峽庫區優勢物種鰱Hypophthalmichthys molitrix、蛇、貝氏Hemiculter bleekeri、光澤黃顙魚Tachysurus nitidus、瓦氏黃顙魚Tachysurus vachellii和短頜鱭Coilia brachygnathus進行遺傳多樣性分析（表2）。6 種魚類480 尾標本中共有120 個單倍型，單個物種的單倍型數目為2～16個。6種魚類在不同采樣地均存在共享單倍型，其中，短頜鱭的單倍型均為共享單倍型。遺傳多樣性分析顯示，瓦氏黃顙魚、鰱和蛇的核苷酸多樣性較高，分別為0.012 9、0.010 5 和0.008 4。貝氏、光澤黃顙魚和短頜鱭的核苷酸多樣性均小于0.002 7；最高的單倍型多樣性出現在巴南的蛇種群（h=0.924），最高的核苷酸多樣性出現在巴南的瓦氏黃顙魚種群（π=0.012 9），最低的核苷酸多樣性和單倍型多樣性均出現在短頜鱭萬州種群（h=0.186，π=0.000 3）。

表2 三峽庫區捕獲樣本的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity of fish species captured in the Three Gorges Reservoir Area

3 討論

3.1 DNA 條形碼在三峽庫區魚類物種鑒定中的有效性

魚類DNA 條形碼最重要的作用就是對魚類鑒定進行分子水平上的輔助，彌補傳統形態學鑒定方法的不足，發現或糾正傳統分類學中隱含的錯誤，為有效利用魚類資源、保護魚類多樣性提供科學依據（McCuskeret al.，2013；Thomaset al.，2014；Wanget al.，2018；Shenet al.，2019）。本研究基于946 條DNA 條形碼序列，與NCBI 和BOLD 數據庫比對，鑒定出71 個物種，其中5 個為未命名種，鑒定率93%，這可能是COⅠ基因序列包含的遺傳信息有限，無法對個別物種實現種水平的物種鑒定或這5個未命名種的COⅠ基因序列還未被數據庫收錄。Hebert 等（2003）認為評價DNA 條形碼可行性的關鍵標準是種內遺傳距離不得大于2%。本研究中，三峽庫區魚類種內遺傳距離平均值為0.36%，高于北歐大陸架海洋魚類（0.21%）（Thomaset al.，2014）、印度尼西亞石斑魚科Epinephelidae物種（0.16%）（Fadliet al.，2021），但低于澳大利亞海洋魚類（0.39%）（Wardet al.，2005）、墨西哥和危地馬拉的淡水魚類（0.45%）（Valdez-Morenoet al.，2009）、北美淡水魚（0.73%）（Aprilet al.，2011）、法屬波利尼西亞、留尼汪島和馬達加斯加珊瑚礁海洋魚類（1.06%）（Hubertet al.，2012）和青藏高原高原鰍屬Triplophysa魚類（2.9%）（Liet al.，2017），這可能與魚類頻繁的基因交流和環境同質性有關。本研究屬內種間平均遺傳距離（6.88%）是種內平均遺傳距離（0.36%）的19.11 倍，符合Hebert 等（2003）提出的種間平均遺傳距離必須大于種內遺傳距離10倍以上的標準。最大種內遺傳距離均顯著小于其最小種間遺傳距離，能形成明顯的DNA條形碼間隙；貝葉斯系統進化樹中71 種魚類均形成各自的分支，且支持率較高。因此，利用線粒體COⅠ基因作為DNA 條形碼進行三峽庫區魚類物種鑒別是可行的。

3.2 DNA條形碼在屬及屬水平以上分類不適用

在屬及屬水平以上沒有準確的種群分類可能是由于線粒體COⅠ基因序列的DNA 條形碼信息位點有限，在高級階元時堿基置換趨于飽和未能解析更高分類水平的系統發育關系，提示需要探索更多兼具保守性和差異性的DNA 序列來實現物種分類和鑒別（彭居俐等，2008）。

3.3 三峽庫區魚類遺傳多樣性

核苷酸多樣性指數和單倍型多樣性指數是衡量一個物種群體遺傳多樣的重要指標（Vrijenhoek，1994）。遺傳多樣性越高，對環境的適應能力越強，其進化潛力就越強（王瑾瑾等，2014）。本研究中太平溪、箭灘河和萬州的鰱種群、巴南和小江的瓦氏黃顙魚種群、巴南和香溪河的蛇種群呈高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，可能是這些物種在其采樣地擁有較穩定且持續壯大的種群或在種群演化過程中異域分化的譜系出現了二次交流，積累了大量的核苷酸突變。萬州的蛇種群、巴南和萬州的光澤黃顙魚種群、巴南、太平溪和萬州的貝氏種群呈較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，可能是這些種群在歷史上經歷了瓶頸效應，后來種群發生了快速擴張。太平溪和萬州的短頜鱭種群呈較低的單倍型多樣性和核苷酸多樣性。據歷史文獻資料記載，短頜鱭主要分布在長江及淮河流域的中下游地區，及與長江流域相通的淡水湖泊（袁傳宓，秦安舲，1984），截至2015 年未見短頜鱭在三峽庫區分布的記錄（楊麗亞等，2022）。三峽大壩的建立使三峽庫區由急流水生境變為緩流水生境（Gaoet al.，2010），迫使喜急流魚類向上游遷移，原有魚類的繁殖和攝食也受到影響，造成庫區生態位空缺（陳轍聿等，2022），為短頜鱭提供了適宜的棲息生境，三峽庫區的短頜鱭種群可能是中下游的短頜鱭種群通過葛洲壩、三峽大壩船閘擴散到三峽庫區形成的新種群（Yanget al.，2019；Zhaiet al.，2022）。為防止三峽庫區魚類遺傳多樣性遭到更嚴重破壞，應對短頜鱭等外來入侵種群開展科學動態監測和風險評估等相關研究，以期為庫區魚類種群生物多樣性保護和資源種群的科學管理提供技術支撐。