羊肚菌同工酶電泳條件的優化

羅 倩 羅明凱 向 準

（1貴州師范學院，貴州貴陽 550018；2貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009）

羊肚菌（Morchellaspp.）是一種珍稀的食用菌，因菌蓋表面狀如羊肚、凹凸不平而得名，味道鮮美，營養價值高[1-2]。近年來，隨著羊肚菌人工栽培面積的擴大，市場上出現了菌種質量參差不齊、管理混亂甚至同種異名的現象，增加了產業風險。目前，亟須尋找快速檢測指標，以鑒別良莠不齊的菌種。同工酶是一類具有相同催化反應功能但分子結構及理化性質不同的酶，早在20 世紀80 年代，同工酶電泳技術已在多種食用菌的菌種選育、分類鑒定、多樣性遺傳分析及代謝水平差異等方面得到了廣泛應用[3]，如靈芝[4]、平菇[5]、木耳[6]、灰樹花[7]、金針菇[8]、牛肝菌等[9]。在食用菌研究中，應用較多的同工酶是酯酶同工酶和過氧化物同工酶，但同工酶電泳結果的準確性和重復性會受到食用菌培養方式、凝膠濃度、電泳條件的影響。為此，我國于2006 年發布了中華人民共和國農業行業標準《食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法》（NY/T 1097—2006），標準中規定了樣品制備、電泳試劑配方、凝膠濃度，使操作更規范化，保證了結果的可重復性，但標準中適用的食用菌種類較少，集中在側耳類、茶樹菇、杏鮑菇、香菇、雙孢蘑菇。目前，關于羊肚菌同工酶電泳的報道較少，為此，本研究從凝膠濃度、染色條件及培養時間等方面優化羊肚菌同工酶電泳條件，以期為羊肚菌菌種資源鑒定及品種選育提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

羊肚菌GY-05，保存于貴州師范學院菌種室。

1.2 試驗試劑配制

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳進行過氧化物酶同工酶電泳和酯酶同工酶[10-12]分析（見表1、表2）。

表2 酯酶同工酶電泳試劑配制

1.3 試驗方法

1.3.1酶液的提取取培養7 d 羊肚菌菌絲體0.50 g，加1 mL樣品提取液和0.50 g石英砂，用冰浴研磨后將樣品在4 ℃、12 000 r/min 下離心20 min，取其上清液備用。

1.3.2制膠板厚度選擇不同制膠板厚度0.75、1.00、1.50 mm，分離膠7%，濃縮膠5%，電泳觀察結果。

1.3.3凝膠濃度參照文獻方法制備濃縮膠和分離膠，其中分離膠的濃度分別為7%、9%和12%。采用80 V 穩壓電泳，溴酚藍指示劑進入分離凝膠后，將電壓調為120 V，溴酚藍指示帶離底部1 cm 時停止電泳，染色后，觀察記錄結果。不同濃度分離膠配方見表3[3，10]。

表3 不同濃度分離膠配方

1.3.4培養時間將羊肚菌GY-06 置于22 ℃暗培養不同天數（4、6、8、10、12、15、17 d），按照優化條件進行酯酶同工酶電泳。

2 結果與分析

2.1 酯酶同工酶電泳條件優化

2.1.1制膠板厚度對羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響試驗選擇7.00%的分離膠濃度，研究不同制膠板厚度（0.75、1.00、1.50 mm）對羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響。當分離膠濃度為7%時，3種厚度的制膠1.3 板的電泳效果都不太好，染色酶帶較少，酶帶不清晰，但考慮上樣量的因素，選擇1.50 mm厚度的制膠板用于后續試驗。

2.1.2分離膠濃度對羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響結合國標和文獻，選擇7%、9%和12%的分離膠濃度進行羊肚菌酯酶同工酶電泳，結果見表4。由表4可知，分離膠濃度為12%時，羊肚菌酯酶同工酶酶帶清晰可辨，分離效果較好。

表4 分離膠濃度對羊肚菌酯酶同工酶電泳的影響

2.2 培養時間對酯酶同工酶電泳結果的影響

從圖1 和圖2 可知，羊肚菌GY-05 的培養時間會影響酯酶種類和數量的表達。每個泳道可分辨的酶帶為2～6條，7個時間處理總共有34條酶帶，Rf值為0.02～0.52，2 條共同酶帶的遷移率為0.06、0.16。培養4～6 d 的酯酶譜帶數量較少，隨著培養時間的增加，譜帶數量增加；培養10 d后，酯酶譜型基本保持不變，表達量上略有差異。綜合考慮時間成本和電泳效果，選擇最優培養時間為10 d。

圖1 菌株GY-05第21代酯酶同工酶酶譜

圖2 菌株GY-05酯酶同工酶譜模式

2.3 羊肚菌過氧化物同工酶染色條件優化

為了獲得清晰的羊肚菌過氧化物同工酶酶譜，試驗考慮了凝膠濃度、供氫體和底物濃度等因素，比對了5種染色方法的效果，其結果如表5、圖3所示。由表5、圖3可知，分離膠濃度為12%，方法二染色時能得到清晰酶譜（圖3），譜帶數量為3～4條，其余方法均無法達到分析要求。羊肚菌過氧化物同工酶最適的染色液配方為5 mL 醋酸聯苯胺溶液，2 mL 3%H2O2，93 mL H2O。

圖3 過氧化物同工酶酶譜（方法二染色）

表5 羊肚菌GY-05過氧化物同工酶電泳染色結果

3 討論與結論

同工酶技術作為一項可靠的分子標記技術，具有快速、直觀、靈敏、簡單、遺傳穩定、不易受外界環境影響、酶譜類型豐富等特點[13]，是從基因產物水平來研究生物的遺傳變異，從蛋白質水平上研究生物群體遺傳分化的重要手段之一，它彌補了以菌落形態、顏色、孢子形態、子實體形態等特征分類的傳統方法的不足，可應用于菌種選育、分類鑒定[14]。根據食用菌種類的不同，電泳條件特別是凝膠濃度也隨之發生變化，茶樹菇[15]和香菇[16]的分離膠濃度為7%，雙孢蘑菇的分離膠濃度為9%[17]?！妒秤镁N真實性鑒定酯酶同工酶電泳法》中尚無關于羊肚菌電泳的相關標準，這為酯酶同工酶電泳法在羊肚菌研究中的利用帶來了不便。本試驗從凝膠濃度、培養時間、試劑配方、染色條件等方面探索了羊肚菌酯酶同工酶電泳的最佳條件，即1.5 mm 膠板、12%濃度分離膠、5%濃縮膠，樣品培養時間為10 d。任桂梅等[18]在研究羊肚菌不同生長期酯酶同工酶采用的分離膠濃度為10%，這可能因為子實體部分的酶種類和分子量不同，但羊肚菌酯酶同工酶電泳分離膠濃度與國標中大多數食用菌分離膠濃度7%有差異。本研究發現，同一菌株在不同培養時間酯酶同工酶的種類和表達數量有差異，在杏鮑菇的相關研究中也出現類似結果[19]，這可能是由翻譯后基因產物的修飾或基因位點變化所引起的。綜上，利用同工酶進行食用菌菌種選育和鑒定時，除固定電泳條件外，還應固定最佳的培養時間，才能保證結果的穩定性和準確性。

過氧化物酶是廣泛存在于各種動物、植物和微生物的一類氧化酶，以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，其供氫體較多[20]。過氧化物同工酶的電泳分析中，影響酶帶清晰度的因素除凝膠質量外，染色液的配比也很關鍵。本研究發現，過氧化氫用量會影響過氧化物同工酶酶帶顏色的深淺，當電泳條件相同時，含3% H2O2的染色液的呈色效果優于30% H2O2染色液，這與陳紅兵等[21]的研究結果相一致，這可能是底物抑制現象，納摩爾水平的過氧化氫可導致血卟啉中間體的降解[22]。本試驗電泳得到的過氧化物酶酶帶條帶較少，這可能與羊肚菌分解利用木質素的能力較弱，淀粉酶活力較高相關[23]，因此，不建議過氧化物酶同工酶作為羊肚菌檢測遺傳多樣性的生化標記。