附子中內源性組分新烏頭堿的毒性作用

陳錦萍,徐夢佳,郭 嫻,萬益群,郭 嵐

(南昌大學化學化工學院,江西 南昌 330031)

烏頭的側根,在中國被稱為“附子”[1],為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx)的子根加工品[2],主要分布于四川、陜西、甘肅等地[3-5]。附子味辛、甘,性大熱,具有回陽救逆,補火助陽,散寒止痛等功效[6],在我國已有幾千年的醫用實踐?！渡褶r本草經》中記載:附子主治風寒咳逆,邪氣,溫中,金創,破徵堅積聚,血瘕,寒濕,痿躄,拘攣,膝痛不能步行?，F代藥理學研究表明,附子具有強心、抗心律失常等作用[7]。附子中含有烏頭類生物堿、黃酮以及多糖等多種組分,其中,烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等烏頭生物堿是其重要的內源性組分[8],具有鎮痛[9-10]、抗炎[11-13]、抗癲癇、抗抑郁、抗癡呆[14]抗腫瘤[15-16]、抗病毒[17]、提高免疫功能[18]等多種生理活性。

附子也具有一定的毒性,且安全系數窄,其治療劑量接近于中毒劑量。有報道稱,全球范圍內由附子引起的中毒病例已超過5000例,因此附子的安全性也受到了高度關注。有研究表明,烏頭堿、次烏頭堿以及新烏頭堿等雙酯型烏頭生物堿是其主要的毒性成分[19]。Ye qiang等[20]研究了3種雙酯型烏頭堿(烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿)和3種單酯型烏頭堿(14-α-苯甲酰烏頭堿、14-α-苯甲酰新烏頭堿、14-α-苯甲酰次烏頭堿)對斑馬魚胚胎的生物效應,發現雙酯型烏頭堿的心臟毒性、器官毒性以及功能毒性均比單酯型烏頭堿強。雷懷成[21-24]等發現烏頭堿在給藥后短時間內,會導致腦神經細胞、心肌細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞的凋亡數量明顯增加。Gao等[25]研究認為烏頭堿能通過部分線粒體依賴性凋亡途徑誘導H9c2心肌凋亡。都姣嬌等[26]報道了心肌細胞的存活率會隨著次烏頭堿濃度的升高而下降。目前,附子中的烏頭堿以及次烏頭堿的毒性研究較多,而結構與烏頭堿和次烏頭堿有一定差別的新烏頭堿毒性評估報道較少,且主要集中在心肌細胞層面[27-28]。同時,毒性評估的方法和方案也不統一,導致結論有偏差?；诖?本文選擇新烏頭堿為研究對象,以SD大鼠為模型動物,依據《食品安全國家標準-急性經口毒性試驗》(GB 15193.3-2014)中的霍恩氏法,開展新烏頭堿對大鼠的急性經口毒性評價,并探究新烏頭堿對于大鼠的主要臟器(包括心臟、肝臟以及腎臟)的毒性作用,為附子的安全使用提供一定的科學依據。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與材料

新烏頭堿(純度≥99.47%,購自廣東雋沐生物科技股份有限公司);玉米油(食品級);蘇木素-伊紅染液購自武漢市皮諾飛生物科技有限公司;10%福爾馬林中性固定液購自南昌雨露實驗器材有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒和磷酸鹽緩沖液(PBS)購自白鯊生物科技有限公司;脂質過氧化物(LPO)和誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

JJ-12J型脫水機、JB-B5型包埋機JB-L5型凍臺均購自于武漢俊杰電子有限公司;RM2016型病理切片機購自于上海徠卡儀器有限公司;KD-P型組織攤片機購自于浙江省金華市科迪儀器設備有限公司;DHG-9140型烤箱購自上?；厶﹥x器制造有限公司;10212432C型載玻片及蓋玻片購自于江蘇世泰實驗器材有限公司;NIKON ECLIPSE CI型正置光學顯微鏡和NIKON DS-U3型成像系統均購自日本尼康有限公司;CL-21M型冷凍離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司;E-330全波長多功能酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠50只,雌雄各半,體重為180～220 g。大鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,實驗單位使用許可證編號為SYXK(贛)2015-0001,動物許可證號為SCXK(湘)2019-0004。給藥前,所有大鼠在試驗環境中進行5 d環境適應,環境溫度為24 ℃±2 ℃,相對濕度50 % ± 10 %,按性別分籠飼養,試驗期間喂基礎飼料,飼料由湖南嘉泰實驗動物有限公司提供,飼料許可證號為SCXK(湘)2020-0006,自由飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物給藥

SPF級SD大鼠50只,按性別隨機分成10組,雄性和雌性均分為1個對照組和4個給藥組,每組5只。給藥組灌胃新烏頭堿,雄性給藥組劑量分別為1.00、2.15、4.64、10.0 mg·kg-1,雌性給藥組劑量分別為0.464、1.00、2.15、4.64 mg·kg-1,對照組灌胃相同體積的食用級玉米油。以上各組大鼠均按體質量10 mL·kg-1一次性經口灌胃。灌胃前大鼠禁食16 h左右,自由飲水,灌胃后,禁食3～4 h。之后自由飲食和飲水,持續觀察14 d。

1.4.2 臨床觀察

連續14 d觀察大鼠的毛發、眼部、皮膚、活動狀態以及精神狀態。在實驗開始前以及實驗結束后稱大鼠的體重,并且每周稱1次體重。觀察期內若發現動物死亡,立即解剖,肉眼觀察其心臟、肝臟以及腎臟病理形態變化,并記錄各組死亡大鼠數量。

1.4.3 臟器指數的測定與分析

14 d實驗結束后,對所有大鼠進行處死解剖,取心臟、肝臟以及腎臟并且稱重,計算各大鼠各個器官的臟器指數(臟器指數=臟器重量/體重*100 %)。

采用SPSS26.0軟件分析臟器指數的數據。用單因素方差分析法(ANOVA)分析兩組間臟器指數數據的差異性。根據最小顯著性差異法(LSD),P<0.05為具有顯著性差異,其中,P<0.01為差異十分顯著。

1.4.4 組織病理學分析

將解剖的心臟、肝臟、腎臟稱重后用10 %的福爾馬林固定液固定24 h以上后,經過乙醇梯度脫水,石蠟包埋,切片機切片,蘇木素-伊紅(HE)染色等一系列程序后,在光學顯微鏡下進行病理組織形態學研究。

1.4.5 氧化應激能力指標的測定

將解剖的大鼠肝臟、腎臟稱重后于-80 ℃冷藏24 h以上,之后取一定量的肝臟組織和腎臟組織,與一定比例的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)混合研磨后,按試劑盒規定的轉速,在4℃條件下離心,取上清液。接著使用相關試劑盒測定肝臟和腎臟的誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、腎臟的脂質過氧化物(LPO)以及肝臟的丙二醛(MDA),之后采用SPSS26.0軟件分析氧化應激能力指標的數據。

2 結果與討論

2.1 大鼠的一般狀況

對于雄性大鼠,大部分低劑量給藥組(1.00、2.15 mg·kg-1)的大鼠在給藥24 h之內表現出呆滯、嗜睡、食欲下降等癥狀。少部分還出現震顫、驚厥、流涎、痙攣、叫聲異常、昏迷、體位異常、流淚、鼻翼扇動豎毛等現象。24 h過后,除了個別表現呆滯的,其余皆恢復正常,食欲增加,此兩個劑量的大鼠無死亡。而中高劑量組(4.64、10.0 mg·kg-1)的大鼠給藥后2 h內5只大鼠皆不同程度地出現與低劑量給藥組(1.00、2.15 mg·kg-1)一樣的中毒癥狀,小部分還出現眼睛和鼻孔出血、流淚、抽搐。在給藥4 h內,這兩個給藥組大鼠相繼全部死亡。各組大鼠死亡數如表1所示。

對于雌性大鼠,給藥劑量為0.464 mg·kg-1的大鼠在給藥6 h之內出現昏睡、呆滯、震顫、心跳異常,食欲下降,其中1只出現流涎和冷汗。8 h之后開始恢復正常,此劑量無大鼠死亡。劑量為1.00 mg·kg-1的大鼠在給藥24 h之內表現出呆滯、嗜睡、食欲下降等癥狀,少部分還出現流涎、痙攣、叫聲異常、昏迷、體位異常、流淚、鼻翼扇動、豎毛、冷汗、腹瀉、眼睛以及鼻孔出血等現象。24 h過后恢復正常,食欲增加,此劑量組有1只大鼠死亡。對于劑量為2.15和4.64 mg·kg-1的大鼠給藥后4 h內5只大鼠皆不同程度地出現震顫、驚厥、不安、痙攣、呆滯、嗜睡、昏迷、體位異常、叫聲異常、豎毛、冷汗、鼻翼扇動、抽搐。一部分出現流涎、腹瀉、眼睛以及鼻孔出血等現象。在給藥8 h內,全部動物相繼死亡。各組大鼠死亡數如表2所示。解剖實驗中死亡的大鼠,肉眼可見其心臟顏色變黑變暗甚至有變硬現象,而肝臟和腎臟未見有明顯的改變。初步判斷,新烏頭堿在短時間內會對大鼠的心臟以及神經系統造成明顯的作用。有研究報道烏頭類生物堿對迷走神經有強烈的興奮作用,釋放出乙酰膽堿作用于心臟,極易形成室性混亂性心律,如室早、室速甚至室顫[29],也有文獻指出雙酯型烏頭生物堿可使心肌細胞內Ca2+穩態失衡,從而引起心律失常[30,31]。本實驗觀察到的現象說明新烏頭堿可能與其它烏頭類生物堿一樣,會影響大鼠的神經系統和心臟功能。

給藥組的雄性大鼠和雌性大鼠的死亡數分別見表1和表2,依據《食品安全國家標準-急性經口毒性試驗》(GB 15193.3-2014)中LD50的測定方法,得出雄性大鼠的LD50約為3.16 mg·kg-1,雌性大鼠的LD50約為1.26 mg·kg-1?？梢钥闯鲂坌员却菩缘哪褪苄愿鼜?造成這種差異的原因可能是與不同性別大鼠的身體組成、激素、肝臟代謝、腎臟清除能力、蛋白質結合與分布的差異有關[32-33]。

表1 雄性大鼠各給藥組的死亡數Tab.1 Death number of male rat dose group

表2 雌性大鼠各給藥組的死亡數Tab.2 Death number of female rat dose group

2.2 新烏頭堿對大鼠體重的影響

在14 d的觀察期內,存活下來的各個劑量組的大鼠平均體重變化趨勢見圖1。由圖中可以看出,雄性大鼠給藥組和雌性大鼠給藥組的體重變化趨勢與各自的對照組相比,均無明顯差異。這說明單次給藥,如果大鼠能夠存活下來,新烏頭堿對大鼠的生長沒有顯著影響。

t/d

2.3 新烏頭堿對大鼠臟器指數的影響

臟器指數是指實驗動物的某個臟器與其體重的比值,是毒理學實驗中常用的指標。當動物的臟器因染毒受損后,其臟器的重量也往往隨之改變,從而引起了臟器指數的變化。一般來說,臟器指數增大,則提示著臟器充血、水腫或增生肥大等;而臟器指數減小,則提示著臟器萎縮、缺血、發育不良等變化。本實驗用臟器指數來研究新烏頭堿對大鼠心臟、肝臟、腎臟的影響,結果見表3。雌雄大鼠各給藥組的肝臟指數和腎臟指數與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05);雄性2.15 mg·kg-1組的心臟指數與對照組相比差異十分顯著(P<0.01),而雌性0.464 mg·kg-1組和1.00 mg·kg-1組的心臟指數與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。初步表明了新烏頭堿對大鼠的心臟有明顯的影響,并且對雌性大鼠的影響更明顯。

表3 新烏頭堿對大鼠臟器指數的影響
Tab.3 Effect of mesaconitine on organ coefficient of rats

劑量組心臟指數/g(100 g)-1肝臟指數/g(100 g)-1腎臟指數/g(100 g)-1雄性對照組0.38±0.01a3.79±0.200.45±0.01雄性1.00 mg·kg-10.42±0.073.91±0.550.42±0.03雄性2.15 mg·kg-10.49±0.07??3.67±0.260.42±0.01雌性對照組0.32±0.063.67±0.450.41±0.02雌性0.464 mg·kg-10.41±0.07?4.05±0.380.41±0.05雌性1.00 mg·kg-10.40±0.05?3.60±0.160.40±0.03

*表示與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05),**表示與對照組比較,差異十分顯著(P<0.01)。a:表示平均值±標準偏差。

2.4 組織病理學分析

通過光學顯微鏡對大鼠的心臟、肝臟和腎臟的病理切片進行分析,結果如圖2～4所示。由圖2可知,與對照組相比,各給藥組雌雄大鼠心臟心肌細胞水腫,間質血管擴張充血。由圖3可知,各給藥組雌雄大鼠肝臟有脂肪空泡或變性,并且有肝細胞壞死,雄性2.15 mg·kg-1組和雌性1.00 mg·kg-1組大鼠肝臟的匯管區見炎細胞浸潤。由圖4可知,

(a:雄性對照組;b:雄性1.00 mg·kg-1組;c:雄性2.15 mg·kg-1組;d:雌性對照組;e:雌性0.464 mg·kg-1組;f:雌性1.00 mg·kg-1組)。

各給藥組大鼠腎臟都存在著腎小管水腫,腎間質血管擴張充血,并且雄性各給藥組大鼠腎臟出現部分腎小球纖維組織增生,雌性0.464 mg·kg-1組大鼠腎臟出現少量炎細胞浸潤。病理組織學分析結果表明,一定劑量的新烏頭堿會對大鼠肝臟造成一定的損傷。

2.5 新烏頭堿對大鼠臟器氧化應激能力的影響

iNOS能夠誘導機體產生NO,當機體NO濃度太高時,會對機體造成損傷。LPO和MDA經常被作為脂質過氧化的指標,脂質過氧化會對細胞產生毒害作用,組織中LPO以及MDA的含量越高,提示著組織的損傷越大。根據組織病理學結果,本實

表4 新烏頭堿對大鼠氧化應激能力的影響Tab.4 Effect of mesaconitine on oxidative stress capacity of

*表示與對照組比較,差異具有顯著性(P<0.05),**表示與對照組比較,差異十分顯著(P<0.01)。a:表示平均值±標準偏差。

驗通過測定肝臟和腎臟的氧化應激能力的指標來研究新烏頭堿對大鼠肝臟、腎臟的影響,結果見表4。各給藥組雌雄大鼠的肝臟MDA指標、腎臟iNOS指標以及腎臟LPO指標與對照組大鼠相比不具有顯著性差異(P>0.05)。雌性1.00 mg·kg-1組大鼠和雄性1.00 mg·kg-1組大鼠的肝臟iNOS指標與雌雄對照組大鼠相比具有顯著性差異(P<0.05),而雄性2.15 mg·kg-1組大鼠的肝臟iNOS指標與雄性對照組大鼠相比差異十分顯著(P<0.01)。表明了一定劑量的新烏頭堿對大鼠的肝臟有明顯的損傷。

3 結論

本文通過14 d急性經口毒性實驗,探討了附子中內源性組分新烏頭堿的生物效應,得到新烏頭堿對雄性大鼠和雌性大鼠的LD50分別為3.16和1.26 mg·kg-1,表明新烏頭堿對生物具有較強毒性。病理組織學分析結果表明,一定劑量的新烏頭堿會對大鼠肝臟造成一定的損傷,氧化應激能力指標也進一步驗證了一定劑量的新烏頭堿的確會對大鼠肝臟造成損傷。因此,在使用附子時要注意其劑量以及使用周期。