惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710和circRNA_0079593的水平表達及其臨床價值

張曉宇，張亞茹，張 瑩，蔣志芳，劉惠敏（保定市第二中心醫院檢驗科，河北涿州 072750）

惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高、預后較差的皮膚科腫瘤[1]。由于缺乏對致癌基因的了解和鑒定，使得惡性黑色素瘤的早期診斷及治療存在局限性。近年來研究發現，環狀核糖核酸（circular RNA，circRNA）在惡性黑色素瘤組織和正常組織中具有顯著性差異表達，參與惡性黑色素瘤的發生發展，可能為該病的診斷及靶向治療帶來幫助[2-3]。以往的研究指出，circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中存在異常表達，參與疾病的發生發展過程，在惡性黑色素瘤的早期發現及指導治療等方面均具有重要意義[4-5]。由此我們推測，circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中發揮關鍵作用，可能是惡性黑色素瘤的潛在分子標志物。然而，關于circRNA_0020710及circRNA_0079593是否可作為預測惡性黑色素瘤發生及疾病進展的生物標志物尚未清楚。因此，本研究通過檢測惡性黑色素瘤組織circRNA_0020710及circRNA_0079593的表達，分析其診斷惡性黑色素瘤及預測淋巴結轉移的價值，旨在為該病的診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對象 61例皮膚惡性黑色素瘤患者選自2019年1月～2022年3月保定市第二中心醫院，男性37例，女性24例，年齡35～72（55.62±10.18）歲。納入標準：①符合中國惡性黑色素瘤規范化病理診斷專家共識(2017年版)[6]；②>18歲，行手術切除術，有完整臨床資料和結果。排除標準：①已接受過其他方法治療；②并發免疫性疾病、感染性疾病及其他惡性腫瘤者。22例患者發生淋巴結轉移，39例患者無淋巴結轉移；組織學分級，41例Ⅰ～Ⅱ級，20例Ⅲ～Ⅳ級；腫瘤部位：36例四肢和軀干（肢端），25例消化道、鼻和泌尿系黏膜（非肢端）；分化程度：34例中高分化，27例低分化。

1.2 儀器和試劑 ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；逆轉錄試劑盒，PCR試劑盒和Trizol試劑盒（Qiagen公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。

1.3 方法 采集惡性黑色素瘤組織和正常組織（取距病灶>2cm的正常皮膚組織），使用Trizol試劑提取組織總RNA（將組織樣本置于液氮內研磨，每50～100mg樣本加Trizol 1ml），置于-80℃保存待檢。circRNA_0020710及circRNA_0079593檢測：circRNA_0020710引物（上游：5’-AGCACTGC TTGATGCTCGAACTA-3’，下游：5’-TATCGCCTAC GAGTACTACTG-3’），circRNA_0079593引物（上游：5’-AGACTAGCTATCTGATGAGAATA-3’，下游：5’-TACACGGTACAGCTCAATGTG-3’）。以甘油醛3-磷酸脫氫酶為內參基因（上游：5’-TCAGCTG ATGCTAGGAGCGTAT-3’，下游：5’-ACGACTGG CACTGTTACGCT-3’），用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測circRNA。反應條件為：95℃預變性5min（1個循環）；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，40個循環。采用2-△△Ct法計算circRNA表達水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS20.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。應用受試者工作特征（ROC）曲線分析circRNA_0020710及circRNA_0079593診斷惡性黑色素瘤及預測淋巴結轉移的價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593表達 惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平均明顯高于正常組織（4.95±2.37 vs 1.84±0.92，2.70±1.15 vs 0.91±0.34），差異具有統計學意義（t=18.946，15.248，均P<0.001）。

2.2 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達與惡性黑色素瘤患者的臨床特征 見表1。惡性黑色素瘤患者circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平升高與組織分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤部位、低分化及淋巴結轉移有關，差異具有統計學意義（均P<0.001）。

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平與惡性黑色素瘤患者臨床特征的關系（±s）

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平與惡性黑色素瘤患者臨床特征的關系（±s）

類 別ncircRNA_0020710t值P值circRNA_0079593t值P值年齡（歲）＜55284.74±2.281.2140.1522.60±1.101.1640.173≥55335.21±2.462.86±1.24性別男375.07±2.411.1360.1772.65±1.080.9840.251女244.82±2.302.78±1.20組織分級Ⅰ～Ⅱ級413.87±1.9616.712<0.0012.15±0.9813.328<0.001Ⅲ～Ⅳ級206.35±3.463.60±1.76腫瘤部位肢端364.61±2.089.620<0.0012.36±1.0411.106<0.001非肢端255.62±2.743.48±1.71分化程度中高分化344.09±1.9415.708<0.0012.40±1.0310.415<0.001低分化276.14±3.183.42±1.68潰瘍有295.30±2.511.6300.0942.92±1.281.4180.106無324.67±2.242.56±1.05淋巴結轉移有226.80±3.7020.713<0.0014.02±1.8118.635<0.001無393.26±1.551.64±0.72

2.3 circRNA_0020710及circRNA_0079593對惡性黑色素瘤的診斷價值 見表2和圖1。circRNA_0020710及circRNA_ 0079593診斷惡性黑色素瘤的最佳截斷值為3.15和1.78，其診斷惡性黑色素瘤的曲線下面積均大于0.800，敏感度分別為84.6%和81.0%，特異度分別為82.4%和77.5%。

圖1 circRNA_0020710及circRNA_0079593診斷惡性黑色素瘤的ROC曲線

表2 circRNA_0020710及circRNA_0079593對惡性黑色素瘤的診斷價值

2.4 circRNA_0020710及circRNA_0079593預測淋巴結轉移的價值 見表3和圖2。circRNA_0020710及circRNA_0079593預測淋巴結轉移的最佳截斷值為4.83和2.75，其預測淋巴結轉移的曲線下面積均大于0.835，其敏感度分別為87.4%和84.0%，特異度分別為85.7%和80.8%。

圖2 circRNA_0020710及circRNA_0079593預測淋巴結轉移的ROC曲線

表3 circRNA_0020710及circRNA_0079593預測淋巴結轉移的價值（%）

3 討論

惡性黑色素瘤是一種侵襲能力強、惡性程度高，極易發生淋巴結及致死率高的皮膚癌，嚴重威脅人類健康[7]。最近有報道稱，一些circRNA在惡性黑色素瘤中有差異表達，細胞或組織特異性表達使其成為合適的候選診斷或治療生物標志物[8]。CONG等[8]研究指出，circRNA_0020710作為一種致癌基因，在惡性黑色素瘤中調控異常，并參與了癌變過程，對惡性黑色素瘤的發生發展影響較大。另有研究認為，circRNA_0079593參與惡性黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，可能在惡性黑色素瘤的癌變過程及治療方面發揮重大的作用，臨床應用前景較好[9]。

本研究顯示，與正常組織比較，惡性黑色素瘤組織circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平均明顯升高，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中呈高表達，其可能是促進惡性黑色素瘤發生的主要基因之一。KHORSANDI等[10]研究表明，一些circRNA_0025039在惡性黑色素瘤組織中顯著上調，在惡性黑色素瘤的增殖、侵襲、轉移和遷移中發揮關鍵作用，參與惡性黑色素瘤癌變的進展。本研究組織分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤部位非肢端、低分化和淋巴結轉移的患者，circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平均顯著增加，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平升高與疾病進展有關，其高表達可能促進惡性黑色素瘤的進展過程。MONTICO等[11]研究發現，惡性黑色素瘤組織和細胞中circRNA_0084043顯著上調，circRNA_0084043的高表達促進細胞增殖、遷移和生長，在惡性黑色素瘤的發生發展中起重要作用。

本研究circRNA_0020710及circRNA_0079593單項指標對惡性黑色素瘤診斷及其預測淋巴結轉移均具有一定價值，其敏感度和特異度均較好，說明circRNA_0020710及circRNA_0079593可作為惡性黑色素瘤的診斷及預測淋巴轉移的分子標志物，對疾病的診斷及預測淋巴結轉移有很好的幫助。HAO等[12]研究發現，與正常對照組相比，circRNA_0079593在惡性黑色素瘤組織和細胞系中顯著高表達，其過表達顯著提高了惡性黑色素瘤細胞的增殖率和侵襲能力，可能是惡性黑色素瘤新的生物標志物。另有研究認為，circRNA_0079593作為惡性黑色素瘤發生的關鍵調控因子，參與疾病的發生發展、侵襲和轉移，可作為惡性黑色素瘤潛在的診斷、治療和預測生物標志物[13]。

綜上所述，惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593水平明顯升高，與組織分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤部位、低分化及淋巴結轉移有關，其對惡性黑色素瘤診斷及預測淋巴結轉移均具有很好的價值，可作為該病診斷及病情判斷的分子標志物。但本研究病例來源較單一，樣本量較少，未來仍需更多的臨床研究進一步證實。