紅蕓豆miR395 家族成員的鑒定及其與結瘤相關的表達分析

王東梅，孫麗麗，鄭江濤，王利祥，郭數進

（山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801）

蕓豆（Phaseolus vulgaris.L）是世界上最重要的經濟豆類作物之一，是豆科植物菜豆屬籽食性作物的總稱。蕓豆富含多酚化合物，多酚是具有有效抗氧化特性的次生代謝物，有助于減少氧化應激引起的疾病[1]。紅蕓豆富含維生素C，鈣和鐵含量高，蛋白質含量和B 族維生素含量高于雞肉；紅蕓豆富含花色苷和皂苷，有降低關節局部炎性組織和緩解疼痛的功效，因此，紅蕓豆是人們的理想食材，也是山西糧食出口的特色產品[2-4]。紅蕓豆結瘤固氮，是倒茬養地的重要作物，必將在種植業結構調整、居民膳食結構改善及區域糧食基本自給中發揮重要的作用；固氮不僅是保障紅蕓豆高產的關鍵，也是防止氮肥過度施用減輕環境問題的關鍵作物[5-7]。

近些年，許多研究報道了microRNA 調節豆科植物的結瘤固氮過程，比如在蒺藜苜蓿中，mtrmiR156通過影響苜蓿的固氮效率和苜蓿根系的再生能力調節固氮[8]；在大豆中，gma-miR172c通過靶向下游的NNC1來調節大豆結瘤起始[9]；在花生中，ahy-miR399、ahy-miR159和ahy-miR3508等microRNA 都參與調控花生結瘤[10]。MicroRNA（miRNA）是一類常見于真核生物中的內源性非編碼RNA，一般由20～22 個核苷酸組成[11]。在植物中，miRNA 通常與靶基因內的互補位點結合，實現在轉錄后水平抑制靶基因的表達，從而調節植物生長、發育和對逆境的響應。研究發現，擬南芥miR395通過靶向調控ATP 磺?；福ˋPS）編碼基因表達而影響其硫酸鹽的積累和分配[12]；水稻miR395靶向抑制硫酸鹽轉運蛋白基因（AST）的表達，促進硫酸鹽積累，miR395過表達的株系中表現出對細菌病原體的廣譜抗性[13]。值得注意的是，miR395是調節硫吸收和轉運的關鍵調節因子，而硫元素作為植物的必需營養素，是一些氨基酸、金屬輔因子、輔酶和次生代謝產物的關鍵組成元素[14]。硫饑餓會影響植物的生長、光合作用和產量。在豆科植物中，硫吸收正向調控結瘤固氮（SNF），硫饑餓會導致結瘤減少、抑制固氮效率和降低根瘤代謝等現象[15]，因此，推測其可能參與調節豆科植物的共生結瘤過程。

為探明miR395家族成員是否響應根瘤菌的侵染調控共生結瘤，本研究利用生物信息學對蕓豆的miR395家族成員（pvu-miR395）進行全基因組鑒定，并對其染色體分布、堿基保守性、二級結構進行系統分析，預測pvu-miR395家族成員的啟動子順式作用元件和靶基因，并利用實時熒光定量PCR檢測pvu-miR395家族成員在紅蕓豆根瘤的表達和對根瘤菌侵染的響應情況，旨在為進一步深入研究pvu-miR395家族在蕓豆生長發育和結瘤固氮中的生物學功能提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試紅蕓豆品種是品金蕓4 號，由山西農業大學農業基因資源研究中心暢建武研究員和郝曉鵬博士提供。

1.2 方法

1.2.1 蕓豆miR395的全基因組鑒定 從PmiREN[16]數據庫（https://www.pmiren.com/）獲取pvu-miR395家族成員的前體序列、成熟序列以及在染色體上的位置信息。

1.2.2 蕓豆miR395的序列及結構分析 根據在PmiREN 數據庫下載的pvu-miR395家族成員成熟序列和星標序列，利用MEGA-X 軟件對其進行序列比對，然后通過WebLogo（https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析pvu-miR395家族成員成熟序列和星標序列的堿基保守性。使用RNAfold（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預測pvu-miR395前體的二級莖環結構，采用折疊算法選擇最小自由能和分配函數。

1.2.3 構建pvu-miR395家族的進化樹 從Pmi-REN 數據庫中下載大豆（Glycine max）、苜蓿（Medicago truncatula）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的miR395家族成員的前體序列，利用MEGA-X 軟件構建pvu-miR395家族成員前體序列和以上4 個物種的miR395前體序列的進化樹，采用最大似然法計算，系統參數設置為默認值。

1.2.4pvu-miR395家族成員的啟動子順式作用元件分析 在PmiREN數據庫下載pvu-miR395家族成員的上游2 000 bp作為其啟動子序列，輸入PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線數據網站，對其順式作用元件進行預測分析。利用TBtools 軟件對pvu-miR395基因家族順式作用元件進行分析并繪制熱圖。

1.2.5pvu-miR395靶基因預測 使用psRNATarget（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/）預測pvu-miR395的靶基因，系統參數設置為默認值。選取最大期望值≤2 的基因作為靶基因，分析pvumiR395與候選靶基因的相互作用位點。此外，使用Phytozome 數據庫（https://phytozome-next.jgi.doe.gov）對所預測的靶基因進行功能注釋。

1.2.6 RNA 提取和qRT-PCR 分析 紅蕓豆培養至長出三出復葉，用OD600=0.08 的蕓豆根瘤菌R.etliCFN42（Bradyrhizobium etli）[17]處理紅蕓豆幼苗，采集接菌28 d 后的根、葉和根瘤組織，檢測pvumiR395基因家族成員在這3 個組織中的相對表達水平。同時，采集接菌后0、1、3、6、12、24 h 的根組織，檢測pvu-miR395基因家族在這6 個時間點的相對表達水平。

用Trizol 法提取蕓豆的RNA[18]，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測RNA 純度和含量。使用反轉錄試劑盒TransScript?miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 將其反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板進行qPCR 檢測，上游的特異引物根據所檢測的miR395成熟序列進行設計（表1），下游的引物均為反轉錄試劑盒自帶引物Universal miRNA qPCR Primer，用U6作為內參基因[19]。實時熒光定量PCR 采用試劑盒PerfectStart?Green qPCR SuperMix，根據說明書對樣品進行qRT-PCR 操作。

表1 研究所用的引物序列Tab.1 Primer sequence in this study

1.3 數據分析

按照公式（2－ΔΔCt，ΔCt＝Ct 目標基因-Ct 內參基因）進行數據分析，為了保證試驗的準確性，每個樣品3 個技術重復。設定處理前（0 h）的材料數據為對照進行相對表達量分析。

2 結果與分析

2.1 pvu-miR395 家族成員的鑒定及染色體定位分析

為系統鑒定pvu-miR395家族成員，本研究從PmiREN 數據庫搜索共獲得位于蕓豆基因組的8 個miR395家族成員，分別命名為pvu-miR395a～pvu-miR395h（表2）。其中，pvu-miR395家族成員的成熟序列和星標序列均含有21 個堿基，成熟序列比對結果顯示，pvu-miR395a、pvu-miR395b和pvu-miR395c高度保守，pvu-miR395e、pvu-miR395f和pvu-miR395g高度保守（圖1-A）。星標序列比對結果同樣顯示其堿基高度保守（圖1-B）。pvumiR395家族分布在第2 號和第3 號染色體上，其中，第2 號染色體上包含pvu-miR395395a、pvumiR395b、pvu-miR395c和pvu-miR395d等4 個成員，其余的pvu-miR395e、pvu-miR395f、pvumiR395g和pvu-miR395h位于第3 號染色體上。

圖1 pvu-miR395 家族成員成熟序列（A）和星標序列（B）堿基保守性分析結果Fig.1 Conservative analysis of mature sequence（A） and star sequence（B） of pvu-miR395 family members

表2 pvu-miR395 家族成員的基本信息Tab.2 Basic information of pvu-miR395 family members

2.2 pvu-miR395 家族成員前體序列的二級結構分析

microRNA 的前體序列決定成熟microRNA 的表達和序列。為了進一步了解pvu-miR395家族成員的作用模式，從PmiREN數據庫獲取8個pvu-miR395家族成員的前體序列，最長的pre-pvu-miR395f為104 bp，最短的pre-pvu-miR395e為68 bp。二級結構預測結果表明，所有pre-pvu-miR395均能形成穩定的二級莖環結構，并且所有pvu-miR395家族成員的成熟microRNA 均位于前體序列的5′臂上（圖2）。

圖2 pvu-miR395 家族成員前體序列的二級結構預測Fig.2 Secondary structure prediction for precursor of pvu-miR395 gene family members

2.3 pvu-miR395 家族成員的系統進化樹分析

蕓豆與其他植物miR395家族成員系統進化樹如圖3 所示。

圖3 蕓豆與其他植物miR395 家族成員系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of miR395 family members of Phaseolus vulgaris and other plants

為了解pvu-miR395家族成員的功能特征和進化關系，將蕓豆的8 個miR395家族成員的前體序列與大豆、苜蓿、擬南芥和水稻中的miR395家族成員的前體序列構建系統進化樹，經鑒定發現，在擬南芥、苜蓿、水稻、大豆中分別存在6、12、20、23 個miR395家族成員，進化樹結果顯示（圖3），miR395家族成員共分為四大組，其中，第Ⅰ組和第Ⅳ組成員較多（23～27 個），第Ⅱ、Ⅲ組成員較少（7～12 個）。在同一亞家族內，種內的miR395序列比種間更容易聚類在一起。其中pvu-miR395家族成員分布于4 個組中，每個組中均包含2 個pvu-miR395家族成員。

總的來說，大豆、苜蓿和蕓豆的miR395前體序列比擬南芥、水稻更容易聚類在一起，表明蕓豆miR395家族成員與豆科類作物大豆和苜蓿的親緣關系較近，其次與雙子葉植物擬南芥較近，而與單子葉植物水稻的親緣關系較遠。有意思的是，Group Ⅰ的23 個家族成員96%來源于蒺藜苜蓿、大豆和蕓豆，Group Ⅲ的7 個家族成員全部來自于這3 個物種，Group Ⅰ和Group Ⅲ中包含3 個由大豆和蕓豆序列聚類而成的亞亞支，1 個由蒺藜苜蓿和蕓豆序列聚類而成的亞亞支，推測這可能是豆科植物進化出了特異的分支，參與調控豆科植物結瘤固氮的調控。

2.4 pvu-miR395 家族成員啟動子分析

位于啟動子上的順式作用元件是決定基因表達的關鍵，為分析pvu-miR395的表達模式，首先對pvu-miR395啟動子區域的順式作用元件進行分析，結果如圖4 所示，8 個pvu-miR395均含有豐富的順式作用元件，大多數pvu-miR395啟動子包含與植物激素、脅迫、生長和發育有關的順式作用元件。生長發育元件主要包括光響應順式作用元件G-box、Box4 和分生組織表達相關的順式作用元件CATbox；與植物激素相關的響應元件主要包括參與脫落酸響應的順式作用元件ABRE、乙烯響應元件ERE、水楊酸響應元件TCA 和赤霉素響應元件Pbox；與脅迫相關的響應元件主要包括與厭氧相關的響應元件ARE、與干旱相關的響應元件MYB 和MYC、應激響應相關的順式元件W-box 和as-1。順式作用元件在不同pvu-miR395啟動子中不均勻分布，而在pvu-miR395家族成員的啟動子區域包含較多的MYB、MYC 元件，說明pvu-miR395可能與蕓豆耐逆相關。除此之外，pvu-miR395家族成員的啟動子區域還包含較多的與厭氧相關的響應元件ARE 和激素響應元件，植物激素和厭氧環境對豆科植物的結瘤和固氮非常重要，暗示了pvumiR395在蕓豆結瘤固氮中的關鍵作用。

圖4 pvu-miR395 家族成員順式作用元件分析Fig.4 cis-acting elements analysis of pvu-miR395 family members

2.5 pvu-miR395 家族成員的表達模式分析

為進一步驗證pvu-miR395是否參與蕓豆結瘤調控，采用qRT-PCR 分析pvu-miR395家族成員在紅蕓豆的根、葉及根瘤中的表達模式，結果如圖5所示，所有pvu-miR395家族成員在紅蕓豆根瘤中的表達極顯著高于根和葉中的表達量（P＜0.001，圖5-A、B、C、D）。進一步驗證紅蕓豆pvu-miR395家族成員是否響應根瘤菌處理，對根瘤菌處理0、1、3、6、12、24 h 的紅蕓豆的根進行qRT-PCR，結果表明，紅蕓豆根中pvu-miR395的表達量隨根瘤菌處理時間呈現先升高后降低的趨勢，且在處理6 h 時的表達量最高。但值得注意的是，在根瘤菌處理6 h時，pvu-miR395a/b/c的表達仍顯著低于對照（根瘤菌未浸染）的表達量（P＜0.05，圖5-E），而其余5 個pvu-miR395成員均極顯著高于對照（P＜0.01或P＜0.001，圖5-F、G、H），說明pvu-miR395在6 h時被根瘤菌強烈誘導，推測該miRNA 在此時發揮著重要作用。這些結果表明，所有pvu-miR395的家族成員都在結瘤早期響應根瘤菌的侵染，參與調控蕓豆結瘤。

圖5 pvu-miR395 家族基因在不同組織和響應根瘤菌侵染的相對表達量Fig.5 Relative expression of pvu-miR395 family members in different tissues and in response to rhizobia infection

2.6 pvu-miR395 家族成員的靶基因預測及功能注釋

MicroRNA 通常通過調控下游靶基因的表達發揮作用，為了進一步驗證pvu-miR395家族在結瘤固氮中的功能，通過psRNATarget 在線預測結果，共獲得3 個pvu-miR395可能的靶基因（表3），2 個硫酸鹽轉運蛋白和1 個硫酸腺苷?；D移酶。

表3 pvu-miR395 家族成員的靶基因預測及功能注釋Tab.3 Target gene prediction and functional annotion of pvu-miR395 family members

3 結論與討論

紅蕓豆是山西的特產，其具有豐富的營養價值和較高的藥用價值。作為一種豆科植物，其生長發育離不開共生結瘤與固氮，當豆科植物被根瘤菌侵染時，植物會產生類黃酮類物質，誘導根瘤菌形成結瘤因子，進而促使根毛彎曲和侵染線形成，以此誘導根瘤發育和共生固氮[20]。近年研究表明，除了大量的功能基因參與調控豆科植物的結瘤固氮，一系列的非編碼基因比如microRNA 也參與調控豆科植物的結瘤固氮過程[21-26]，本研究首次系統鑒定了pvu-miR395家族成員，并初步探究了pvu-miR395在紅蕓豆結瘤固氮中的作用，發現pvu-miR395家族成員在紅蕓豆根瘤中高表達，并受根瘤菌侵染的誘導，同時也預測到其有3 個罰分為2 以下的靶基因，分別是硫酸鹽轉運蛋白和硫酸腺苷?；D移酶，pvu-miR395家族成員可能通過調節這些靶基因表達水平來影響蕓豆的生長發育，這與已報道的擬南芥和水稻中miR395的靶基因預測結果一致[12-13]。前人研究發現，硫與碳一樣對共生固氮的調節和功能至關重要，固氮酶的生物合成依賴于高濃度硫酸鹽吸收。硫是植物中必需的營養元素，可以提高作物產量、改善作物品質。在豆科植物中，硫供應可以增強豆科植物的固氮能力，與共生固氮呈正相關[15,27]。進一步佐證pvu-miR395通過靶向硫酸鹽轉運蛋白和硫酸腺苷?；D移酶在結瘤固氮過程中起到關鍵作用。

本研究通過生物信息學從蕓豆基因組中鑒定出8 個miR395的家族成員，這些miR395分布在第2、3 號染色體上，依次命名為pvu-miR395a～pvumiR395h。pvu-miR395成熟序列和星標序列堿基高度保守，8 個miR395成員均可形成較穩定的二級莖環結構。順式作用元件分析發現，該家族成員可能參與植物激素、脅迫、生長和發育等過程。系統進化樹分析發現，pvu-miR395的家族成員與大豆和苜蓿的親緣關系更近。qRT-PCR 分析發現，pvu-miR395家族成員在蕓豆的根瘤中高表達，且pvu-miR395家族成員的表達顯著抑制根瘤菌的侵染。靶基因預測表明，pvu-miR395家族成員可能靶向硫酸鹽轉運蛋白（Phvul.001G250700.1、Phvul.008G170700.1）和硫酸腺苷?；D移酶（Phvul.007G062900.1）參與調控蕓豆的共生結瘤。通過基因工程手段改造pvu-miR395和靶基因的表達，將有助于提升紅蕓豆的固氮效率，在提升紅蕓豆的產量的同時減少氮肥的使用，提高農業的可持續發展。