藜麥內生細菌LS3 發酵條件優化及其抑菌機制初探

秦 楠 ，任 璐 ，2，呂 紅 ，殷 輝 ，趙曉軍 ，2

（1.山西農業大學 植物保護學院，山西 太原 030031；2.農業農村部有機旱作農業重點實驗室（省部共建），山西 太原 030031）

藜麥（Chenopodium quinoa）因其具有極高的營養價值在我國種植面積不斷擴大，也伴隨著大量病蟲害的出現[1-2]。藜麥黑莖病是危害藜麥莖部的新病害，該病害的病原為Ascochyta caulina，為2017 年在山西忻州市靜樂縣首次發現，其病原為莖生殼二孢，典型癥狀是在莖上形成黑色壞死病斑，病斑可完全包裹莖，引起倒伏、籽?？瞻T和不育，最終造成藜麥損失巨大，甚至絕收[3]。

植物內生細菌是一類豐富的微生物資源，在作物保護方面發揮著重要的作用。其中，芽孢桿菌（Bacillusspp.）是對植物病害具有防治效果的有益微生物，其廣泛存在于自然界，具有繁殖速度快、能產生抗逆性極強的芽孢以及抗菌譜廣等優點。芽孢桿菌可在植物根際土壤、植物組織體內定殖，通過分泌抗菌物質、與病原菌競爭營養物質以及誘導宿主植物產生相關防御酶等方式達到防治植物病害的目的[4-6]。生防細菌的發酵過程受多種因素的影響，例如培養基配方對該菌的菌體量、生長速度以及對靶標菌的抑制效果等均有不同程度的影響，除此之外，相同屬、種生防細菌的最適發酵條件可能因為其生理特性、對環境的偏好性而不同，發酵條件的優化有利于提高生防細菌的生防能力，為生防制劑的高效應用提供理論支持[7-9]。

芽孢桿菌是生防制劑的重要資源之一，在生物防治中得到廣泛研究和應用[10]，目前關于芽孢桿菌發酵條件的研究已有較多報道，黎燕珊等[11]研究發現，貝萊斯芽孢桿菌HC-8 發酵條件經過優化以后，其最適基礎培養基為酵母蛋白胨培養基（YSP），最佳發酵條件為溫度37 ℃，初始pH 值6.0，轉速180 r/min，接種量0.1%，裝液量20 mL/300 mL，發酵時間48 h，優化后的方案可顯著提高HC-8 菌株的發酵產量；宋本超等[12]研究發現，解淀粉芽孢桿菌Z17-2 經一系列發酵條件優化后較優化前發酵液菌體量提升了120%，抑菌活性提高43.8%；劉仕飛等[13]研究發現，禾谷絲核菌生防細菌XZ18-3 采用單因素試驗以及響應面法優化以后，抑菌率為57.3%，比原發酵液提高了56.6%。

本研究以分離得到生防細菌LS3 發酵液的OD600值和對A.caulina的抑菌率為指標，采用單因素及正交試驗方法對LS3 菌株發酵液培養基進行篩選和發酵條件進行優化，以期為LS3 菌株后續作為生防菌制劑化商品的研究和應用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 藜麥黑莖病病原菌（Ascochytacaulina），從山西省靜樂縣娑婆鄉發病的藜麥植株上分離、純化獲得；拮抗細菌LS3，由山西農業大學植物保護學院果蔬病害課題組分離、純化并保存。

1.1.2 供試培養基 LS3 菌株的培養采用NA 培養基（牛肉膏5.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 5.00 g、瓊脂粉20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值調至7.4～7.6）和NB 培養基（牛肉膏5.00 g、蛋白胨10.00 g、葡萄糖20.00 g、氯化鈉5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

發酵條件優化采用的基礎培養基有BPY 培養基（蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、牛肉浸膏5.00 g、葡萄糖5.00 g、NaCl 5.00 g、蒸餾水1 000 mL），CM培養基（蛋白胨10.00 g、牛肉浸膏5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），LB 培養基（蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、NaCl 10.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），NYBD 培養基（酵母浸膏5.00 g、牛肉浸膏8.00 g、葡萄糖10.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），YSP 培養基（蛋白胨10.00 g、蔗糖20.00 g、酵母浸膏5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。以上培養基pH 值均調至7.0。

LS3 菌株抑菌活性物質檢測采用的鑒定培養基有酪蛋白培養基（瓊脂粉1.50 g、脫脂奶粉5.00 g分別溶于100 mL 蒸餾水中，兩液分開滅菌，待冷卻至45～55 ℃時將二者充分混勻），幾丁質培養基（甲殼素15.00 g、酵母粉5.00 g、（NH4）2SO41.00 g、MgSO4·5H2O 0.30 g、KH2PO41.36 g、瓊脂15.00 g，蒸餾水定容至l 000 mL），茯苓粉培養基（K2HPO417.98 g、KH2PO46.80 g、茯苓粉4.00 g、酵母膏5.00 g、苯胺藍100 mg、瓊脂 20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL），羧甲基纖維素（CMC）培養基（CMCNa 5.00 g、K2HPO40.25 g、（NH4）2SO40.50 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、瓊脂20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL）。

所有培養基均在121 ℃濕熱滅菌后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 LS3 種子液及發酵濾液的制備

1.2.1.1 LS3 種子液的制備 將4 ℃條件保存的LS3 菌株劃線接種于NA 平板上，置于26 ℃培養箱活化24 h 后，挑取一環單菌落接種于NB 培養基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養24 h，得到LS3 種子液。

1.2.1.2 LS3 發酵濾液的制備 將LS3 的種子液按照1%（V/V）的接種量接入NB 培養基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養，在培養結束后，再于12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，將離心上清液置于20 mL 規格的注射器中，在注射器出口處安裝0.22 μm 微孔濾膜，擠壓注射器，使液體從微孔濾膜中緩緩流出，得到生防細菌的發酵濾液，即生防細菌代謝物，于4 ℃保存備用。

1.2.2 LS3 菌株發酵最佳培養基篩選 分別配制BPY、YSP、LB、NB、CM、NYBD 等6 種常用培養基，高壓滅菌處理，冷卻后將已搖好的LS3 種子液按1% 的接種量接入到上述6 種培養基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養72 h，以空白培養基作為對照，測定培養第24、48、72 小時的OD600值以及發酵終止后發酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳基礎培養基。

1.2.3 LS3 菌株最佳碳源篩選 選取1.2.2 效果最佳的培養基作為基礎培養基進行試驗，分別用等量的可溶性淀粉、乳糖、甘露醇、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖取代基礎培養基中的碳源，保持其余成分不變配制對應的培養基，高壓滅菌處理以后，將已發酵完成的LS3 發酵液按1%的接種量接入到上述7 種培養基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養72 h。以不添加LS3 發酵液的培養基作為對照。測定培養第24、48、72 小時的OD600值以及發酵終止后發酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳碳源。

1.2.4 LS3 菌株最佳氮源篩選 將篩選出的培養基作為最佳培養基，將篩選出的碳源最為最佳碳源進行試驗。分別用等量的蛋白胨、尿素、胰蛋白胨+牛肉膏、蛋白胨+牛肉膏、牛肉膏加酵母粉、蛋白胨+酵母粉、胰蛋白胨+酵母粉、牛肉膏+酵母粉+蛋白胨取代已篩出基礎培養基中的氮源，保持其余成分不變配制對應的培養基，高壓滅菌處理以后，將已發酵完成的LS3 發酵液按1%的接種量接入到上述8 種培養基中，于26 ℃、160 r/min 振蕩培養72 h。以不添加LS3 發酵液的培養基作為對照。測定培養第24、48、72 小時的OD600值以及發酵終止后發酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳氮源。

1.2.5 LS3 菌株最佳發酵溫度篩選 將篩選出的培養基作為最佳培養基，將篩選出的碳源作為最佳碳源，將篩選出的氮源作為最佳氮源進行試驗。配制好培養基經過高壓滅菌處理以后，將已發酵完成的LS3 發酵液按1%的接種量接入到上述培養基中，分別于35、30、28、26 ℃，轉速保持160 r/min 不變振蕩培養72 h。以不添加LS3 發酵液的培養基作為對照。測定培養第24、48、72 小時的OD600值以及發酵終止后發酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳發酵溫度。

1.2.6 LS3 菌株發酵條件優化 將1.2.2 中篩選出的培養基作為最佳培養基，將1.2.3 中篩選出的碳源作為最佳碳源，將1.2.4 中篩選出的氮源作為最佳氮源，將1.2.5 中篩選出的溫度作為最佳溫度進行試驗。使用正交試驗L16（45）LS3 的發酵液轉速、裝液量、pH、發酵時間、接種量進行優化（表1）。每個不同處理重復2 次，測定培養第24、48、72 小時的OD600值以及發酵終止后發酵濾液對A.caulina的抑菌率，從而確定最佳發酵條件。

表 1 發酵條件正交試驗設計Tab.1 Orthogonal experiment design of fermentation conditions

1.2.7 LS3 菌株抑菌相關酶活性測定

1.2.7.1 胞外蛋白酶活力 取5 g 脫脂奶粉制備蛋白培養基，將LS3 菌株點接于培養基中央，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養48 h，觀察菌落周圍有無透明圈產生[14]。

1.2.7.2 幾丁質酶活力 稱取2 g幾丁質，加入10 mL丙酮研磨，研磨過程中緩慢加入適量丙酮，使用玻璃棒充分攪拌，直至其成糊狀為止。在4 ℃條件下邊攪拌邊加入濃鹽酸30 mL，繼續用磁力攪拌器攪拌2 h，在4 ℃的冰箱靜置24 h。將混合物加入到預冷的95%乙醇中，于4 ℃、5 000 r/min 進行離心，除去上清液，再加入預冷的無菌水離心，除去上清液，反復多次，直至上清液為中性為止。收集膠體幾丁質沉淀，即制成膠體幾丁質。將多余的膠體幾丁質調整濃度為1%，避光保存于冰箱。只用膠體幾丁質制成幾丁質培養基，將LS3 菌株點接于幾丁質培養基上，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養48 h，觀察菌落周圍有無透明圈產生[14]。

1.2.7.3 β-l，3-葡聚糖酶活力 取5 g 茯苓粉配制茯苓培養基，將LS3 菌株點接于培養基中央，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養48 h，觀察菌落周圍有無透明圈產生[14]。

1.2.7.4 纖維素酶（β-1，4-葡聚糖酶）活性 配制羧甲基纖維素培養基，將LS3 菌株點接于培養基中央，25 ℃恒溫（光暗各12 h 交替）培養48 h，使用1 mg/mL 的剛果紅染色30 min，然后用1 mol/L 的NaCl 浸泡20 min，使用無菌水沖洗掉表面附著的剛果紅，觀察菌落周圍是否產生透明圈[14]。

1.3 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 25.0 進行數據統計分析；采用Duncan 氏新復極差法對試驗數據進行分析，以P＜0.05 作為具有顯著性差異的標準。

2 結果與分析

2.1 LS3 菌株發酵最佳培養基篩選

由圖1 可知，LS3 在不同培養基生長過程中表現出差異，在YSP 培養基中OD600值最大，在NB培養基中OD600值最??；在發酵72 h 后不同培養基中菌體生長量大小依次為YSP＞BPY＞NYBD＞LB＞CM＞NB。

圖1 不同基礎培養基對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

LS3 在不同培養基中發酵結束后對A.caulina的抑制效果也表現出差異，發酵濾液對A.caulina抑菌率最高的是YSP 培養基，抑菌率最低的是NB培養基；各培養基中發酵濾液對A.caulina的抑菌率大小依次為YSP（77.3%）＞NYBD（71.6%）＞BPY（70.7%）＞CM（69.6）＞LB（67.2%）＞NB（55.9%）。綜合分析，LS3 在YSP 培養基中代謝產物累積量最多，對A.caulina的抑菌率也最高。因此，將YSP 培養基作為LS3 的最佳發酵培養基。

2.2 LS3 菌株最佳碳源篩選

圖2 為LS3 菌株在不同碳源培養基中發酵24、48、72 h 時的OD600以及發酵結束后對LS3 發酵濾液對A.caulina的抑制效果，其中，LS3 在不同碳源培養基生長過程中表現出差異，在以葡萄糖為碳源的培養基中OD600值最大，在以可溶性淀粉為碳源的培養基中OD600值最??；在發酵72 h 后不同碳源培養基中菌體生長量大小依次為葡萄糖＞蔗糖＞甘露糖＞麥芽糖＞甘露醇＞乳糖＞可溶性淀粉。

圖2 不同碳源培養基對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different carbon source culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

LS3 在不同碳源培養基中發酵結束后對A.caulina的抑制效果也表現出差異，發酵濾液對A.caulina抑菌率最高的是以蔗糖為碳源的培養基，抑菌率最低的是以可溶性淀粉為碳源的培養基，不同碳源培養基中發酵濾液對A.caulina抑菌率大小依次為蔗糖＞葡萄糖（72.0%）＞麥芽糖（71.1%）＞甘露醇（70.2%）＞甘露糖（69.4%）＞乳糖（47.9%）＞可溶性淀粉（5.5%）。綜合分析，LS3 在以蔗糖為碳源的培養基中代謝產物累積量較多，對A.caulina的抑菌率也最高。因此，將蔗糖作為LS3 的最佳碳源。

2.3 LS3 菌株最佳氮源篩選

圖3 為LS3 菌株在不同氮源培養基中生長第24、48、72 h 下的菌體數量以及在72 h 下LS3 代謝產物對A.caulina的抑制率，細菌隨著時間的生長在不同氮源培養基中出現明顯差異，其中，在以牛肉膏+酵母粉為氮源的培養基細菌數量最多，在以尿素為氮源的培養基中細菌數量最少；不同氮源培養基中LS3 菌體數量大小依次為牛肉膏+酵母粉＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨＞牛肉膏+蛋白胨＞蛋白胨+酵母粉＞蛋白胨＞胰蛋白胨+酵母粉＞牛肉膏+胰蛋白胨＞尿素。

圖3 氮源培養基對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source culture medium on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

在不同氮源培養基中發酵72 h 以后，代謝產物對A.caulina的抑制率也出現明顯差異，在以牛肉膏+酵母粉為氮源的培養基中的代謝產物對A.caulina的抑菌率最高，在以尿素為氮源的培養基中的代謝產物抑菌率最低；不同氮源培養基中代謝產物對A.caulina的抑制率大小依次為牛肉膏+酵母粉（73.33%）＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨（73.1%）＞牛肉膏+蛋白胨（72.0%）＞蛋白胨+酵母粉（71.6%）＞胰蛋白胨+酵母粉（70.8%）＞牛肉膏+胰蛋白胨（68.7%）＞蛋白胨（66.8%）＞尿素（0.5%）。因此，選擇牛肉膏+酵母粉作為發酵LS3最佳氮源。

2.4 LS3 菌株最佳發酵溫度篩選

圖4 為LS3 菌株在不同生長溫度下第24、48、72 小時的細菌數量以及在第72 小時下LS3 代謝產物對A.caulina的抑菌率，LS3 在不同發酵溫度下生長量表現出差異，同時間相比較，在28 ℃下進行發酵時，菌體數量最多；不同溫度下培養LS3 72 h后培養基中菌體數量大小依次為28 ℃＞30 ℃＞26 ℃＞35 ℃。

圖4 不同發酵溫度對菌株LS3 菌體生長量及代謝物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of different fermentation temperature on bacteria growth and antifungal activity of metabolite of strain LS3

在不同溫度下LS3 發酵72 h 后代謝產物對A.caulina的抑制率也表現出差異，28 ℃下發酵代謝產物抑菌率最大，35 ℃下發酵代謝產物抑菌率最??；不同溫度下LS3 培養72 h 以后培養基中代謝產物對A.caulina的抑制率大小依次為28 ℃（74.0%）＞30 ℃（71.5%）＞26 ℃（70.8%）＞35 ℃（68.8%）。因此，LS3 最佳發酵溫度選擇28 ℃。

2.5 LS3 菌株發酵條件優化

以轉速、裝液量、接種量、pH、發酵時間等5 個因素對發酵條件進行優化，分別測定LS3 菌株在各個不同因素下生長72 h 后的細菌數量，結果如表2所示，第7 組水平組合為A2B3C1D3E4，LS3 發酵終止后菌體數量最多，OD600為2.281。通過分析極差可知，5 個試驗因素對LS3 發酵菌體數量影響大小分別為pH（1.873）＞接種量（1.400）＞裝液量（0.566）＞發酵時間（0.472）＞轉速（0.409），優化水平組合為A2B3C1D3E4，即轉速130 r/min，裝液量150 mL/300 mL，接種量1%，pH 值7.0，發酵時間96 h。

表2 LS3 菌株發酵條件優化正交試驗對菌體數量的分析Tab.2 Analysis of bacterial quantity by orthogonal test of optimization of fermentation conditions of LS3 strain

以轉速、裝液量、接種量、pH、發酵時間等5 個因素對發酵條件進行優化，分別測定LS3 菌株在各個不同因素下生長72 h后細菌代謝產物對A.caulina的抑制率（表3）。從表3 可以看出，第7 組水平組合A2B3C1D3E4 在LS3 發酵終止以后代謝產物對A.caulina的抑制率最大，為73.55%。通過分析方差可知，5 個試驗因素對LS3 發酵代謝產物影響大小分別為pH（50.73）＞接種量（16.71）＞轉速（12.67）＞裝液量（8.08）＞發酵時間（3.91），優化水平組合為A2B3C1D3E4，即轉速130 r/min，裝液量150 mL/300 mL，接種量1%，pH 值7.0，發酵時間96 h。

表3 LS3 菌株發酵條件優化正交試驗對抑菌率的分析Tab.3 Analysis of inhibition rate by orthogonal test of optimization of fermentation conditions of LS3 strain

結合分析不同水平條件發酵LS3 對菌體數量和抑菌率的影響，可知pH 對發酵過程影響最大。發酵最佳轉速130 r/min，最佳裝液量150 mL/300 mL，最佳接種量1%，最佳pH 值7.0，最佳發酵時間為96 h。

2.6 LS3 菌株抑菌相關酶活性測定

LS3 酶活性測定結果如圖5 所示。

圖5 LS3 酶活性測定Fig.5 Detection of LS3 enzyme activity

從圖5-A 可以看出，LS3 于酪蛋白培養基培養48 h，在該培養基表面出現明顯的透明圈，說明LS3可以分泌胞外蛋白酶。如圖5-B 所示，LS3 于幾丁質培養基生長48 h，在該培養基表面沒有產生較明顯的透明圈，說明LS3 無法分泌幾丁質酶。如圖5-C 所示，LS3 于茯苓粉培養基生長48 h，在該培養基表面沒有出現較明顯的透明圈，說明LS3 無法分泌β-l，3-葡聚糖酶。如圖5-D 所示，LS3 于羧甲基纖維素培養基生長48 h，使用剛果紅染色結束，洗去培養基表面的剛果紅后出現明顯的透明圈，說明LS3 可以分泌β-1，4-葡聚糖酶。

3 結論與討論

本研究結果表明，LS3 發酵所需最佳培養基為YSP 培養基，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏+酵母粉，發酵最佳溫度為28 ℃。正交優化后，LS3 最佳發酵最佳條件為：轉速130 r/min、裝液量150 mL/300 mL、接種量1%、pH 值7.0、發酵時間96 h。

當前在室內條件下培養芽孢桿菌主要使用LB培養基[13]，但LB 培養基中生長的細菌種類相對單一。黎燕珊等[11]研究發現，貝萊斯芽孢桿菌HC-8的最佳發酵培養基為YSP；吳至美等[7]研究發現，成團泛菌ZLSY20 菌株的最佳培養基為YSP，與本研究結果相似。

在細菌發酵的過程中，碳源、氮源、溫度、發酵時間、pH 等都是比較重要的條件，不同的細菌對以上不同的因子會出現不同的選擇差異性[15-17]。本研究發現，LS3 菌株最佳碳源為蔗糖，但其對麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇等利用效果良好，說明LS3菌株對于碳源的選擇范圍較廣。在氮源篩選方面，LS3 菌株的最佳氮源為牛肉膏+酵母粉，對于蛋白胨、胰蛋白胨等其他氮源也可以利用，但是其在發酵過程中幾乎無法利用尿素。魏欣瑩等[18]研究發現，芽孢桿菌ZKY01 在生長過程中利用尿素呈陽性；石玉星[19]研究發現，甲基營養型芽胞桿菌MY1在發酵過程中，幾乎無法利用尿素，與本試驗研究結果相似，因此，利用LS3 菌株在田間防治藜麥黑莖病時，應當控制或減少尿素的施用量。LS3 菌株在25～35 ℃范圍內均能生長，表明該菌株對溫度的適應性較強。

本研究結果發現，通過正交試驗對5 個因素進行正交發酵優化，發現LS3 菌株發酵過程中最適pH 值為7.0。劉冰等[20]研究發現，內生細菌GN232在pH 值為7.0 時獲得的發酵液對擠橙潰瘍病菌的抑制效果最強，與本研究結果相似。

對LS3 菌株的抑菌活性物質進行測定發現，LS3 菌株可分泌β-1，4-葡聚糖酶及胞外蛋白酶，但不可以分泌幾丁質酶和β-l，3-葡聚糖酶。蛋白酶、幾丁質酶和β-1，4-葡聚糖酶等胞外酶可抑制病原菌的生長，是內生細菌發揮拮抗作用的重要保障，LS3 菌株可通過胞外蛋白酶及β-1，4-葡聚糖酶分解真菌菌絲結構，進而抑制菌絲生長。今后還可對LS3 菌株抑菌機制進行深入研究，進一步探索其抗菌物質成分。

近年來，芽孢桿菌作為安全、高效的生防菌株倍受人們關注，許多芽孢桿菌具有較廣譜的抑菌活性。陳照等[21]從檳榔樹根際土壤分離得到1 株貝萊斯芽胞桿菌HAB-9，研究發現，其對17 種常見的病原真菌有較強的抑制作用。高小寧等[22]研究發現，內生枯草芽孢桿菌Em7 具有廣譜的抑菌活性，可以抑制10 多種常見的病原真菌，今后可以繼續挖掘LS3 菌株對其他病原菌的抑菌活性。