利用藥物重定位策略挖掘胃癌治療藥物

齊 鑫，荀德旭，馮舒琪，高 娜，侯思宇，盧雨青，黃 蘭，陳佳佳

(蘇州科技大學化學與生命科學學院 江蘇 蘇州 215011)

胃癌是起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，流行病學調查顯示，在全球范圍內其發病率位列第5，死亡率位列第4，對患者的身體健康和生命安全帶來嚴重的威脅[1]。胃癌患者常出現胃灼熱、反酸和其他常見慢性腸胃道疾病相似癥狀，在早期難以察覺。盡管近年來胃癌的研究和治療手段取得了重要的進展，但是胃癌的致病機制尚未十分明確，晚期患者的5 年總體生存率低，對胃癌患者進行有效的治療仍面臨著嚴峻的挑戰[2]。因此，研發新的藥物有助于優化胃癌的治療方案。

近年來，隨著高通量測序技術的快速發展以及生物數據和醫學數據的飛躍式增長，藥物重定位已逐漸成為一種發現現有藥物新適應癥的高效策略，可以加快新藥研發的進程。其中基于計算的藥物重定位方法通過系統識別潛在的藥物-靶點和藥物-疾病之間的相互作用，可大大降低傳統藥物研發的成本、周期和風險[3]。關聯圖譜(connectivity map,CMap)數據庫存儲了不同濃度和時間點對癌癥細胞系進行小分子藥物處理后獲得的基因表達譜數據，為探索由小分子化合物引發的基因表達變化特征，揭示小分子化合物、基因以及疾病狀態之間的聯系提供了重要的研究平臺[4]。目前，基于CMap 的計算藥物重定位方法已被生物學家及醫藥工作者廣泛應用于癌癥治療藥物的篩選和研發。

本研究利用基于CMap 的藥物重定位策略篩選治療胃癌的小分子化合物并預測其靶點。首先，利用GEO 數據庫中胃癌腫瘤組織和正常對照組織的基因表達譜數據，確定與胃癌發生密切相關的差異表達基因，并基于CMap 數據庫篩選治療胃癌的候選藥物。然后，利用蛋白質-蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network, PPIN)鑒定關鍵的樞紐基因，并利用分子對接預測候選藥物與樞紐基因的結合能力來預測藥物的靶點；進一步，利用生物信息學方法對潛在靶點的表達模式、診斷和預后性能進行分析。

1 材料與方法

1.1 數據集的獲取

在NCBI 的GEO 數據庫中，下載與胃癌相關的3 組基因表達譜數據集GSE54129、GSE65801和GSE26899。其中，GSE54129 數據集的平臺為GPL570，包含111 例胃癌組織樣本和21 例正常對照組織樣本；GSE65801 數據集的平臺為GPL14550，包含32 例胃癌組織樣本和32 例配對的正常對照組織樣本；GSE26899 數據集的平臺為GPL6947，包含96 例胃癌組織樣本和12 例正常對照組織樣本。

1.2 差異表達基因的鑒定

使用“Limma”R 包鑒定在胃癌組織和正常對照組織樣本之間顯著差異表達的基因[5]，鑒定標準為|log2(fold change)|≥1 且校正后的P＜0.05。進一步，通過對差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)繪制韋恩圖，篩選在上述3 個數據集中均上調表達或下調表達的基因。

1.3 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

利 用“clusterProfiler”R 包[6]，對 在3 個 數 據集中重疊的差異表達基因分別進行基因本體論(gene ontology, GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，探究差異表達基因顯著富集的條目(校正后的P值小于0.05)。

1.4 利用CMap 數據庫預測治療胃癌的候選小分子藥物

將在GSE54129、GSE65801 和GSE26899 這3個數據集中均顯著上調的基因和均顯著下調基因上傳到CMap 數據庫中的“Query”模塊進行分析[7]。結果文件中，連通度分數(connectivity score)表示胃癌相關基因的表達特征與CMap 中收錄的小分子化合物之間的相關性。連通度分數越接近-100，表示藥物的治療潛力越大。本研究選擇連通度分數小于-80 作為篩選治療胃癌候選小分子化合物的閾值。

1.5 蛋白質相互作用分析

利用STRING 數據庫對3 個數據集中重疊差異表達基因之間的相互作用關系進行分析，置信分數(confidence score)代表蛋白質相互作用的強弱[8]。本研究以置信分數大于0.400 為閾值篩選可靠的蛋白質相互作用關系，并構建PPIN。進一步，使用Cytoscape 軟件(3.6.1 版本)[9]進行PPIN 的可視化和拓撲性質分析，鑒定連接度(degree)值排名前10%的結點為網絡中的樞紐結點。

1.6 候選藥物分子和潛在靶點的分子對接

為了探究候選藥物的作用靶點，利用AutoDock 軟件(4.2.6 版本)[10]對PPIN 中樞紐基因編碼的蛋白質與候選藥物進行分子對接。具體地，在PDB 數據庫(https://www.rcsb.org/)[11]中分別檢索和下載PPIN 中樞紐基因編碼蛋白質的三維結構文件，同時在PubChem 數據庫[12]中搜索和下載候選藥物的三維結構文件。進一步，在對蛋白質和藥物配體結構進行預處理之后，利用AutoDock 軟件對候選藥物和蛋白質進行分子對接，每一個蛋白質與相應藥物要進行50 次對接，選出結合能最低的對接結果。當結合能小于-5.0 kcal/mol 時，表明配體和受體具有較好的結合活性。使用Pymol 軟件對親和力最佳的對接結果進行可視化和分析[13]。

1.7 生存分析

為了探究潛在藥物靶點的預后價值，對其與胃癌患者生存時間的相關性進行分析。具體地，使用在線工具Kaplan-Meier plotter[14]，分析靶點基因高表達組和低表達組之間生存時間(包括總體生存期和無進展生存期)是否存在顯著的差異。統計學上，使用對數秩檢驗(P＜0.05)來評估兩組間生存時間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 鑒定與胃癌發生密切相關的差異表達基因

使用“Limma”R 軟件包分別對3 個數據集GSE54129、GSE26899 和GSE65801 中腫瘤組織和正常對照組織樣本間差異表達的基因進行鑒定。結果顯示，以|log2(fold change)|≥1 和校正后的P＜0.05 為篩選標準，在GSE54129、GSE26899 和GSE65801數據集中分別鑒定了2 533、521 和2 403 個差異表達基因(圖1a～圖1c)。值得注意的是，76 個上調基因和127 個下調基因在3 個數據集中均顯著差異表達(圖1d～圖1e)，表明這些基因在胃癌致病過程中可能發揮著重要的作用。

圖1 差異表達基因的鑒定

2.2 差異表達基因的功能注釋

為了進一步研究上述3 個胃癌數據集中重疊差異表達基因的功能，使用“clusterProfiler”R 包分別進行了GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析。如圖2a 所示，重疊的差異表達基因在細胞外基質組織(extracellular matrix organization)、組織穩態(tissue homeostasis)和激素代謝過程(hormone metabolic process)等生物過程條目顯著富集，在含膠原蛋白的胞外基質(collagen-containing extracellular matrix)和內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)等細胞組分條目顯著富集，在細胞外基質結構成分(extracellular matrix structural constituent)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)等分子功能條目顯著富集。KEGG 結果也顯示重疊的差異表達基因在蛋白質的消化吸收(Protein digestion and absorption)、藥物代謝-細胞色素P450 通路(Drug metabolismcytochrome P450)和細胞外基質-受體相互作用(ECM-receptor interaction)等與胃癌的發生和發展密切相關的代謝通路顯著富集，如圖2b 所示。

圖2 差異表達基因的GO 功能富集分析和KEGG 代謝通路富集分析

2.3 候選小分子藥物的篩選

為了探索治療胃癌的候選小分子藥物，本研究采用CMap 在線分析工具對胃癌相關基因表達特征與小分子藥物之間的聯系進行了分析。具體地，通過將重疊的76 個上調基因和127 個下調基因上傳到CMap 數據庫，以連接分數＜-80 分為標準，鑒定了10 種治療胃癌的候選藥物，如表1 所示。

表1 利用CMap 數據庫鑒定的治療胃癌的候選小分子化合物

其中，PD-0325901、菲達替尼(fedratinib，TG-101348)、NVP-AUY922、西地尼布和布雷非德菌素A(brefeldin A)為已報道的具有胃癌治療價值的小分子藥物，表明本實驗的結果具有可靠性。另外，左炔諾孕酮、TWS-119、Tyrphostin-AG-1478、VU-0415374-1 和L-690488 為本研究新發現的治療胃癌的候選小分子化合物。

2.4 PPIN 的構建與樞紐基因的鑒定

蛋白質間的相互作用是細胞內蛋白質執行生命功能的重要方式，在包括癌癥發生發展等多種生命活動中發揮著至關重要的作用。本研究利用STRING 數據庫，對在上述3 個數據集中鑒定的203 個差異表達基因進行相互作用分析，構建了由152 個節點和480 條邊組成的PPIN，如圖3a 所示。鑒于PPIN 中樞紐基因具有成為藥物靶點的潛力，利用Cytoscape 軟件對構建的PPI 網絡進行可視化和拓撲性質分析，以度(degree)值排名前10%為篩選標準，鑒定了16 個樞紐基因，如圖3b所示。其中，TIMP1 為基質金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)家族重要的成員之一，在抑制基質金屬蛋白酶和細胞信號通路(如細胞死亡、增殖和血管生成)等方面具有重要作用[15]；PDGFRB 是血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)，在抑制血管生成和腫瘤細胞增殖過程中起關鍵作用[16]。而且，TIMP1 和PDGFR 均可作為胃癌預后生物標志物[16-17]，提示樞紐基因在胃癌發病過程中可能發揮著關鍵作用。

圖3 差異表達基因的PPIN 分析

2.5 胃癌候選小分子藥物潛在靶點的預測

為了預測胃癌候選小分子藥物的靶點，本研究利用Autodock 軟件對PPIN 中樞紐基因編碼蛋白質與基于CMap 數據庫鑒定的候選藥物進行了分子對接分析。結果顯示，左炔諾孕酮和西地尼布可分別與TIMP1 和PDGFRB 結合。具體地，西地尼布可與PDGFRB 蛋白的口袋結合，結合位點分別為第63 位和第112 位谷氨酸(GLU)，結合能為-6.28 kcal/mol，如圖4a 所示，這與文獻[18]報道的西地尼布能夠結合PDGFR 家族成員相符合；左炔諾孕酮與TIMP1 第100 位的絲氨酸(SER)、第102 位的纈氨酸(VAL)、第112 位的谷氨酰胺(GLN)和第162 位的精氨酸(ARG)作用，結合能為-9.24 kcal/mol，如圖4b 所示。因此，本研究新鑒定的胃癌候選藥物左炔諾孕酮可能通過結合TIMP1 的口袋，達到治療胃癌的效果。

圖4 鑒定的胃癌候選藥物與其潛在靶點的分子對接

2.6 胃癌候選藥物潛在靶點的功能研究

首先，為了驗證候選藥物潛在靶點基因在腫瘤組織和正常對照組織中的表達模式，通過箱線圖展示了TIMP1 和PDGFRB 在GSE54129、GSE26899和GSE65801 這3 個數據集中的表達模式，并利用GEPIA2 在線分析工具[19]對藥物潛在靶點TIMP1和PDGFRB 在TCGA 數據庫中的表達水平進行了分析。如圖5a～5b 所示，靶點基因TIMP1 和PDGFRB 在胃癌腫瘤組織中的表達水平均顯著上調(P＜0.05)。然后，通過ROC 曲線分析評估TIMP1 和PDGFRB 來區分胃癌患者和正常對照的敏感性和特異性，AUC 值越高則代表區分能力越強。如圖5c 所示，在GSE54129、GSE26899 和GSE65801 數據集中，TIMP1 的AUC 值在0.960～0.994 之間，基因PDGFRB 的AUC 值在0.786～0.974 之間，表明TIMP1 和PDGFRB 對胃癌具有較好的診斷效果。進一步，利用Kaplan-Meier Plotter 工具進行生存分析來研究TIMP1 和PDGFRB分別與胃癌患者總體生存時間的相關性。結果顯示，與TIMP1 低表達組相比，TIMP1 高表達組患者的總體生存率顯著降低(P＜0.05)；類似地，PDGFRB 高表達組患者的總體生存率也顯著低于PDGFRB 低表達組患者的總體生存率(P＜0.05)，如圖5d 所示，表明靶點基因TIMP1 和PDGFRB 的表達水平與胃癌患者的預后生存時間密切相關。

圖5 潛在靶點基因的表達模式和功能分析

3 結 束 語

胃癌是世界范圍內最常見的癌癥類型之一，大多數患者到醫院檢查就診時已發展到中晚期，手術治療效果不佳，現有藥物的治療效果有限，因此，迫切需要研發具有更好療效的靶向藥物，提高胃癌的臨床治療效果。

本研究基于胃癌的基因表達譜數據，采用CMap 的藥物重定位方法，鑒定了10 種治療胃癌的候選小分子化合物。其中，PD-0325901、菲達替尼、NVP-AUY922、西地尼布和布雷非德菌素A 為已報道的具有胃癌治療潛力的小分子化合物。如PD-0325901 作為MEK 抑制劑能夠抑制胃癌細胞的生長[20]；西地尼布為KIT 和VEGFR 抑制劑，具有抗血管生成的作用，文獻[21]對西地尼布聯合順鉑和氟嘧啶治療日本初治晚期胃癌患者進行了臨床I 期研究，發現20 毫克/天西地尼布聯合順鉑和氟嘧啶是可以耐受的，具有抗腫瘤的活性。此外，左炔諾孕酮、TWS-119、tyrphostin-AG-1478、VU-0415374-1 和L-690488 為本研究新發現的治療胃癌的候選小分子化合物，值得深入研究。

近年來，越來越多的研究表明，PPIN 是探究癌癥致病機制和預測候選藥物靶標的重要工具。通過鑒定PPIN 中的樞紐節點并將其分別與上述篩選得到的小分子藥物進行分子對接，發現小分子藥物西地尼布可與PDGFRB 結合，結合能為-6.28 kcal/mol，這與文獻[18]報道的西地尼布能夠結合PDGFR 家族成員的結果是一致的。另外，分子對接結果也顯示，左炔諾孕酮可與TIMP1 的口袋結合，結合能為-9.24 kcal/mol。但是左炔諾孕酮對胃癌的治療作用尚未報道，為本研究的新發現。

左炔諾孕酮是一種口服避孕藥，主要通過抑制排卵、改變子宮內膜和宮頸黏液，達到避孕的效果。近年來，越來越多的研究表明，左炔諾孕酮或左炔諾孕酮宮內節育系統(levonorgestrel intrauterine system，LNG-IUS)還具有抗癌作用，尤其對于子宮內膜癌治療有一定的療效，但是它們對癌癥的影響仍存在爭議。如左炔諾孕酮宮內節育系統可通過降低異位子宮內膜中腺體和間質雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα)、ERβ 和 孕 激 素 受 體(progesterone receptor, PR)的表達，改善輕度至中度子宮內膜異位癥女性的癥狀[22]。文獻[23]發現左炔諾孕酮宮內節育系統能夠影響宮腺肌癥患者子宮內膜中類固醇受體共調節因子的表達水平。文獻[24]的研究結果顯示，左炔諾孕酮能夠通過雄激素受體抑制人子宮內膜內皮細胞中組織纖溶酶原激活物的分泌。另外，文獻[25]的研究結果顯示，孕酮宮內節育系統與低于預期的子宮內膜癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌發病率相關，但與高于預期的乳腺癌發病率相關[25]。需要注意的是，左炔諾孕酮作為一種激素類的藥物，其對于男性患者和女性患者的治療效果可能存在較大的差異。另外，長期使用左炔諾孕酮可能會產生抗癌和促癌的效應。一方面，左炔諾孕酮可在一定程度上降低子宮內膜癌等癌癥的發生風險；另一方面，長期使用左炔諾孕酮可能會增加患乳腺癌的風險[26]。因此，在使用左炔諾孕酮時，需要注意其副作用和風險，并根據個體情況選擇合適的用藥方案。

綜上，本研究利用基于CMap 數據庫的藥物重定位方法鑒定了10 種治療胃癌的候選藥物，其中小分子化合物左炔諾孕酮可與PPIN 中的樞紐節點TIMP1 結合，且結合能低于已報道的藥物西地尼布與其靶點PDGFRB 的結合能，提示左炔諾孕酮可作為新型小分子藥物來治療胃癌，但具體的作用機制還需通過實驗進一步驗證。