基于抗原蛋白評價的豆粕菌酶協同發酵研究

荀冉,盧艷波,楊小雁,馬忠瑪,李國輝,趙運英*,鄧禹*

1(江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)3(山東省油脂油料精深加工技術重點實驗室 山東渤海實業集團有限公司,山東 濱州,256500)

隨著畜牧業的飛速發展,飼用大豆需求量不斷攀升。但豆粕中存在致敏蛋白和多種抗營養因子,會影響營養物質的消化和吸收,在一定程度上限制了其在飼料加工生產中的應用[1]。在已知的38種大豆過敏原蛋白中,由α(58～77 kDa)、α′(58～83 kDa)和β(42～53 kDa)3個亞基組成的β-伴大豆球蛋白是免疫原性最強的大豆蛋白[2],約占大豆種子全蛋白含量的30%,會引起幼齡動物(如豬和牛等)產生過敏反應[3]。

在豆粕飼料加工生產中,通過有效的加工來降低或消除大豆蛋白的抗原性至關重要。在這其中,β-伴大豆球蛋白中β亞基熱穩定性和酶耐受性最強,不易在加工過程中完全去除[4]。研究表明,現如今已開發了多種加工方法和技術,例如熱處理、酶水解、發酵和糖化等,但熱處理時過度加熱會降低賴氨酸和其他必需氨基酸的消化性,其他常規處理也難以有效除去抗原蛋白。微生物發酵可以去除抗營養因子和致敏蛋白,而不破壞豆粕的營養成分[5]。同時,酶水解也是改變大豆蛋白結構和構象,降低其致敏性,改善其生化功能的有效方法。酶水解可以破壞蛋白質肽鏈,產生分子質量較低的肽或氨基酸,改變過敏原的線性和空間表位,從而降低蛋白質的抗原性[6]?？莶菅堪麠U菌是一種常見的重要發酵劑,可產生各類酶,如堿性蛋白酶、淀粉酶等,利用枯草芽胞桿菌制備發酵豆粕,可將豆粕中的蛋白質水解成氨基酸和肽類等物質,顯著降低致敏蛋白和抗營養因子[7-8]。

如何準確、快速地檢測豆粕中抗原蛋白的含量目前仍然是個難題。這對于評價豆粕產品的功效和營養價值具有重要的意義,也是確定最佳豆粕發酵工藝的重要基礎。目前常見的蛋白檢測方法包括SDS-PAGE、酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、HPLC法等?，F有的β-伴大豆球蛋白的檢測技術的主要開發思路以抗原免疫反應為主,朱婷偉等[9]采用自制的兔抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗體建立了間接競爭ELISA檢測方法,YOU等[10]基于單克隆抗體6G4建立了競爭性ELISA檢測方法,檢出限為2.0 ng/mL。這些方法雖然在特異性、靈敏性方面各有優勢,但均對分析條件有比較高的要求,抗體血清的制備比較復雜,且實驗室差異無法保證重復性,很難實際應用于豆粕樣品的快速檢測[11]。近年來,靈敏度高、操作簡單等優點使適配體傳感器在分析方法中得到了廣泛的發展和應用[12]。因此,本實驗室篩選能夠與β-伴大豆球蛋白β亞基特異性結合的核酸適配體,選用納米金作為比色探針,構建了納米金適配體比色傳感器,實現了β亞基的快速檢測,為發酵豆粕過程評價抗原蛋白含量奠定基礎[13-15]。該傳感器在靈敏度和檢測效率方面具有優異的性能,β亞基的檢測范圍為7～58 nmol/L,檢測限為2.58 nmol/L。其與ELISA檢測β-伴大豆球蛋白的回收率相似,并且省去制備血清的繁瑣步驟。

本研究旨在使用納米金適配體生物傳感器評估豆粕發酵過程中的抗原蛋白含量,以β-伴大豆球蛋白的降解率為指標,通過單因素試驗優化枯草芽胞桿菌等多種菌株、發酵方式、發酵酶等關鍵發酵條件,最終獲得豆粕發酵的最佳工藝參數,并結合SDS-PAGE方法對比驗證傳感器檢測結果的正確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽胞桿菌CCTCC10071、枯草芽胞桿菌CCTCC20522、副干酪乳桿菌DY2(CCTCC2017303)、植物乳桿菌DY6(CCTCC2017138),中國典型培養物保藏中心;釀酒酵母BY4741、植物乳桿菌DY1、干酪乳桿菌DY13,實驗室保藏。

1.1.2 材料和設備

乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胰蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏、吐溫-80、檸檬酸三銨、葡萄糖、氯金酸、檸檬酸鈉、NaCl、HCl、冰醋酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Na2SO3、堿性蛋白酶,國藥集團化學試劑有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;豆粕,益海嘉里投資有限公司;適配體的序列為AACACGACCACGCTGTGACGGACACAGGTTGGCAG-CGTCGTG(5′-3′),安升達生物技術有限公司。

SynergyH1多功能檢測儀,美國BioTek有限公司;ST 16R高速冷凍離心機,美國賽默飛世爾科技公司;LF-Min-i4小型垂直電泳槽,美國Bio-Rad公司;1260氨基酸專用HPLC儀,美國Agilent公司。

1.1.3 培養基

枯草芽胞桿菌培養基(g/L):牛肉膏10.0,蛋白胨10.0,葡萄糖10.0,NaCl 5.0,pH 7.0,1×105Pa 滅菌30 min。

YPD培養基(g/L):酵母浸出粉10.0,蛋白胨20.0,葡萄糖20.0,1×105Pa滅菌30 min。

MRS培養基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏8.0,酵母浸出粉4.0,葡萄糖20.0,K2HPO42.0,檸檬酸三銨2.0,乙酸鈉5.0,MgSO4·7H2O 0.58,MnSO4·4H2O 0.25,吐溫-80 1 mL,pH 6.3～6.5,1×105Pa滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵菌株的選擇

將實驗室保藏菌種按照體積分數1%接種量接種到合適的培養基,在適宜培養溫度下活化24 h,按照同樣的方式活化2～3代,繼續于培養基中培養,得到發酵菌的菌液。

將豆粕與質量分數分別為50%的水、3%的糖及5%的所列發酵菌株對數期的菌液混合均勻后置于無菌處理的自封袋中,同時以不添加菌液組為空白對照,30 ℃培養箱中發酵120 h。70 ℃烘干、粉碎,測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.2 發酵方式的優化

選取優化獲得最佳菌株,將其按照體積分數為1%的接種量接種到培養基中,30 ℃活化24 h,按照同樣的方式活化2～3代,繼續培養得到發酵菌液。

將豆粕與質量分數分別為50%的水、3%的糖及5%的菌液以及堿性蛋白酶(200 U/g)混合均勻后置于無菌處理的自封袋中,分別做不添加菌液或蛋白酶的發酵組,30 ℃培養箱中發酵60 h。70 ℃烘干、粉碎,測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.3 蛋白酶添加量的優化

控制水、糖蜜及菌液的添加量不變,分別添加25、50、100、200、400 U/g的蛋白酶37 ℃發酵60 h,70 ℃下烘干、粉碎,測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.4 菌液接種量的優化

控制豆粕中的水、糖蜜及堿性蛋白酶的添加量不變,分別接種質量分數為2%、5%、7%、10%、20%、30%的菌液,30 ℃發酵60 h,70 ℃烘干、粉碎,測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.5 固態發酵時間的優化

將豆粕與質量分數分別為50%的水、3%的糖及7%的菌液以及堿性蛋白酶(200 U/g)混合均勻后置于無菌處理的自封袋中,30 ℃培養箱中發酵12、24、36、48、60、72、84 h。70 ℃烘干、粉碎,測定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.6 納米金適配體傳感器檢測β-伴大豆球蛋白降解率

納米金膠體溶液是根據經典的檸檬酸還原法合成的[12]。需先將氯金酸(100 mL,0.1 g/L)的水溶液加熱沸騰2 min,攪拌速度為250 r/min,再快速加入檸檬酸鈉溶液(3.5 mL,10 g/L),沸水浴15 min,最后使反應液冷卻至室溫即可,于4 ℃下避光保存。

將100 μL納米金溶液與20 μL 0.5 μmol/L適配體混合后孵育20 min,隨后加入20 μL 0.3 mol/L NaCl反應5 min,再加入20 μL合適的稀釋倍數的豆粕樣品上清液并反應25 min,使用SynergyH1多功能檢測儀在600和520 nm處測量吸光度,以已完全發酵降解蛋白的豆粕測定值為分母,根據吸光值A600/A520變化程度計算得到β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.7 SDS-PAGE驗證

將1.0 g豆粕樣品溶于15 mL裂解蛋白溶液(0.03 mol/L Tris-HCl,15 g/L SDS,0.1 mol/L Na2SO3),反應2 h,12 000 r/min離心7 min后取上清液。采用10%聚丙烯酰胺分離凝膠進行電泳。在電泳前,將上清液與樣品加載緩沖液(5×)在水浴下加熱10 min。轉移到每個孔中的蛋白質分散體的量約為10 μL,用考馬斯亮藍R-250染色顯示蛋白條帶。

1.2.8 氨基酸含量檢測

稱取1.0 g豆粕于具塞試管中,加入質量分數為5%的三氯乙酸定容至25 mL,常溫超聲波處理20 min后靜置2 h,用雙層濾紙過濾。取1 mL澄清濾液,15 000 r/min離心30 min,上清液用0.22 μm水膜再次過濾,使用HPLC儀檢測。

1.2.9 有機酸含量檢測

取1.0 g豆粕于50 mL離心管中,加入10 mL去離子水,漩渦振蕩15 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液,經0.22 μm濾膜過濾后,進行液相檢測。分析柱用有機酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)柱溫50 ℃,流動相5 mmol/L H2SO4溶液,流速0.6 mL/min,進樣量10 μL,標樣及樣品每個跑27 min。根據出峰時間和峰面積計算樣品中各種有機酸的含量。

2 結果與分析

2.1 發酵菌株的選擇

微生物發酵能有效消除豆粕抗營養因子,并通過產生蛋白水解酶將豆粕中的大分子蛋白降解為易吸收的小分子蛋白,提高營養價值[16]。常見的豆粕發酵所用菌種包括枯草芽胞桿菌[7]、植物乳桿菌[17]、釀酒酵母[5]等。比較不同菌株固態發酵降解豆粕β-伴大豆球蛋白β亞基的效果,如圖1-a所示,固態發酵豆粕120 h后,枯草芽胞桿菌20522發酵豆粕的蛋白降解率可達41.08%,其次是枯草芽胞桿菌10071,為34.86%。整體來看枯草芽胞桿菌在降解致敏蛋白方面的效果優于釀酒酵母、植物乳桿菌等。圖1-b的SDS-PAGE結果顯示,2組枯草芽胞桿菌發酵豆粕的β亞基條帶相對更淺,降解程度更高,而α亞基也部分降解。通過圖1-c目的蛋白條帶灰度的歸一化分析來看,枯草芽胞桿菌,尤其是20522菌株,目的蛋白占比最低,說明其含量低、降解度更高,這與傳感器的檢測結果相似。近年來國內外對于不同菌種發酵豆粕的研究顯示,不同菌種降解抗原蛋白的效果與其最適生長環境和分泌的蛋白酶有關,枯草芽胞桿菌往往在固態發酵條件下占據優勢[16]。YIN等[8]研究發現從枯草芽胞桿菌中分離的堿性蛋白酶可使β-伴大豆球蛋白抗原性有效降低?？莶菅堪麠U菌的堿性蛋白酶被歸類為絲氨酸肽酶,其水解位點是疏水氨基酸的碳末端,可通過破壞抗原蛋白的空間結構和表位構象,使其降低或失去與特異性抗體結合的能力[18]。因此,選擇枯草芽胞桿菌20522作為最佳發酵菌。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE譜圖;c-SDS-PAGE蛋白條帶灰度分析

2.2 發酵方式優化

菌發酵、酶發酵和菌酶協同發酵是常見的豆粕固態發酵方法。除了微生物發酵,添加外源酶也可以促進大豆蛋白活性等抗營養因子的降解。眾所周知,酶解不僅破壞蛋白質的一級結構,而且對破壞其高級結構具有顯著作用。根據COSCUETA等[19]的報道,酶水解脫脂大豆粉蛋白會降低其致敏性,最適合用于此的酶是堿性蛋白酶。但單純通過酶水解生產的小肽具有明顯苦味,生產成本高,限制了其開發利用[20]。

如圖2-a所示,菌酶協同組發酵豆粕的β-伴大豆球蛋白β亞基的降解程度最高,可達51.35%,其次是酶發酵,降解率為45.61%。而菌降解蛋白在固態發酵過程中效果一般,表明蛋白酶是影響發酵過程中蛋白降解的主要因素。從圖2-b的SDS-PAGE驗證結果可以看出,菌發酵的豆粕蛋白條帶比較完整,酶發酵和菌酶協同發酵豆粕的蛋白條帶大部分已經降解。圖2-c灰度分析結果顯示,蛋白含量從小到大依次是菌酶協同發酵(0.38)<酶發酵(0.43)<菌發酵(0.86),這與納米金適配體傳感器檢測結果的趨勢基本吻合。據研究報道,菌酶協同發酵可以利用微生物分泌的酶系與外加酶共同作用處理豆粕,同時添加的蛋白酶大大提高了發酵培養基的整體蛋白酶活性,促進了發酵微生物的生長、酶的分泌和糖的代謝,提高了發酵效率和質量[21-22],這與本實驗結果一致。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE譜圖;c-SDS-PAGE蛋白條帶灰度分析

2.3 酶添加量優化

HENG等[21]發現,發酵過程中蛋白酶的活性主要受微生物分泌蛋白酶的量、pH值、微生物分泌的酶對蛋白酶的降解以及某些酶抑制成分等因素的影響。在菌酶協同發酵工藝條件下,圖3-a中隨著堿性蛋白酶酶量的增加,β-伴大豆球蛋白β亞基的降解率呈上升趨勢。其中,50～200 U/g添加量間的降解效率提升最為明顯,在此區間內酶解底物是過量的,加酶量越多,酶解反應產物就越多。此后隨著酶添加量增加,降解程度變化較小,說明酶解底物反應趨于飽和,添加過多蛋白酶并沒有較好的降解效果,還會造成蛋白酶的浪費[21]。經過60 h發酵,200 U/g酶添加量組豆粕β-伴大豆球蛋白降解率可達61.94%。SDS-PAGE驗證結果顯示(圖3-b),隨著酶量的增加,β-伴大豆球蛋白β亞基條帶逐漸變淺,當酶量≥100 U/g時效果更為明顯。因此,選擇200 U/g作為堿性蛋白酶的最佳添加量。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE圖譜

2.4 菌液接種量優化

由圖4-a可知,隨著枯草芽胞桿菌20522接種量的增加,發酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率呈現先增加后下降的趨勢。當枯草芽胞桿菌接種的質量分數為7%時,降解率最高達到62.78%;當枯草芽胞桿菌接種的質量分數大于10%時,發酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率反而呈現下降的趨勢。在類似的枯草芽胞桿菌和中性蛋白酶協同發酵豆粕的研究中,也存在隨著菌液接種量的增加,發酵豆粕肽含量先增加隨后下降的現象,這可能是因為小肽含量先隨發酵降解蛋白而增加,隨后又被分解成更小的片段而導致出現下降[23]。常見的豆粕發酵工藝中添加枯草芽胞桿菌菌液接種量大多在5%～15%[24-25]。因此,選擇7%作為枯草芽胞桿菌20522最佳接種量(質量分數)。此外,在β-伴大豆球蛋白降解程度較高時,SDS-PAGE圖譜難以觀察出組間差異,而納米金適配體傳感器的檢測結果則能夠清晰、靈敏的反映出各實驗組豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE圖譜

2.5 固態發酵時間優化

發酵過程包括微生物的生長、代謝和物質的降解。這一過程需要一定的時間,但過度延長發酵時間可能會導致有害細菌污染和發酵成本增加等問題[21]。如圖5所示,在堿性蛋白酶加酶量200 U/g、枯草芽胞桿菌20522菌液接種量(質量分數)7%、料水比2∶1(g∶mL)、糖蜜質量分數3%、發酵溫度30 ℃的條件下,發酵48 ～60 h,蛋白降解率有明顯提升。隨著發酵時間的增加降解率趨于平穩,在最佳發酵時間72 h時達到最高值75.27%。根據菌酶協同發酵的相關研究,在發酵開始時,添加的蛋白酶和發酵菌株分泌的蛋白酶協同降解蛋白質。隨著發酵過程的進行,營養物質和pH逐漸降低,發酵微生物生長緩慢,蛋白酶活性逐漸喪失,因此蛋白降解效率減慢[21, 26]。另一方面,抗原性下降的程度取決于抗原位點的破壞程度。YIN等[8]發現β-伴大豆球蛋白的抗原性在酶解后期略有增加而不是降低,是由于蛋白酶進一步水解肽暴露了一些線性或隱性表位,或者抗原活性低的肽繼續水解成高活性的小片段。因此,菌酶協同發酵是降低致敏性的有效方法。

圖5 不同發酵時間對豆粕β-伴大豆球蛋白降解率的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on degradation of β-conglycinin in soybean meal

2.6 豆粕發酵前后指標分析

2.6.1 游離氨基酸含量

如圖6所示,經過200 U/g堿性蛋白酶和7%質量分數的枯草芽胞桿菌協同發酵72 h,豆粕總游離氨基酸的質量分數為3.50%,提高了3.96倍。其中必需氨基酸關乎飼料蛋白質品質優劣,其含量為原來的9.25倍,整體增長幅度較非必需氨基酸更為明顯,能有效地提高飼料蛋白質的利用率。在發酵豆粕的必需氨基酸中,賴氨酸(Lys)含量最高(0.37%),其次是亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)等,色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)含量最低。大部分氨基酸含量經過發酵后均升高,尤其是Lys和蛋氨酸(Met)的含量分別為原來的17.27倍和7.73倍。Lys和Met是豬、雞飼料中最重要的2個限制性氨基酸,對家禽等的生長發育及其他所有氨基酸的消化吸收均有關鍵影響[27-28]。同時,據NISHIWAKI等[29]報道,當肽段中疏水性氨基酸含量高時,肽的苦味相當強烈,而本研究中蛋白所含的疏水性氨基酸,如Val、Leu、Phe、異亮氨酸(Ile)等,在蛋白降解時從肽段中被釋放,從而消除了豆粕的苦味。另一方面,β-伴大豆球蛋白含有大量的谷氨酸(Glu),豆粕發酵后游離Glu的含量顯著提高2.55倍。這也證實了β-伴大豆球蛋白在菌酶協同發酵中確實發生了明顯的降解。YANG等[30]發現枯草芽胞桿菌對氨基酸含量的提升相較于其他微生物中具有優勢。以上結果表明,本研究的最優發酵工藝對蛋白質的降解效果顯著,氨基酸含量趨于營養均衡,顯著提高了豆粕的營養價值。

a-必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸含量;b-18種常見氨基酸含量

2.6.2 有機酸含量

有機酸作為畜禽的飼料添加劑,可直接參與機體代謝并提高營養物質消化率,如檸檬酸、蘋果酸、乳酸等部分有機酸可直接參與機體能量、結構和酶促反應。另一方面,有機酸還可以調節腸道菌群,抑制有害細菌的生長,延長發酵后豆粕的保質期。微生物發酵是產生有機酸的有效途徑,HENG等[21]研究發現發酵中添加的蛋白酶能有效地促進糖代謝,分泌更多的有機酸,引起的pH值下降并防止腐敗和病原微生物增殖。如圖7所示,經過菌酶協同發酵處理后的發酵豆粕中各有機酸含量均有所提高。根據毛銀等[31]的研究,不同發酵工藝的豆粕有機酸含量有較大的差別,以乳酸、乙酸和檸檬酸這3種有機酸為主?？莶菅堪麠U菌和堿性蛋白酶協同發酵豆粕中含量最高的是檸檬酸,由原來的2.68%提高到5.54%。乳酸也是衡量豆粕質量的重要指標之一,其具有維持動物腸道菌群平衡,減少腹瀉,促進鈣質的吸收等功能,豆粕經過發酵后乳酸含量達到1.62%,提高了17.72倍。乙酸含量達到1.01%,其作為抗微生物劑、酸度調節劑和酸味劑,提高了飼料的適口性。除此之外,發酵還產生了丙酸和蘋果酸,含有多種有機酸的豆粕可以有效的抑制腸道內腐敗菌生長,提高機體的免疫力。

圖7 豆粕發酵對有機酸含量的影響Fig.7 Effect of fermentation on organic acid content in soybean meal

3 結論

本研究利用新型納米金適配體傳感器從抗原蛋白降解的角度評價豆粕發酵過程。通過測定β-伴大豆球蛋白降解率,指導優化枯草芽胞桿菌20522/堿性蛋白酶菌酶協同發酵工藝,最終確定了最適發酵條件為:堿性蛋白酶加酶量200 U/g、枯草芽胞桿菌20522菌液接種量(質量分數)7%、料水比2∶1(g∶mL)、糖蜜質量分數3%、發酵溫度30 ℃,發酵時間72 h。該菌酶協同工藝在發酵豆粕降解致敏蛋白方面效果良好,β-伴大豆球蛋白降解率可達75.27%,此外氨基酸含量提高3.96倍,乳酸、檸檬酸、乙酸等有機酸的含量也有所上升,發酵豆粕的營養價值和適口性得以顯著改善。同時,本研究驗證了納米金適配體傳感器在評價豆粕抗原蛋白降解方面具有良好的特異性、穩定性和適用性,為其在飼料行業的開發應用提供理論參考及實踐指導。