恭城月柿多酚氧化酶特性研究

吳婷婷 ，段振華 ，王春婷

1.賀州學院食品與生物工程學院（賀州 542899）；2.廣西康養食品科學與技術重點實驗室（賀州 542899）；3.廣西科技大學生物與化學工程學院（柳州 545006）

柿為柿科柿屬植物，是我國六大木本糧油樹種之一[1]。我國種植地區廣泛且擁有三千多年的種植歷史，其中河南、河北、廣西是我國三大種植區，總年產量約占全國年產量的50%[2]。我國柿果品種繁多，初步可以分為兩類：一類是可以在樹上自然脫澀并直接食用的甜柿；一類是無法在樹上通過自身作用脫澀，需經過人工脫澀處理才可食用的澀柿[3]。恭城月柿，別名“水柿”，盛產于廣西壯族自治區桂林市恭城瑤族自治縣（簡稱恭城），是廣西主要種植的特色澀柿品種，距今已有400多年栽培歷史。因月柿品質上等，1996年恭城被授予全國唯一的“中國月柿之鄉”稱號，2000年，恭城月柿的優良品質讓其好評如潮，被授予“中華名果”的美稱[4]。同時，恭城月柿是一種藥食同源的水果，不僅含有豐富的維生素C、胡蘿卜素、糖類和蛋白質等營養物質及碘、鈣、鐵、磷等礦質元素，還含有大量抗氧化物質，如單寧、蘆丁和黃酮類物質等，具有一定藥用價值[5-6]。

恭城月柿營養豐富，是典型的呼吸躍變型果實，采摘后在鮮果貯存、保鮮和加工過程中極易發生酶促褐變反應，嚴重影響恭城月柿相關加工產品的風味和外觀品質，制約了恭城月柿的深加工產業。多酚氧化酶（PPO）廣泛存在于果蔬的組織細胞中，是一類含有輔基銅離子的結合酶[7]。很多研究表明PPO的激活會引起酚類物質的氧化和聚合，是果蔬酶促褐變的主要原因之一[8]，且不同果蔬中PPO的酶學特性也各有差異。因此，為阻止酶促褐變對加工產品產生的不良影響，恭城月柿PPO酶學特性的相關研究是恭城月柿采后加工的研究重點。

國內外學者對許多水果中PPO的酶學特性進行相關研究，如蘋果[9]、芒果[10]、桃[11]和檸檬[12]等。但是對于恭城月柿，很少有關其PPO的酶學特性及控制措施的報道。因此，以廣西恭城月柿為試驗材料，研究其PPO的酶學特性，以及3種酶抑制劑對PPO酶活性的影響效果，以期為恭城月柿采后生產加工過程中的酶促褐變控制及機理研究提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

恭城月柿（市售）。

1.2 儀器與試劑

PTX-FA11OS型電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；A11型微型粉碎機（德國IKA集團）；P1200S型數顯高速分散均質機（湖南力辰儀器科技有限公司）；HH-S2型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；UV-1780型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ3200DE型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；5804R型臺式高速冷凍離心機（德國艾本德股份公司）。

愈創木酚、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、冰醋酸、乙酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉（均為分析純）。

1.3 方法

1.3.1 恭城月柿PPO粗酶液的提取

參考Qi等[13]的方法并略有修改。將新鮮的恭城月柿清洗、削皮后，用液氮速凍后快速研磨呈粉末狀，放置于-80 ℃超低溫冰箱中貯藏備用。稱取1 g恭城月柿粉末，加入6 mL 0.1 mol/L pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液（溶液中含有1%的聚乙烯吡咯烷酮），振蕩搖勻后在冰浴條件下靜置提取10 min，在4 ℃以10 000 r/min離心20 min，所得上清液即為PPO粗酶液，放入4℃冰箱中保存，并在12 h內完成PPO酶活性的測定。

1.3.2 恭城月柿PPO酶活性的測定

PPO酶活性的測定采用鄰苯二酚法[13]。0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液提前用pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解配制。取2.9 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液組成反應體系，迅速啟動反應，在室溫下反應15 s后于波長410 nm處測定吸光度。每隔30 s記錄1次，共測定3 min?？瞻讓φ詹捎谜麴s水代替鄰苯二酚，以每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活力單位U，最后活力值表示為U/g。試驗重復進行3次。

1.3.3 底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響

分別用pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制濃度為0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液。分別取2.9 mL各濃度鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液，在室溫下反應15 s后于波長410 nm處測定吸光度。

1.3.4 pH對恭城月柿PPO酶活性的影響

分別配制pH 3.5，4.5和5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 6.0，6.5，7.0，7.5和8.0的磷酸鹽緩沖液，用上述不同pH的緩沖液配制濃度0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液作為反應底物。分別取2.9 mL各pH的0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液，在室溫下反應15 s后于波長410 nm處測定吸光度。

1.3.5 溫度對恭城月柿PPO酶活性的影響

濃度0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液提前用pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解配制。取2.9 mL 0.05 mol/L鄰苯二酚溶液，加入0.1 mL PPO粗酶液組成反應體系，快速搖勻反應體系，分別在20，25，30，35，40，45，50，60，70和80 ℃于波長410 nm處測定吸光度。

1.3.6 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響

在1.3.2的反應體系中分別加入0.2 mL不同濃度的亞硫酸氫鈉溶液（1，5和10 mmol/L）、抗壞血酸溶液（1，5和10 mmol/L）和檸檬酸溶液（1，5和10 mmol/L），在室溫下反應15 s后于波長410 nm處測定吸光度。PPO相對酶活性以初始酶活力為100%，不同抑制處理下測得的酶活力與初始酶活力的比值[14]。

1.4 數據處理

試驗數據使用Excel軟件進行處理分析，利用SPSS 19.0軟件進行方差分析，采用Duncan法進行統計學分析，采用Origin 2021 Pro軟件進行繪圖，數據以平均值±標準差表示，并以干基計算。

2 結果與討論

2.1 底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響

底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響如圖1所示。恭城月柿PPO酶活性與底物鄰苯二酚溶液的濃度息息相關，PPO酶活性隨著鄰苯二酚濃度的增加而呈現增大的趨勢，鄰苯二酚濃度0.03 mol/L時PPO酶活性達到最大，最大值為47.43 U/g。而刺梨PPO的最適底物濃度為0.1 mol/L[15]，杏PPO的最適底物濃度為0.067 mol/L[16]，這表明不同水果PPO反應時的最適底物濃度各有差異。隨著鄰苯二酚溶液濃度繼續增加，PPO酶活性不再增大，反而呈現穩定的趨勢。產生這種現象的原因可能是底物濃度過低時，PPO粗酶液中只有部分酶分子能與底物結合發生酶促褐變反應。隨著底物濃度的增加，越來越多的酶分子可與底物結合反應，酶分子與底物的結合達到飽和狀態，此時酶活性達到最大值，進一步增加底物濃度也不能提高PPO酶活性[17]。

圖1 底物濃度對恭城月柿PPO酶活性的影響

2.2 pH對恭城月柿PPO酶活性的影響

圖2描述pH對恭城月柿PPO酶活性的影響。在不同pH的緩沖液下恭城月柿PPO酶活性變化明顯，說明PPO酶活性對反應環境的酸堿性很敏感。pH在6.0～7.0時，PPO酶活性較高，pH 6.5時PPO酶活性達到最大，因此，恭城月柿PPO酶的最適pH為6.5，這與文獻中報道的PPO最適pH[18-19]一致。pH低于6.0或高于7.0時，PPO酶活性急劇下降，且在pH 3.5時PPO酶活性極低，這說明酸性或堿性過強的環境都不利于PPO與底物結合發生反應。PPO酶活性的下降可能與其本身的結構有關。PPO是一類含銅蛋白質，輔基銅在較強的酸性條件下會以銅離子的形式解離出來，從而導致PPO的變性失活；而在較強的堿性條件下，輔基銅又會與堿性溶液中的氫氧根離子結合形成不溶性的氫氧化銅，進一步促使酶活力顯著降低[20]。由于反應環境酸堿性嚴重影響恭城月柿PPO的酶活性，所以在恭城月柿的生產加工過程中可通過控制反應環境的酸堿性抑制PPO酶活性，進而有效控制酶促褐變。

圖2 pH對恭城月柿PPO酶活性的影響

2.3 溫度對恭城月柿PPO酶活性的影響

圖3反映不同溫度下，恭城月柿PPO酶活性的強弱。恭城月柿PPO的最適反應溫度為25 ℃，而蘋果PPO[21]的最適反應溫度為35 ℃，桃金娘PPO[22]的最適反應溫度為30 ℃，這說明不同果蔬PPO的適宜反應溫度存在差異。同時，隨著溫度的升高，恭城月柿PPO酶活性呈現先增加后減小的趨勢，溫度25 ℃時PPO酶活性達到最大值53.72 U/g，溫度80 ℃時PPO酶活性基本消失。這主要是由于PPO的本質是蛋白質，高溫會導致蛋白質的二級組織重排和三級組織斷裂，進而導致PPO變性失活[23]。在實際生產加工過程中，如果選用高溫手段使PPO失活，則應選擇80 ℃以上的溫度。

圖3 溫度對恭城月柿PPO酶活性的影響

2.4 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響

不同濃度的亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、檸檬酸溶液對恭城月柿PPO酶活性的抑制影響如表1所示。結果顯示，3種酶抑制劑對PPO酶活性均有抑制作用，其中抗壞血酸對PPO酶活性的抑制作用最強，亞硫酸氫鈉對PPO酶活性有明顯的抑制作用，而檸檬酸對PPO酶活性的抑制作用較弱，這與朱金霞等[24]對枸杞鮮果的研究結果相似?？箟难釋PO的抑制作用在于抗壞血酸與PPO結合后，PPO的α-螺旋和β-折疊結構減少，從而顯著改變PPO的二級結構[25]。從表1中還可以看出，恭城月柿PPO相對酶活性隨著抗壞血酸濃度的升高而減小，抗壞血酸濃度增大到10 mmol/L時，PPO相對酶活性僅有8.1%，極大抑制了PPO酶活性；隨著亞硫酸氫鈉和檸檬酸濃度的增大，對PPO酶活性的抑制效果越明顯。雖然亞硫酸氫鈉也能明顯抑制恭城月柿PPO活性，但是亞硫酸鹽及其分解產物SO2對人體健康有害，亞硫酸氫鈉在食品中的使用有嚴格的限制[26]。而抗壞血酸是人體必需的營養物質，同時是國標允許在鮮果加工過程中使用的食品添加劑[27]，被廣泛用于果蔬貯藏加工中，如各種果汁、罐頭的色澤保鮮等[28]。因此，在恭城月柿采后的生產加工過程中可通過添加抗壞血酸抑制PPO的酶活力，抑制酶促褐變的發生。

表1 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響（±s，n=3）

表1 不同抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響（±s，n=3）

3 結論

試驗研究反應條件和3種抑制劑對恭城月柿PPO酶活性的影響。結果表明，以鄰苯二酚為底物，恭城月柿的最適底物濃度0.03 mol/L，最適pH 6.5，最適反應溫度25 ℃。3種酶抑制劑對PPO活性均有抑制作用，抗壞血酸的抑制效果最好，亞硫酸氫鈉的效果次之，檸檬酸的抑制效果最差。其中，濃度10 mmol/L時的抗壞血酸可使恭城月柿多酚氧化酶喪失90%以上的酶活力。試驗明確恭城月柿PPO的酶學特性，為恭城月柿深加工中酶促褐變的控制提供一定理論依據。