水產動物弧菌病及其生物防治研究進展

鄧益琴

(中國水產科學研究院南海水產研究所 農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東 廣州 510300)

病害是影響水產養殖產業發展的主要原因之一。據《2022年中國水生動物衛生狀況報告》報道，2021年中國水產養殖產業因病害造成的經濟損失約為539億元。其中，弧菌病是影響多種水產養殖動物尤其是海水養殖魚類、貝類和甲殼類最常見的細菌性疾病之一[1]。Chong等[2]研究發現，石斑魚(Epinephelusspp.)約66.7%的疾病屬于弧菌病，且影響石斑魚生長的各個階段，并會導致高達50%的死亡率。由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的對蝦急性肝胰腺壞死綜合征(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)導致2010—2016年中國、馬來西亞、墨西哥、泰國和越南共計440億美元的經濟損失；患AHPND的蝦苗在投苗后10～35 d內，可達100%的死亡率[3]。因此，開展弧菌病防控技術研究對水產養殖業的可持續發展意義重大。

目前，控制水產動物弧菌病的主要手段是以抗生素為代表的藥物防治、以疫苗為代表的免疫防治及以益生菌為代表的生物防治?？股厥窃缙陴B殖生產中防治弧菌病的主要手段，在弧菌病防控中也發揮著巨大的作用[4]。然而，隨著抗生素廣泛使用產生的選擇性壓力導致耐藥性細菌的發生、留存和傳播[5]，降低了藥物防控的效果，也對環境和食品安全造成了巨大的隱患。目前，水產養殖中可用的抗生素藥劑僅包括甲砜霉素粉、 氟苯尼考粉、 氟苯尼考注射液、 氟甲喹粉、 恩諾沙星粉、 鹽酸多西環素粉、 維生素 C 磷酸酯鎂鹽酸環丙沙星預混劑、鹽酸環丙沙星鹽酸小檗堿預混劑、硫酸新霉素粉、 磺胺間甲氧嘧啶鈉粉、 復方磺胺嘧啶粉、 復方磺胺二甲嘧啶粉和復方磺胺甲噁唑粉 13種藥物(水產養殖用藥明白紙2022年2號)，而隨著耐藥性的增加，原本可用于治療AHPND的四環素和土霉素已經被限制使用[6]。疫苗接種是弧菌病的另一種有效控制策略，其是基于養殖動物免疫系統開發的用于預防感染性病害發生的一類生物制品。然而，弧菌疫苗具有一定的局限性：一是由于區域性菌種的差異導致有效性不理想；二是只能覆蓋部分養殖品種，對缺乏適應性免疫反應的蝦蟹貝等不能進行疫苗接種；三是疫苗再次免疫困難，免疫保護時間有限。因此，具有水產養殖市場授權的弧菌疫苗數量有限，國際上預防魚類弧菌病的商品化疫苗僅5種，主要針對溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌、創傷弧菌(V.vulnificus)和鰻弧菌(V.anguillaris)感染引起的弧菌病[7]，國內獲得中國新獸藥證書且用于預防弧菌病的疫苗僅2種，即牙鲆溶藻弧菌、鰻弧菌和遲緩愛德菌病多聯抗獨特型抗體疫苗，以及大菱鲆鰻弧菌基因工程活疫苗 (MVAV6203 株)[8]，不能完全覆蓋現有的弧菌種類和養殖品種。生物防治在水產養殖全過程進行疾病的廣譜預防和控制上具有優勢，且對環境和食品安全影響小，是具有巨大潛力的病害防控技術。

本文在總結弧菌病病原學、流行病學、發病機制和診斷方法的基礎上，重點從作用機制方面綜述了弧菌病最新的生物防治技術，并闡述了生物防治技術在不同水產動物中的應用，以期為水產養殖動物弧菌病的生物防治研究提供科學參考。

1 水產動物弧菌病概況

1.1 病原學

弧菌病通常指由弧菌科(Vibrionaceae)細菌引起的系統性細菌感染，進而引起的敗血癥、腸胃炎和潰瘍等[9](表1)。目前，被詳細描述和鑒定的弧菌科細菌有143種，隸屬于6個屬，即不利弧菌屬(Aliivibrio)、腸弧菌屬(Enterovibrio)、格里蒙特氏菌屬(Grimontia)、發光細菌屬(Photobacterium)、鹽弧菌屬(Salinivibrio)和弧菌屬(Vibrio)[7]。引起弧菌病最主要的是某些種類的弧菌，其次是發光桿菌。僅弧菌屬就有123個物種(http：//www.bacterio.net/)被鑒定，其中危害水產動物最主要的是哈維弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌[10]。此外，擬態弧菌(V.mimicus)是一種非嗜鹽弧菌，在淡水養殖魚類中也會造成嚴重危害。而引起弧菌病的發光桿菌主要是美人魚發光桿菌(P.damselae)，包括美人魚亞種[P.damselaesubsp.damselae，之前被稱為美人魚弧菌(V.damsela)]和殺魚亞種[P.damselaesubsp.psicicida，之前被稱為殺魚巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)]2個亞種。

表1 主要的水產動物弧菌病Tab.1 Main vibriosis of animals in aquatulture

1.2 流行病學

弧菌病最初在鰻魚中被描繪和命名，現在在全球范圍內各種野生和養殖的海洋魚類、甲殼類、軟體動物和珊瑚等中流行(表1)。Noga[11]指出，所有海洋魚類可能至少對一種弧菌敏感。因此，弧菌病已成為許多水產動物常見的一種疾病。

溫暖的海水最有利于弧菌的生存和繁殖，病原體在魚類之間迅速傳播，使弧菌病成為一種“夏季”疾病。因此，弧菌病尤其對熱帶國家的水產養殖業構成威脅。如在馬來西亞及其鄰國，全年平均28 ℃的熱帶氣候，使得許多水產養殖場弧菌病頻發。其中，從養殖鱸、石斑魚和鯛等魚類中最常分離出的病原菌是哈維弧菌，其次是副溶血弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌[10]。Noorlis等[14]報道了在馬來西亞兩種常見淡水魚——羅非魚(Oreochromissp.)和鲇魚(Pangasiushypophthalmus)中副溶血弧菌的感染情況。另一項調查顯示，從泥蟹(Scyllaserrata)、花蟹(Portunuspelagicus)、地毯蛤(Paphiatextile)、硬殼蛤(Meretrixmeretrix)和泥海蜷(Cerithideaobtusa)中也分離出了副溶血弧菌，且這些弧菌對水產養殖中常用抗生素顯示出高耐藥性[15]。自2009年在中國發現AHPND以來，由副溶血弧菌引起的AHPND一直是全球蝦養殖業的重大威脅[3]，同時，中國象山灣大黃魚(Larimichthyscrocea)也受到溶藻弧菌、哈維弧菌和副溶血弧菌等的頻繁感染[16]。此外，近年來，隨著氣候變暖，許多溫帶和寒冷地區的軟體動物也暴發了弧菌病[17]。如在愛爾蘭海及周邊地區，弧菌病引起大范圍雙殼類軟體動物幼蟲和一些甲殼類動物大量死亡[18]。

美人魚發光桿菌是引起弧菌病樣癥狀的另一種主要病原體，這種疾病也稱為光細菌病[19]。自美人魚光桿菌首次從斑鰭光鰓魚(Chromispunctipinnis)的皮膚潰瘍中分離出以來[20]，其感染已傳播到各種宿主，如大菱鲆、虹鱒、卵形鯧鲹、鰻、鱸、鰤和鯛[21]。美人魚光桿菌包括美人魚亞種和殺魚亞種2個亞種。美人魚亞種已被廣泛認為是魚類和哺乳動物(包括人類)的機會致病菌，而殺魚亞種在多種海洋魚類中引起嚴重的敗血癥(稱為假結核)。與其他弧菌一樣，殺魚亞種因其無處不在，而且具有廣泛的抗生素耐藥性，使得其感染宿主廣泛，且缺乏有效的疫苗，對海水養殖業影響較大。

1.3 發病機制

疾病的發生是病原、環境和宿主 “三元”系統作用的結果(圖1)。從病原角度分析，弧菌病發病過程一般包括病原弧菌黏附與體表定植、侵襲、體內定植與增殖擴散、產生毒素及宿主死亡等過程[7，22]。

圖1 水產動物疾病的發生及其生物防治(改編自參考文獻[23]的圖1)Fig.1 Occurrence and biological control of animal diseases(adapted from Fig.1 of reference [23])

發病的第一個關鍵步驟是病原菌黏附并定植在宿主的黏膜表面。成功的黏附是后續定植和建立感染的先決條件，微生物細胞表面的疏水性決定了弧菌成功黏附到宿主組織。菌毛黏附素及鞭毛、外膜蛋白等非菌毛黏附素，在弧菌與宿主細胞的初始附著中也起著至關重要的作用。而生物膜是許多細菌在環境中生存和傳播的關鍵因素，且生物膜的形成是致病性弧菌定植的一個重要毒力因素。

病原菌定植只意味著微生物在宿主體表或體內繁殖位點的建立，并不表示會導致對組織的入侵和損傷。病原體需要抵御宿主防御，從而侵入宿主組織，在宿主體內定植并增殖擴散，進而對宿主組織造成損害。最常見的弧菌感染途徑是通過口腔、鰓和皮膚。在細菌感染后，宿主免疫系統觸發先天和/或適應性免疫反應來中和入侵的細菌?；【置诘募毎猱a物(ECPs)，如蛋白酶、溶血素、磷脂酶、鐵載體和細胞毒素，有助于其在引起宿主疾病前逃避宿主防御。炎癥反應在細菌黏附和定植后的宿主防御機制中也至關重要?；【ㄟ^各種炎癥誘導因子，如脂多糖、肽聚糖、脂肽、脂質A、鞭毛蛋白、菌毛蛋白、DNA和外毒素，誘導炎癥反應，導致宿主過度產生炎癥介質，造成宿主嚴重的組織損傷甚至死亡，即敗血癥。此外，分泌系統，如Ⅲ型分泌系統(Type Ⅲ secretion systems，T3SSs)，是高度專門化的弧菌等革蘭氏陰性菌注射裝置，通過細胞膜將細菌蛋白(效應器)直接注射到宿主細胞的細胞質中，并參與細胞毒性，并能誘導細胞自噬、變圓和裂解等。

需要特別注意的是，盡管高毒力弧菌菌株可引起原發疾病，特別是在無脊椎動物和幾種養殖魚中，如患AHPND的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)及1990—1996年西班牙西南部養殖場感染弧菌的金頭鯛(SparusaurataL.)，弧菌常與其他已知的細菌病原體[如海水屈撓桿菌(Tenacibaculummaritimum)和假單胞菌(Pseudomonasspp.)]及病毒性病原體[如感染性胰腺壞死病毒(IPNV)和海洋雙RNA病毒(MABV-F)]等實現共感染。因此，弧菌經常被稱為繼發性或機會性病原體。

1.4 診斷方法

弧菌病的診斷通常使用標準的微生物學方法，基于病原體分離和培養，獲得純培養的細菌后進行后續的鑒定和人工感染試驗等[21-22]。

1)病原體的分離和培養。病原體的分離和培養需要選定具有臨床癥狀的目標組織。分離全身弧菌感染的首選器官是腎臟、肝臟和脾臟，當存在潰瘍時，可選擇從病變皮膚中分離。此外，胃腸道和眼等也可以進行弧菌的分離。合適的培養條件是獲得病原菌的基礎，主要考慮培養基、溫度和時長等因素。如硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽汁鹽-蔗糖(TCBS)是分離弧菌最常用的選擇性培養基。選擇性培養基的利用也被證明在針對特定物種的弧菌方面更有效。例如，CHROMagarTMVibrio(CaV)用于分離副溶血弧菌和創傷弧菌，而X-Gal(VVX)、纖維二糖多黏菌素(CPC)和纖維二糖黏菌素(CC)瓊脂則專門用于分離創傷弧菌。

2)細菌生理生化、免疫學和分子生物學等方法的鑒定。傳統的試管培養法分析細菌生理生化指標，工作量大且對技術熟練度要求較高。近年來，國內外推出了多種類型的成套鑒定系統即編碼鑒定方法。如法國生物-梅里埃集團的API/ATB、瑞士公司的Enterotube(腸管系統)和美國的Biolog全自動和手動細菌鑒定系統等，使得細菌鑒定逐步簡易化、微量化和快速化。其中，API20E系統可用于鑒定副溶血弧菌和美人魚發光桿菌殺魚亞種等。免疫學檢測技術是基于免疫學中抗原同抗體能特異性結合，通過抗原檢測抗體或通過抗體檢測抗原的技術。如免疫層析法被用于鑒定產生tdh的副溶血弧菌。然而生理生化和免疫學鑒定方法往往操作復雜、檢測耗時，甚至試劑價格昂貴等，因此，快捷、靈敏的分子生物學檢測技術迅速發展，并被廣泛運用。最常用的是基于16S rRNA的聚合酶鏈式反應(polymerase Chain Reaction，PCR)技術。16S rRNA是弧菌科所有物種中唯一可用的基因，是避免假陽性檢測的最佳基因。然而，在某些情況下，由于16S rRNA的鑒別能力較低，不能鑒定到種，因此，針對蛋白質編碼基因的PCR技術常用于鑒定弧菌，并發展出實時PCR技術(real-time PCR，RT-PCR)、多位點序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)技術、環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)等。如中國水產科學研究院南海水產研究所開發了一套三重PCR檢測方法，用于同時檢測副溶血弧菌、美人魚發光桿菌和鰤諾卡氏菌[24]，并建立了一種多位點序列分析方法鑒定哈維弧菌[25]。

3)人工感染試驗驗證。對細菌進行鑒定之后，并不能確定其為疾病的原發病原。通常情況下必須對鑒定的潛在病原菌進行致病性試驗，即人工感染試驗，依據科赫法則確證該物種的致病性。

2 水產動物弧菌病的生物防治

生物防治是利用物種間的相互關系，以一種或一類生物或其衍生物抑制另一種或另一類生物的方法。目前，開展的弧菌病生物防治技術(圖1，表2)主要有分別基于細菌、植物和病毒的益生菌及其相關產品、藥用植物及噬菌體，它們主要通過直接殺滅弧菌、抑制弧菌生長、控制弧菌毒力(調控)基因表達與傳播、刺激宿主免疫反應及改善養殖環境等方式防治弧菌病。

表2 水產動物弧菌病生物防治技術Tab.2 Biological control of vibriosis in animals in aquaculture

2.1 生物防治技術

2.1.1 益生菌及其相關產品 用于生物防治的益生菌及其相關產品主要包括益生菌(probiotics)、益生元(prebiotics)、后生元(postbiotics)和合生元(synbiotics)(表2)。1986年，Kozasa首次將益生菌應用到水產養殖中，1999年Gatesoupe首次將益生菌定義引申到水產動物上[26]。益生菌是一類活的微生物，當攝入數量足夠時有益于宿主健康[27]。益生菌可單獨使用或者混合使用[28]。目前，用于水產養殖中的益生菌主要有乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、腸球菌(Enterococcus)、肉桿菌(Carnobacterium)和酵母菌(Yeast)[29-31]。益生元是指一些不被宿主消化吸收，卻能夠有選擇性地促進體內有益菌的代謝和增殖，改善宿主免疫反應，幫助宿主抵御病原體或生物體的非生物應激源，進而改善宿主健康的有機物質[32]。益生元主要是各種寡糖或低聚糖，其中，水產養殖中常用的益生元包括甘露寡糖(MOS)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、阿拉伯木聚糖寡糖(AXOS)和菊粉。

盡管益生菌對防控弧菌病具有良好的效果，但在水產養殖系統中添加大量活細菌的安全性受到質疑，因為這些細菌也可能通過水平基因轉移等獲得高水平的抗生素耐藥性基因和毒力因子[33]。為此，研究者又開發出了后生元和合生元作為治療和預防弧菌病的可行策略。后生元是來自益生菌微生物的非活性細菌產物或代謝副產物，在宿主中具有生物活性，這些物質直接或間接地對宿主產生有益影響[34]。盡管后生元不含活微生物，但它們通過類似于益生菌的機制顯示出有益宿主健康的效果，同時最大限度地降低了與攝入相關的風險[34]。目前，可用的后生元包括有益微生物的無細胞上清液、胞外多糖、抗氧化酶與過氧化物酶等酶類、細菌脂磷壁酸等細胞壁成分、短鏈脂肪酸、細菌裂解物，以及維生素、酚類代謝產物和芳香氨基酸等腸道微生物群產生的代謝產物等。合生元是益生菌和益生元的混合物，兩者之間可通過協同和/或互補作用增強宿主生長性能[35]。其作用機理主要是合生元中的益生元通過選擇性刺激一種或有限數量的益生菌的生長和/或激活其代謝，來提高其中的益生菌在胃腸道中的存活和植入，最終改善宿主健康，如益生菌可以利用益生元作為碳源，在發酵過程中實現高生長率和細胞產量。此外，合生元中的益生元也可能直接作用于宿主免疫系統。目前，具有益生元特性的化合物，如甘露寡糖、低聚果糖、短鏈低聚果糖(SC)、菊粉、殼聚糖寡糖(COS)、低聚半乳糖、阿拉伯低聚木糖和異麥芽寡糖(IMO)，可與益生菌組合成水產養殖合生元。

2.1.3 噬菌體(bacteriophages) 噬菌體是感染和殺死細菌的病毒，廣泛分布在細菌宿主聚集的地方，如土壤或動物的腸道，其自然來源之一是海水，作為抗生素的替代品已經使用了90多年，可對抗多種細菌[38]。與化學治療相比，噬菌體治療具有有機、經濟、安全、高特異性及無副作用等特點。噬菌體有裂解性噬菌體和溶原性噬菌體兩種類型。裂解性噬菌體侵入宿主細胞后，隨即關閉其防御機制，自身復制并引起宿主細胞裂解。溶原性噬菌體侵入宿主細胞后，其核酸附著并整合在宿主染色體上，與宿主核酸同步復制，宿主細胞不裂解而繼續生長。因此，水產養殖疾病控制中所選噬菌體應具有溶解性，以避免有毒基因水平轉移到宿主，從而使養殖動物具有毒性。

2.2 生物防治機制

2.2.1 改善養殖水質 不適當的水質會損害養殖動物的健康，削弱養殖動物的免疫系統，使得弧菌有條件感染宿主，從而導致養殖動物大量死亡。益生菌尤其是光合細菌、硝化細菌和芽孢桿菌，能夠通過氧化、硝化、反硝化、硫化、氨化、解硫和固氮等作用，迅速降低水體中的氨氮、亞硝氮和硫化氫等有害物質含量，以及降解水產動物排泄物、殘余餌料和動植物殘骸等大分子有機物，從而改善養殖水質，降低弧菌感染率，促進養殖動物健康生長[39]。如芽孢桿菌，包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，可以幫助氨氮和亞硝氮的礦化，通過硝化和/或好氧反硝化防止含氮廢物的積累[40]，故此類益生菌制劑也被稱為微生態水質調節劑。與此類似，綠藻和硅藻等微藻，可吸收水體中各種營養鹽，減少水中氨氮和亞硝氮等有害物質，有效降低動物被弧菌感染的風險[41]。

2.2.2 直接殺死或抑制弧菌 益生菌通過產生抗生素、細菌素、過氧化氫、水解酶及乳酸等抑制其他微生物的生長，如益生菌產生的細菌素是由細菌核糖體合成的抗菌肽，通常對同種近緣菌株具有殺菌或抑菌作用[42]，其主要通過直接溶解目標細菌細胞壁、抑制目標細菌細胞壁合成及在細胞膜上打孔3種作用方式發揮抑菌作用[40]。微藻和微藻共生細菌構成“綠水”系統，通過產生對弧菌有害的抗菌物質(如游離脂肪酸和原二硫辛酸)，從而競爭性排斥限制弧菌可獲得的營養量，創造一個限制系統中弧菌生長的環境。微藻產生的胞內外代謝產物，也可能抑制致病菌生長，有效地預防和控制水產養殖疾病，包括弧菌病[43]。如微藻產生的長鏈飽和及不飽和脂肪酸通過誘導原生質體裂解，成為對抗多種致病菌的殺菌劑[44]；微藻也可釋放萜烯、糖苷、多不飽和醛及葉綠素a衍生物等化合物破壞病原菌，抑制病原菌生長[45]。此外，植物提取物如鄰苯三酚也具有較強的殺菌效果，通過破壞弧菌細胞壁結構等降解弧菌細胞[46]。而噬菌體則主要通過感染和裂解細菌達到防控弧菌病的目的。

2.2.3 刺激養殖動物免疫系統 益生菌進入腸道后，可以與免疫系統之間相互作用，提高淋巴細胞和吞噬細胞的活性，刺激宿主特異性和非特異性免疫，增強水產動物的免疫力和對傳染病的抵抗力，達到抗病效果[47]。與其相關的益生元、合生元和后生元也都可改善宿主免疫。

藥用植物也可安全有效地提高宿主免疫、代謝和生長能力，幫助宿主抵抗疾病[36]。如微藻產生的β-胡蘿卜素等可改善養殖動物生長，增強其免疫反應和對抗副溶血弧菌感染的能力等。植物提取物生物堿、萜類、鞣質、皂甙、糖苷類、黃酮類、酚類、甾體和精油等植物生物活性物質也具有增強動物免疫力的特性。

2.2.4 阻斷附著位點 病原菌侵染宿主的第一步是黏附，而益生菌一個重要的益生作用機制就是對黏附位點的競爭，也稱為“競爭性排斥”。當攝入益生菌時，它們會競爭結合位點，留下較少的結合位點供病原體使用。病原體通過腸道，在無結合位點的情況下能更快地離開宿主，降低感染概率。

2.2.5 競爭營養和能量 任何微生物種群的生存都取決于其在同一環境中與其他微生物爭奪營養和可用能量的能力。益生菌可利用更多可用營養來戰勝病原體，導致病原菌受饑餓而無法在腸道中生存。如鐵載體是一種低分子量的鐵螯合劑，可以溶解沉淀的鐵或從鐵絡合物中提取鐵，從而使其用于細菌生長。產鐵載體的益生菌，可以在低鐵環境中螯合三價鐵，故不利于病原菌的生長[48]。

2.2.6 干擾群體感應效應 群體感應(quorum sensing，QS)是一種細胞間的通信系統，在該系統中，細菌通過產生、檢測和響應自身誘導物(細胞外小信號分子)來控制某些基因的表達，以協調其行為。在弧菌中發現了三通道QS系統，即LuxM/LuxN、LuxS/LuxPQ和CqsA/CqsS通道。3個自身誘導劑信號分子Harveyi，即自身誘導劑1(HAI-1)、自身誘導物2(AI-2)和Cholerae自身誘導劑1(CAI-1)是分別由LuxM、LuxS和CqsA蛋白產生的N-?；呓z氨酸內酯(AHL)N-(3-羥基丁?；?-L-高絲氨酸內酯、呋喃基硼酸二酯和(Z)-3-氨基十一碳-2-烯-4-酮，并分別由LuxN、LuxPQ和CqsS蛋白感應[49]。QS系統被證明可以調節弧菌的多種生理活性，包括毒力、共生、感受態、接合轉移、抗生素產生、運動性和生物膜形成。一些益生菌，如抑黃桿菌(Phaeobacterinhibens)，可通過分泌AHL信號分子等調節弧菌的QS途徑，最終調節弧菌的生長和毒力等[50]?！熬G水”系統中的許多微藻或細菌可以分泌QS抑制劑(即N-?；?絲氨酸內酯類似物)，干擾弧菌中毒力基因的表達，并抑制其致病性。植物提取物，如十一酸(UDA)和生長素(IAA和IBA)等，也可通過下調弧菌QS相關主調控基因(luxO、luxQ、luxR和luxS)，干擾弧菌QS，從而抑制弧菌毒力基因表達。

7#橋臺外側存在兩個方向的臨空面，6#橋臺內側坡腳存在長近50 m的凹巖腔，凹巖腔砂泥巖界面發現明顯的相對位移痕跡(見圖10)，7#臺南側發現變形體并伴隨明顯的新近活動現象(見圖12)，因此該病害本質上為一巖質滑坡體，滑床為泥巖或粉砂質泥巖，滑動面為砂泥巖接觸面，后緣受L3裂隙、樁基孔發現的裂隙綜合控制，前緣為兩臨空面交匯帶，活動矢量方向非巖層傾向，受巖層產狀、凹巖腔、臨空面綜合控制，約205°左右，滑坡體規模約3.5×104 m3。

2.2.7 抑制水平基因轉移 水平基因轉移(horizontal gene transfer，HGT)不同于垂直基因轉移，其是種內或種間不同個體之間遺傳物質的交流方式，包括轉化、轉導和接合轉移3種方式[51]。接合轉移是功能基因傳播和擴散效率最高的水平基因轉移方式，其影響原核生物的致病性、耐藥性和代謝等各個方面[50]。哈維弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌等常見弧菌病原均被發現，可通過接合轉移獲取外源毒力和耐藥基因[52-55]。乳桿菌和乳酸菌等益生菌發酵產生的不飽和脂肪酸(如油酸和亞油酸)，被發現可抑制細菌接合轉移[56]。因此，益生菌產生的不飽和脂肪酸通過抑制接合轉移可阻礙弧菌毒力和耐藥基因的獲得，最終控制弧菌病害的發生[57-58]。而油酸、亞油酸、脫氫戊烯酸也是微藻和植物提取物，說明微藻和植物提取物也可抑制細菌接合轉移[59]，最終控制弧菌感染。

3 水產動物弧菌病生物防治技術的應用

3.1 益生菌和植物(提取物)的單一使用

益生菌和植物(提取物)的生物防治技術已被廣泛研究并應用于水產動物弧菌病防控(魚、蝦、蟹和貝類中弧菌病的生物防治見電子版附表A)中。使用最多的是益生菌和植物提取物，通常以拌料投喂形式進行疾病的預防和治療。在魚類養殖中，主要用于抵抗哈維弧菌、鰻弧菌、創傷弧菌和溶藻弧菌。如從健康石斑魚腸道中分離到的芽孢桿菌K2拌料投喂石斑魚后，可顯著提高其生長性能、免疫力和對哈維弧菌感染的保護力；經芽孢桿菌K2拌料投喂28 d后，用哈維弧菌攻毒，拌料投喂組石斑魚存活率(55%)顯著高于對照組(25%)[60]。用創傷弧菌感染石斑魚后，用植物提取物油酸拌料投喂石斑魚，可顯著提高石斑魚免疫反應水平和存活率(從對照組的43.3%提高至63.3%)[61]。在蝦類養殖中，由副溶血弧菌VPAHPND感染引起的急性肝胰腺壞死病及哈維弧菌感染引起的發光弧菌病是最主要的弧菌病，且蝦類生物防治技術研究主要集中于全球養殖產量第一的凡納濱對蝦。如球形紅桿菌SS15可產生抗弧菌肽，伴飼投喂可將感染VPAHPND的凡納濱對蝦的存活率提高27%[62]。而日本納豆浸提液能夠抑制細菌生物膜的形成，其拌料投喂后可將感染哈維弧菌的凡納濱對蝦的成活率從對照組的29%提高到76%[63]。在貝類養殖中，貝類弧菌病生物防治技術主要針對感染副溶血弧菌的鮑魚和牡蠣。如解淀粉芽孢桿菌可促進皺紋盤鮑(Haliotisdiscusnannai)的攝食和生長，且有效地提高了鮑魚的非特異性免疫和對副溶血弧菌感染的抵抗力。其中，105CFU/g解淀粉芽孢桿菌拌料組投喂效果最佳，感染副溶血弧菌后鮑魚死亡率從100%降低至約50%[64]。在12.5 ℃條件下，用1.5%葡萄籽提取物凈化人工海水2 d，可將太平洋牡蠣(Crassostreagigas)中副溶血弧菌數的對數(lg)減少3.52[65]。

3.2 益生菌和植物(提取物)的復合和聯用

相同的防控方式不僅可單一使用，還可復合使用，且復合可能會取得更好的效果。如用添加市售復合益生菌(含有枯草芽孢桿菌7.0×109CFU/g、地衣芽孢桿菌3.0×109CFU/g、乳桿菌5.0×108CFU/g和節桿菌1.0×108CFU/g)的飼料投喂軍曹魚(Rachycentroncanadum)，可顯著提高其生長和免疫力，并顯著降低哈維弧菌感染后的死亡率，且最佳復合益生菌添加劑量為3.3 g/kg[66]。用益生元AXOS和菊粉單獨或復合拌料投喂凡納濱對蝦后發現，與單一益生元處理相比，飼料中同時添加4 mg/g的AXOS和菊粉顯著提高了飼養8周后對蝦的生長參數及免疫相關基因的表達，還顯著提高了溶藻弧菌感染對蝦的存活率(約從10%提高至50%)[67]。用同溫層芽孢桿菌A3440和/或海洋褐色桿菌AP1220拌料投喂雜色鮑(Haliotisdiversicolor)180 d后，進行哈維弧菌感染試驗發現，單獨或者復合益生菌均可提高稚鮑的殼長和濕質量，其中，A3440拌料投喂后稚鮑殼長和濕質量增加最多，其次是復合益生菌和AP1220，而AP1220拌料投喂后稚鮑存活率提高最多，從對照組的61.33%±8.33%提高至89.33%±10.07%，其次是復合益生菌(84.00%±6.93%)和A3440(70.67%±28.37%)[68]。

不同防控方式也可以聯用，如益生菌和益生元組合成合生元使用，往往比單用益生菌或者益生元的防控效率更高。如枯草芽孢桿菌和低聚果糖聯合使用，對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)幼魚免疫應答和抗病性具有顯著的促進作用，且在飼料中添加5.62×107CFU/g枯草芽孢桿菌后，再分別添加0、0.2%和0.4% FOS，創傷弧菌感染后10 d，幼魚的累積死亡率分別為62.96%±1.85%、57.41%±1.85%和29.63%±1.85%[69]。

3.3 噬菌體的應用

近年來，噬菌體生物防治技術逐漸成為研究熱點，其主要通過直接投入養殖水體達到裂解病原菌和凈化水體的目的，并且也有單一和復合使用的方式。如從智利圣地亞哥中心市場購買的雙殼類樣品中分離出來的噬菌體，在鰻弧菌感染復數(MOA)為1和20時，將噬菌體直接加入養殖水體，可使大西洋鮭(Salmosalar)的存活率提高到100%，而在無噬菌體的情況下，存活率不到10%[70]。從牡蠣中分離出的噬菌體Viha 10和從斑節對蝦(Penaeusmonodon)孵化場分離出的噬菌體Viha 8分別裂解了70%和68%所測試的100株哈維弧菌菌株，而兩者的混合物可裂解94%的哈維弧菌菌株；養殖水中投入2×106PFU/mL(plaque forming units，PFU)的噬菌體處理，使斑節對蝦幼蝦的存活率超過85%[71]。從夏威夷海水中分離到抗珊瑚弧菌和抗管狀弧菌的5個噬菌體，其中，單個噬菌體處理可以保護牡蠣幼體免受珊瑚弧菌和管狀弧菌的感染，有效降低了幼蟲的死亡率，并呈劑量依賴性；用致死劑量的珊瑚弧菌攻毒6 d后，5個噬菌體的混合物可將美洲牡蠣(Crassostreavirginica)和太平洋牡蠣的幼體死亡率降低91%[72]。

總體來說，生物防治技術在各種水產動物弧菌病防治中被廣泛研究，體內外試驗均證明，其可通過殺死或抑制弧菌并刺激宿主免疫反應等顯著提高養殖動物的存活率。此外，同一防控類型的不同防控技術，如不同的益生菌、植物(提取物)及噬菌體之間可以復合使用，且不同的防控類型，如益生菌與益生元、益生菌與植物提取物等之間可以聯合使用，同一防控技術可能呈現劑量依賴性，但目前主要停留在理論基礎研究上，有效的成果轉化和商業化效率較低。

4 存在問題及展望

弧菌病危及全球水產業，由于多種因素影響(如弧菌的異質性、適應能力及在海洋環境中普遍存在的特性)，弧菌病防治已成為水產養殖產業持續面臨的問題?；诳股刂委熁【〉沫h境不友好性及疫苗使用的局限性等，良好的管理措施和潛在的生物防治方法是降低水產養殖業經濟損失和確保本行業可持續發展的最佳途徑。目前，正在探索的生物防治方法，主要包括使用益生菌(益生元、后生元、合生元)、藥用植物和噬菌體，然而，選擇使用的方法將取決于養殖方式、養殖規模、感染水平、有效性和經濟成本等因素。盡管每種方法都有顯而易見的優勢，但仍然存在一些缺陷和知識空白，包括作用機制、作用模式，對水產動物和環境可能產生的毒性，以及它們在實際養殖系統中應用的可行性。這些知識是生物防治方法被推廣和商業化所必需考量的，因此，未來可從以下方面重點開展研究。

4.1 加強生物防治技術作用機制的基礎研究

疾病的發生是病原、環境和宿主相互作用的結果。生物防治方法不僅可改善養殖環境，還可刺激宿主免疫系統。針對病原方面，主要集中在對病原菌的抑制和消殺方面，但具體的抑制機制如阻斷附著位點及競爭營養和能量的研究較少。同時，病原菌毒力基因的存在與表達決定其毒力作用的發揮。因此，深入研究生物防治技術的作用機制，尤其是該技術對群體感應和水平基因轉移等的作用機制，是建立毒力控制技術的基礎，可為生物防治技術的建立提供重要理論支持。

4.2 建立生物防治技術標準和技術體系

未來水產養殖業的方向是精準化、標準化和集成化作業。目前的研究更多是針對單一生物防治技術的防治原理和防治效果的解析。不同防治方法間的協同、拮抗作用，以及劑量依賴性和時間依賴性等都不甚清楚。因此，在明晰生物防治作用機制和作用效率的基礎上，需要進一步探究不同生物防治技術間的復合、混合作用效果，并確定最佳作用劑量、作用時機和作用時間等動力學參數，建立一套生物防治的標準和體系，以擴展生物防治技術的使用范圍，增強生物防治技術的作用效果。

4.3 加快推進生物防治技術體系的商業化

生物防治具有使用廣譜性和安全性的特點，是最具應用前景的水產疾病防治手段。目前，生物防治多集中于基礎研究和小范圍的應用示范層面，為促進生物防治的應用，以增效降本、環境友好為原則，亟待加快推進生物防治商業化體系的探索，進一步實現生態化的水產疾病防控，為實現中國水產養殖業綠色可持續高質量發展提供重要技術支撐。