燕麥PRR基因家族鑒定與表達分析

南金生,王躍飛,安江紅,3,劉 娜,溫欣燕,王夢旭,王媛媛,強 澤,韓 冰

(1.內蒙古農業大學麥類種質創新利用自治區高等學校重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古自治區農牧業生態與資源保護中心,內蒙古呼和浩特 010010;3.內蒙古自治區農牧業科學院,內蒙古呼和浩特 010031)

燕麥是禾本科燕麥屬(AvenasativaL.)一年生草本植物,是一種世界性的糧飼兼用作物[1]。光是植物的重要環境因子,參與多個生理過程,包括光形態建成、避蔭反應、種子萌發、開花和衰老[2-3]。植物通過自身的光響應系統,能夠準確及時地響應外界光信號的變化[4-5]。晝夜長短影響植物開花的效應叫做光周期現象,Garner和Allar在1920年研究發現日照長度是調控煙草成花的重要因素,由此提出光周期現象[6]。根據開花結實對晝夜長短的不同響應,將植物劃分為長日照、短日照和日中性植物等類型。

植物開花是一個受外部環境和內部基因調節的復雜生物學過程。在擬南芥中,CONSTANS/CONSTANSLIKE/TOC1基因家族成員參與光周期開花調控、光信號途徑和生物鐘調控等過程[7-8]。CCT家族包括CMF(CCT MOTIF FAMILY)亞家族、COL(CONSTANS-like)亞家族和PRR亞家族[9]。氨基端的PRR/RLD(receiver like domain)結構域和羧基端的CCT結構域是偽應答蛋白調節(pseudo-response regulators,PRRs)基因家族結構的顯著特征[10-12]。N端響應調節接收結構域和參與ASP磷酸化信號轉導途徑的接收域極度相似,C端CCT結構域與酵母血紅素激活蛋白(HAP2)的NF-YA2DNA結合區相似,CO(CONSTANS)的CCT結構域能夠與其他HAP蛋白結合[13-14]。擬南芥中鑒定出了PRR1(TOC1)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9基因[15-17],水稻中有5個直系同源PRR基因,分別為OsPRR1/OsTOC1、OsPRR37、OsPRR59、OsPRR73和OsPRR95[18]。

傳統的燕麥是長日照作物,當日照時長低于14 h時,傳統的春夏播燕麥材料(下文統稱普通燕麥材料)不能抽穗開花[19]。為了提高燕麥產能,擴大適種范圍,創制光周期不敏感材料成為育種工作亟待解決的問題。前期通過野生燕麥與栽培燕麥品種的雜交創制出一批對光周期不敏感的種質資源,在海南自然短日照條件下可以正常生長發育。前期通過轉錄組測序挖掘出了與光周期不敏感相關的差異表達基因,并預測了燕麥光周期不敏感模型[20];一個晝夜光周期的表達量分析表明,PRR家族成員在普通燕麥材料和光周期不敏感材料中表達量變化趨勢、表達峰值出現時間和表達量均存在差異,這些基因可能通過響應晝夜節律變化進而影響燕麥光周期敏感性[21]。本研究根據轉錄組數據篩選出31個與燕麥光周期不敏感相關PRR家族基因的轉錄本,進行蛋白理化性質分析、結構預測、進化分析及光周期的表達分析;進一步在全基因組水平挖掘到2個AsPRR基因家族成員,利用生物信息學方法全面分析其染色體定位、基因結構、進化關系、啟動子區域的順式作用元件及其表達模式,為揭示光周期不同敏感性燕麥材料在響應短日照脅迫下的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

供試材料包括普通燕麥紅旗2號(本實驗室保存)和之前創制的光周期不敏感材料gp012。對供試材料進行短日照處理,控制日照時長為12 h,播種和遮光方法參考楊曉虹等[22]的研究。

1.2 燕麥PRR基因家族成員的鑒定

轉錄組水平:根據COG_class_annotation、GO_annotation、KEGG_annotation、KOG_class_annotation、Pfam_annotation、Swissprot_annotation、eggNOG_class_annotation和nr_annotation的分類和注釋結果篩選出與植物開花調控、晝夜節律相關的轉錄本。

基因組水平:根據GrainGenes網站(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/graingenes_ downloads/oat-ot3098-pepsico)公布的燕麥基因組數據庫,利用已經鑒定的9條擬南芥(Arabidopsisthaliana)PRR家族蛋白序列的保守結構域構建隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Models,HMM),以此模型搜尋Avenasativa的所有編碼蛋白序列,使用blastp(ncbi-blast-2.10.1+)進行比對,找出Avenasativa蛋白序列中的所有潛在的PRR家族序列。對獲得的候選序列利用軟件pfamscan(v1.6)和Pfam A(v33.1)數據庫對目標序列進行結構域注釋,確定同時含有PF06203、PF00072結構域的序列作為最終的PRR序列。

1.3 生物信息學分析

利用BLAST在線分析基因同源性;利用DNAMAN同源序列比對;利用ProtParam工具預測蛋白質基本理化性質;利用NPS@server在線工具預測蛋白質二級結構。使用在線分析軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)預測基因結構;用MEME軟件(V5.0.5,http://meme.nbcr.net/meme)分析保守motif。用鑒定出來的AsPRR蛋白與擬南芥、小麥、大麥、玉米、高粱和黑麥草等的PRR蛋白家族序列構建NJ樹。用mafft(V7.427)進行多序列比對,然后用MEGA(MEGA7.0)軟件進行NJ樹的構建,Bootstrap設為1 000。截取基因結構上游2 kb區域作為啟動子調節序列,利用(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子上面的TF結合位點。在基因啟動子物理圖譜中標記和顯示結合位點的位置。利用在線軟件(http://www.softberry.com/berry.phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)對AsPRR家族成員進行亞細胞定位預測。根據AsPRR基因在染色體上的位置,利用網站http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/繪制染色體物理位置圖。利用SignalP-4.1工具進行共線性分析。

1.4 RNA的提取與cDNA合成

使用Transzol Up Plus試劑盒提取試驗材料葉片的總RNA,以超微量紫外分光光度計對RNA進行濃度定量測定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性和濃度,并反轉錄為cDNA。

1.5 引物設計

利用Primer5.0軟件,設計qRT-PCR所需引物,試驗所用引物由北京六合華大有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primer of the qRT-PCR analysis

1.6 qRT-PCR

以cDNA作為模板,以燕麥Actin為內參基因,進行qRT-PCR分析。反應體系20 μL: cDNA 1 μL,正反向引物各0.5 μL(10 μmol·L-1),2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL, ddH2O 8 μL。反應程序:95 ℃預變性1 min;按照下列循環參數進行擴增反應:95 ℃ 15 s,退火溫度15 s,72 ℃ 10 s, 40個循環;60 ℃ 30 s,20 ℃ 10 s。每個待測基因均進行3次技術重復及3次生物學重復。采用2-ΔΔCT法分析數據。

2 結果與分析

2.1 燕麥PRR家族成員理化特征分析

轉錄組測序數據中功能注釋為PRR基因的轉錄本共31個,包含6個PRR基因,分別是PRR1(7個)、PRR3(3個)、PRR6(1個)、PRR37(6個)、PRR73(12個)和PRR95(2個)。篩選獲得上述6個注釋為PRR基因的最長轉錄本,其中PRR1-7編碼513個氨基酸,PRR3-2編碼703個氨基酸,PRR3-2編碼253個氨基酸,PRR37-2編碼434個氨基酸,PRR73-2和PRR73-6均編碼767個氨基酸,PRR95-1編碼594個氨基酸(表2)。

2.2 燕麥PRR蛋白家族成員結構域及建模

利用在線預測工具分析31個PRR基因編碼蛋白序列二級結構。結果表明,無規則卷曲所占比例最大,其次是α螺旋,延伸鏈與β-轉角所占比例較小(圖1)。

PRR1-5、PRR1-7、PRR3-2、PRR3-3、PRR73-2、PRR73-6、PRR95-1等7個基因編碼產物含有REC結構域和CCT結構域,PRR1-2、PRR73-1編碼產物不包含保守結構域。同時含有REC和CCT結構域的序列中,REC結構域的氨基酸數目有79和104兩類,CCT結構域的氨基酸數目也有43和44兩類,PRR1-2和PRR73-1編碼蛋白均不含有REC和CCT結構域(圖2)。

圖2 燕麥 PRR 家族成員蛋白保守結構域分析

2.3 燕麥與其他物種PRR蛋白的進化分析

為了研究燕麥PRR家族成員的進化關系,使用MEGA7.0對燕麥PRR家族成員與其他物種的PRR蛋白構建系統發育樹(圖3)。結果表明,PRR1與大麥(Hordeumvulgare)TOC1、小麥(Triticumaestivum)TOC-A1/TOC-B1/TOC-D1、山羊草(Aegilopstauschii)PRR1親緣關系較近;PRR3與山羊草、大麥的PRR3親緣關系較近;PRR37與山羊草親緣關系最近;PRR73與山羊草、大麥的PRR73親緣關系較近;PRR95與黑麥草(Loliumrigidum)的親緣關系最近。

圖3 燕麥與其他物種的PRR蛋白的進化分析

2.4 燕麥AsPRR基因家族成員的全基因組鑒定

根據擬南芥PRR蛋白構建隱馬可夫模型對燕麥蛋白數據庫進行搜索,同時具有PF06203和PF00072結構域的才認定為AsPRR蛋白。結果得到2個AsPRR家族成員,分別定位在4A和5C染色體上,其中AsPRR1位于4A染色體的中部,AsPRR2位于5C染色體的末端(表3)。共線性分析結果表明二者之間不存在共線性。AsPRR1和AsPRR2基因分別編碼703和621個氨基酸,其編碼蛋白分子量分別為76.5和68.6 kDa,等電點分別為8.65和6.52,蛋白不穩定指數分別為47.23和54.07,GRAVY值分別為-0.657和-0.756,結果表明AsPRR1和AsPRR2為不穩定的疏水蛋白。經亞細胞定位預測分析,AsPRR1定位在細胞外,而AsPRR2定位在細胞核中。

表3 燕麥AsPRR基因家族成員信息Table 3 Information of AsPRR gene family members in oat

2.5 燕麥AsPRR家族的基因結構和蛋白的motif結構分析

經過基因結構預測發現AsPRR1和AsPRR2均包含9個外顯子和8個內含子(圖4)。為了研究燕麥AsPRR序列的保守性,利用MEME軟件進行蛋白序列分析,預測到15個保守motif(圖5)。motif1、motif2和motif3最為保守,而motif6、motif8、motif10和motif13等基序在兩個基因中的位置不同。

圖4 燕麥AsPRR基因結構分析

圖5 燕麥AsPRR家族蛋白的motif分析

2.6 燕麥AsPRR蛋白家族系統進化

為了明確燕麥AsPRR基因家族與擬南芥、水稻、小麥、大麥、黑麥草與山羊草PRR家族間的進化關系,利用PRR蛋白與燕麥AsPRR蛋白序列構建系統進化樹(圖6),結果發現AsPRR1與黑麥草的APRR3關系最近,AsPRR2與黑麥草PRR95關系最近。

2.7 燕麥AsPRR基因順式作用元件分析

截取基因結構上游2 000 bp區域作為啟動子調節序列,分析順式作用元件的分布。圖7展示了排在前15的元件,不同元件用不同顏色表示,其中包括轉錄起始相關作用元件TATA-box和CAAT、生長發育作用元件O2-site、激素響應元件ABRE以及光響應元件G-box等,而MYC元件可能參與調控花發育、花器官的形態發生和開花時間。

圖7 AsPRR基因啟動子區域的順式作用元件分布

2.8 燕麥AsPRR基因表達分析

短日照條件下,AsPRR基因在gp012和紅旗2號的幼穗和葉片中不同時期的表達模式不同。紅旗2號幼穗發育滯留在枝梗分化期,AsPRR1和AsPRR2在穗(圖8a和圖8b)和葉(圖8c和圖8d)的表達量均呈現升高趨勢;gp012可以完成整個穗分化過程,AsPRR1和AsPRR2在穗和葉的表達量均呈現先升高后降低再升高的趨勢(圖8a-d)。AsPRR1和AsPRR2在gp012的初生期幼穗中表達量與紅旗2號差異不顯著,在葉片中的表達量差異極顯著;AsPRR1和AsPRR2在gp012的伸長期幼穗中表達量與紅旗2號差異極顯著,葉片中AsPRR1的表達量在兩種材料的伸長期差異不顯著,而AsPRR2的表達量差異極顯著。隨著生長發育至枝梗分化期,AsPRR1和AsPRR2在gp012穗中的表達量顯著降低,葉片中AsPRR1和AsPRR2的表達量于伸長期就已經開始出現顯著降低。AsPRR2基因在gp012的不同組織、不同時期中的表達量均高于AsPRR1(圖8f和圖8h),AsPRR2基因在紅旗2號穗中的表達量高于AsPRR1(圖8e),AsPRR1和AsPRR2在紅旗2號葉中的表達量隨著發育階段的不同而不同(圖8g)。以上結果表明,AsPRR1和AsPRR2基因參與燕麥光周期途徑,并發揮調控作用。

a是AsPRR1基因于穗部的表達量;b是AsPRR2基因于穗部的表達量;c是AsPRR1基因于葉片的表達量;d是AsPRR2基因葉片的表達量;e是基因于紅旗2號穗部的表達量;f是基因于gp012穗部的表達量;g是基因于紅旗2號葉片的表達量;h是基因于gp012葉片的表達量;A～G分別為初生期、伸長期、枝梗分化期、小穗分化期、小花分化期、雌蕊分化期和四分體期;*和**分別表示0.05和0.01水平顯著性

3 討論

3.1 多物種PRR家族基因研究及其保守結構域

偽應答蛋白調節家族(pseudo-response regulators,PRRs)是生物鐘核心振蕩器成員,它在維持生物鐘穩定的調控、開花時間的調控、光合作用和氧化應激反應等過程中發揮著非常重要的作用[23]。目前在擬南芥與水稻中PRR家族基因對光周期開花途徑的調控機制研究成果較多,在大麥、小麥、高粱和大豆等也發現了PRR家族基因。PRR家族基因還可通過調控ABA等方式影響植物抗逆性[14],對植物生物量的積累有重要影響。目前,燕麥PRR基因家族的研究較少,其調控機制尚未明確,有待進一步研究。

REC結構域中的磷酸激酶磷酸化位點能識別來自雙組分信號轉到系統的信號,在生物應答調節方面發揮重要作用[15],CCT結構域能介導蛋白質之間的互作,能夠響應環境的節律變化。擬南芥、大麥、小麥、水稻、高粱等植物中發現的PRR基因也是同時含有REC與CCT結構域,有關保守結構域之間具體的互作關系尚未明確。

3.2 PRR基因在多個物種中參與生理調控

在擬南芥中,PRR基因是生物鐘的核心組分,參與生物鐘循環,調控下游基因表達[25]。野生和栽培大豆雜交產生的重組近交種群中表征了兩個生長期數量性狀基因座Gp11和Gp12,攜帶它倆的品系往往具有更短的生長期和更高的GmFT2a和GmFT5a表達[25]。PRR5、PRR7和PRR9均可以通過CONSTANS依賴性途徑控制開花時間[26],PRR7是通過抑制其他蛋白的表達來調控光周期開花的關鍵基因[27]。水稻中的PRR37在其開花過程中充當中央阻遏物。大麥的Ppd-H1(HvPRR37)[28]在長日照下能調控HvCO-like基因的表達,而短日照無明顯影響[29]。高粱中SbPRR37在長日照條件下會出現早上和晚上的表達峰并通過直接抑制SbEhd1的轉錄來抑制成花素FT(FLOWERING LOCUS T)的表達,另一方面能夠激活CO的表達來間接抑制FT的表達,從而抑制高粱開花;在短日照條件下,SbPRR37在晚上的表達峰消失,對高粱開花基因的抑制減弱。大豆中GmPRR37基因在短日照條件下對開花時間沒有明顯的影響,而在長日照條件下,GmPRR37下調促進開花FT同系物GmFT2a和GmFT5a的表達,上調抑制開花的FT同系物GmFT1a的表達[30]。除影響開花外,PRR基因還有其他功能。例如,OsPRR73通過降低表達來響應水稻干旱脅迫[31]。冷脅迫會刺激水稻OsPRR1的響應,促進OsPRR37、OsPRR73、OsPRR59和OsPRR95基因的表達[23]。PRR5基因表達受ABA抑制,但prr5突變體的種子發芽率顯著高于野生型,且主根長于野生型[33]。小麥TaPRR37與小麥抽穗期和株高顯著關聯,OsPRR37也可以參與控制水稻抽穗期、穗粒數和株高等性狀[34]。

燕麥PRR基因家族參與光周期途徑,gp012在短日照條件下可以完成全生育期的發育過程,AsPRR1和AsPRR2基因在短日照條件下表達量下調,解除了對開花調控基因FT的抑制,促使gp012能夠正常進入小穗分化期發育階段。

3.3 PRR的短串聯重復序列

AsPRR基因在編碼區域存在多處短串聯重復序列。編碼區域的大多數串聯重復序列變異可能會引起錯義突變、同義突變甚至移碼突變,產生新型的蛋白質,從而引起基因功能的增加或者丟失。外顯子區域的微衛星序列變異使外顯子區域序列的多樣化,可能會影響基因轉錄和翻譯。植物中的串聯重復序列在外顯子區域密度較低,但它們的消失可能引起剪輯改變、外顯子改組和點突變,從而改變基因表達進而極可能導致表型的改變[35]?；蜷g隔區域的串聯重復序列變異通常不會直接影響基因表達,但可通過影響染色質組織結構來調控基因表達從而間接影響基因的功能[36],如在著絲粒區域產生折疊而形成特殊的二級結構或者更高的結構。

4 結論

燕麥光周期敏感性與穗發育從枝梗分化期向小穗分化期的轉化有關,短日照條件下,AsPRR基因在小穗分化期的下調表達促進了gp012在開花;普通燕麥材料與光周期不敏感性材料的PRR基因在UTR、外顯子和內含子區域均存在差異。