農戶田塊尺度冬小麥不同產量水平土壤細菌群落差異

米 倩,陳鮮妮,徐曉峰

(河南科技大學農學院,河南洛陽 471000)

目前全球人口的持續增長要求提高糧食產量以滿足社會需求,全球糧食生產正面臨巨大挑戰[1]。過去幾十年時間,我國糧食產量提高是建立在大量施用化肥基礎上的[2]。但是,過量的肥料施用不僅使作物不能增產[3],而且會引起硝酸鹽淋洗、土壤污染、水體富營養化等問題[4, 5]。目前迫切需要新的策略來提高作物產量。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分,在農業生產中扮演著重要角色[6]。細菌是土壤微生物中數量最大的類群,與土壤碳、氮循環關系密切[7],而且土壤細菌對植物健康和植物生長也有影響[8]。土壤細菌可以通過參與養分循環促進作物吸收養分以及維持作物健康和生長發育,為作物高產奠定基礎[9]。

小麥在我國農業生產中占有重要地位,小麥產量提升對我國糧食安全起著重要作用[10]。有學者研究發現,土壤細菌與小麥產量存在聯系。如,長期施肥條件下土壤細菌多樣性與小麥產量呈顯著正相關[11];小麥與苜蓿、豌豆、油菜間混作可增加土壤細菌數量,進而提升小麥產量[12]。值得注意的是現有研究大多采用田間試驗探討特定因子影響下土壤細菌對小麥產量的影響[11-13]。但我國的糧食生產主要依靠農民,田間試驗很難反映我國農戶農田經營實際情況,在指導農業生產方面有一定的局限性。此外,揚花期是冬小麥由營養生長轉變為生殖生長的階段,是決定麥穗籽粒數以及產量的關鍵時期[14, 15],這一時期小麥植株新陳代謝旺盛,需吸收大量養分滿足生長需要[16],而細菌在土壤養分轉化中發揮著重要作用,因此揚花期土壤細菌對決定小麥產量十分重要。劉曉丹等[13]研究發現,小麥揚花期土壤細菌數量與產量呈顯著正相關,但是目前相關研究仍相對較少,揚花期土壤細菌群落與小麥產量之間的關系仍不清楚。本研究通過大田調查的方法,以小麥種植戶田塊為研究對象,采集揚花期麥田土壤樣品,分析農戶麥田土壤細菌群落特征及其與小麥產量的關系,以期為實現小麥持續穩定增產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域和樣本采集

研究區位于黃淮海小麥主產區西側河南省濟源市,地處于南太行山前,屬暖溫帶季風氣候區,年平均氣溫14.5 ℃,年平均降雨量567.9 mm,土壤類型按地理發生分類為褐土。土壤養分平均含量:有機質19.42 g·kg-1、全氮1.11 g·kg-1、有效磷17.30 mg·kg-1、速效鉀143.50 mg·kg-1[17]。本研究于2020年9月采用分層隨機抽樣法選取樣本,在河南省濟源市隨機抽取2個鄉鎮,在抽取的各鄉鎮內隨機抽取4～8個自然村,每個自然村內隨機抽取1～3戶小麥種植戶,以其麥田作為研究對象,同時要求所選田塊面積不小于0.1 hm2,以保證田塊具有代表性。最終征集到19個田塊(田塊面積為3～50 hm2),采樣田塊位于五龍口鎮(112°42'26.97"E,35°09'56.03"N)和梨林鎮(113°14'54.77"E,35°13'15.47"N),樣點信息見表1。

表1 采樣點基本信息Table 1 Basic information of sampling sites

于冬小麥揚花期(2021年4月25日-5月1日)在每個田塊隨機選取3個樣方(樣方間距離較遠且遠離地頭、地邊和公路,以保證具有代表性),各個樣方內用鐵鍬將耕層土壤混合均勻,進行土壤樣品采集。土壤樣品帶回實驗室去除植物根、石子等雜質后,將3個樣方土壤樣品混合均勻后作為該田塊土壤分析樣本。采用1 m雙行測產法進行小麥產量測定。于小麥成熟期(2021年5月25日-5月26日)在每個田塊隨機選取3個采樣點,每個采樣點取20株長勢均勻的小麥植株,帶回實驗室后將穗分離,殺青烘干至恒重后,脫粒稱重,測定小麥穗粒數及千粒重;對每個田塊的行距進行測定,并在每個田塊選取3個長1 m且有代表性的采樣段,調查統計小麥穗數。

1.2 土壤理化性質及土壤酶活性測定

土壤全氮(TN)含量以CuSO4為催化劑濃H2SO4消化,連續流動分析儀(AA3,德國SEAL)測定;土壤有機質(SOM)含量用重鉻酸鉀-外加熱法測定;土壤硝態氮(NO3--N)含量用0.01 mol·L-1CaCl2提取,紫外可見分光光度計測定;土壤銨態氮(NH4+-N)含量用2 mol·L-1KCl提取,連續流動分析儀測定;土壤有效磷(AP)含量采用0.5 mol·L-1NaHCO3提取,連續流動分析儀測定;土壤速效鉀(AK)含量用1 mol·L-1NH4OAc浸提,火焰光度法測定;土壤pH值采用土水質量比1∶2.5的0.01 mol·L-1CaCl2浸提,電位法測定[18]。

參照關松蔭[19]等的方法測定土壤脲酶(URE)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)活性。脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定,其活性以培養24 h后1 g土壤中NH4+-N的毫克數表示。過氧化氫酶活性用紫外可見分光光度法測定,其活性以20 min內1 g土壤分解的H2O2的毫克數表示。磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測定,其活性以1 h內1 g土壤產生的對硝基苯酚的毫克數表示。

1.3 產量數據處理

小麥理論產量=穗數×穗粒數×千粒重×0.8。

以平均產量為標準對樣本進行不同產量水平的劃分,高于平均產量的田塊劃為高產組,低于平均產量的田塊劃為低產組。本研究平均產量為7 695.67 kg·hm-2,高產組與低產組的田塊數分別為9個和10個(表1)。

1.4 DNA提取和測序

使用TGuide S96磁珠法-土壤基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取。采用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進行細菌PCR擴增。將PCR產物用1.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用Monarch DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物。凝膠純化后的PCR產物使用Illumina NovaSeq 6000進行測序分析,該測序平臺由北京百邁客生物科技有限公司提供。使用Trimmomatic-0.33對原始序列進行質量過濾,用Cutadapt-1.9.1進行引物序列的識別與去除,使用Usearch-10進行序列拼接,使用Uchime-4.2鑒定并去除嵌合體序列,得到的高質量序列使用Usearch-10按照97%相似性將序列劃分為不同的OTU。采用SILVA-138數據庫進行細菌物種分類注釋。

1.5 統計分析

采用SPSS-26對不同產量水平的數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗,并進行單因素方差分析,比較不同產量水平小麥產量、土壤理化性質以及酶活性差異。用R-4.1.0軟件cor.test()函數“Spearman”算法對細菌門相對豐度、屬相對豐度與小麥產量進行Spearman相關性分析。利用Origin-2022軟件進行相關性熱圖繪制,明確對小麥產量有顯著影響的細菌類群與環境因子的關系。使用SPSS-26的Kruskal-Wallis秩和檢驗對不同產量水平細菌α-多樣性進行差異性分析。使用R-4.1.0軟件“vegan”包進行基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析,計算土壤細菌群落β-多樣性;通過相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)檢驗不同產量水平之間β-多樣性差異顯著性。使用R-4.1.0軟件cor.test()函數“Spearman”算法對β-多樣性指數與土壤理化性質、酶活性進行Spearman相關性分析。

用R-4.1.0軟件構建偏最小二乘路徑模型(partial least squares path modeling,PLS-PM),評價土壤理化性質、土壤酶活性、細菌多樣性以及物種豐度對小麥產量的影響。其中,細菌多樣性用Chao1指數和香農指數表征,物種豐度用細菌屬水平的相對豐度表征。用擬合優度指數(goodness-of-fit,GOF)評價模型的整體擬合度。

2 結果與分析

2.1 麥田土壤理化性質及酶活性

高產組和低產組的小麥產量均值分別為9 007.00和6 515.47 kg·hm-2(表2),兩組間差異極顯著(P<0.001)。高產組的土壤銨態氮含量顯著高于低產組(P<0.05),土壤有機質含量、速效鉀含量、有效磷含量、硝態氮含量、pH值在組間均無顯著差異。高產組的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性與低產組也均無顯著差異(表3)。

表2 不同產量水平下麥田土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties in wheat field at different yield levels

表3 不同產量水平下麥田土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities in wheat field at different yield levels

2.2 麥田土壤細菌群落組成及多樣性特征

從門水平看,麥田土壤細菌群落優勢菌門為酸桿菌門(Acidobacteria,相對豐度21.89%～43.82%)和變形菌門(Proteobacteria,24.45%～37.40%),擬桿菌門(Bacteroidetes,4.34%～12.33%)、綠彎菌門(Chloroflexi,4.28%～7.85%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,4.72%～7.69%)、放線菌門(Actinobacteria,3.01%～8.85%)的相對豐度較高(圖1a)。從屬水平看,麥田土壤細菌群落優勢菌屬為uncultured_c_Subgroup_6(11.64%～29.10%),RB41(2.53%～12.85%)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas,1.47%～9.35%)、uncultured_f_Gemmatimonadaceae(2.44%～5.12%)、uncultured_c_Deltaproteobacteria(1.66%～4.60%)的相對豐度較高(圖1b)。

圖1 麥田土壤細菌群落在門(a)和屬(b)分類水平上的相對豐度

土壤細菌α-多樣性用Chao1指數和香農指數表示。麥田土壤細菌OTU數量為1 529～1 741條,Chao1指數為1 641～1 792,香農指數為8.82～9.44。通過Kruskal-Wallis秩和檢驗發現,高產組的細菌OTU數量、Chao1指數以及香農指數與低產組都無顯著差異(表4)。通過非度量多維尺度(NMDS)對土壤細菌β-多樣性進行分析表明,擬合度較好(Stress<0.1)(圖2),ANOSIM發現,高產組的細菌群落β-多樣性與低產組差異顯著(r=0.20,P<0.01)。

圖2 不同產量水平下麥田土壤細菌β-多樣性

表4 不同產量水平下麥田土壤細菌α-多樣性Table 4 α-diversity of soil bacteria in wheat field at different yield levels

2.3 土壤細菌群落特征與小麥產量的關系

相關性分析(表5)表明,小麥產量與芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)相對豐度呈顯著正相關,與Latescibacteria、Dadabacteria相對豐度呈顯著負相關。屬水平上,有36個細菌屬的相對豐度與小麥產量顯著相關,其中Bryobacter、黃桿菌屬(Flavisolibacter)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、豐佑菌屬(Opitutus)、黏液桿菌屬(Mucilaginibacter)相對豐度與小麥產量呈顯著正相關,Dongia、Chryseolinea、Pantoea、陶厄氏菌屬(Thauera)、多囊菌屬(Polyangium)、Chitinophaga相對豐度與小麥產量呈顯著負相關(剩余25個屬因屬于未鑒定的細菌未列出)。

表5 小麥產量與土壤細菌門/屬相對豐度的相關性Table 5 Correlation analysis of wheat yield with relative abundance of bacterial phylum/genus

2.4 土壤理化性質、酶活性與細菌群落的關系

為明確對小麥產量有顯著影響的細菌類群與環境因子的關系,對細菌門和屬水平相對豐度與土壤理化性質、酶活性進行相關性分析。結果(圖3)表明,芽單胞菌門、纖維桿菌門相對豐度與銨態氮含量呈顯著正相關,纖維桿菌門相對豐度還與過氧化氫酶活性呈顯著負相關;Latescibacteria相對豐度與銨態氮含量呈極顯著負相關,與全氮含量呈顯著正相關。Dongia、Pantoea相對豐度與pH值呈顯著負相關,Chryseolinea、陶厄氏菌屬相對豐度與銨態氮含量呈極顯著負相關;豐佑菌屬相對豐度與銨態氮含量呈極顯著正相關,與全氮、有機質含量以及堿性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶活性呈顯著負相關;黏液桿菌屬相對豐度與堿性磷酸酶、過氧化氫酶活性呈顯著負相關。為明確影響細菌β-多樣性的環境因子,對NMDS組分與土壤理化性質、酶活性進行相關性分析,其中NMDS1與銨態氮含量呈顯著正相關,與全氮、有機質含量及酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶活性呈顯著負相關,NMDS2與土壤理化性質以及酶活性無顯著相關性(表6)。

圖3 細菌門和屬水平相對豐度與土壤理化性質、酶活性的相關性

表6 細菌β-多樣性與土壤理化性質、酶活性的相關性Table 6 Correlation of bacterial β-diversity with soil physicochemical properties and enzyme activities

2.5 土壤理化性質、酶活性、細菌群落與小麥產量的關系

為了更好地研究土壤理化性質、土壤酶活性、細菌多樣性、物種豐度以及小麥產量之間的關系,構建偏最小二乘路徑模型(PLS-PM,圖4a)。模型解釋了37%的小麥產量方差,模型擬合效果較好,擬合優度(GOF)為0.563。土壤理化性質(TN、SOM)和細菌物種豐度(屬水平)對小麥產量有顯著直接正向影響,酶活性(ACP、ALP、URE、CAT)對小麥產量有顯著的直接負向影響(表6)。其中,土壤理化性質也可通過顯著影響酶活性和細菌物種豐度來間接影響小麥產量。細菌多樣性和物種豐度對小麥產量表現出總的正向影響,土壤理化性質和酶活性對小麥產量表現出總的負向影響(圖4b)。

圖4a中PLS-PM路徑上的數字表示路徑系數,箭頭粗細與路徑系數大小成正比。紅色箭頭表示系數為正,藍色箭頭表示系數為負。實線表示顯著影響,虛線表示不顯著的影響。模型擬合優度為0.563。圖4b為PLS-PM標準化總效應(直接效應與間接效應的總和)。

3 討論

3.1 土壤理化性質、酶活性對小麥產量的影響

硝態氮和銨態氮是植物能夠直接吸收的主要氮素形態[20]。本研究中,小麥高產組和低產組之間土壤硝態氮含量無顯著差異,高產組土壤銨態氮含量顯著高于低產組(P<0.05),這可能與施肥有關[21]。PLS-PM表明,土壤理化性質(TN、SOM)對小麥產量具有顯著直接正向影響(圖4a)。Wu等[22]分析得出,土壤全氮和有機質含量與水稻產量顯著相關,說明土壤全氮和有機質對作物產量十分重要。此外,脲酶在氮素轉化中起著重要作用,磷酸酶可促進土壤磷素有效轉化[23],過氧化氫酶能促進土壤過氧化氫分解[24],因此土壤酶可通過促進養分循環來影響作物產量。郭書亞等[25]、楊旸等[26]研究表明,作物產量與土壤脲酶、堿性磷酸酶活性呈顯著正相關。而本研究認為,土壤酶活性對小麥產量具有顯著的直接負向影響(圖4a)。造成此結果的原因可能與部分田塊存在氮肥過量施用現象有關(調查取樣發現部分田塊出現貪青晚熟、無效分蘗多的現象)。已有研究發現,土壤酶活性與氮肥用量呈顯著正相關[27],大量施用氮肥可以增加土壤酶活性,但氮肥施用過多會引起無效分蘗增加,進而造成小麥減產[28],這可能是造成本研究酶活性對小麥產量產生負向影響的主要原因。

3.2 土壤細菌群落結構、多樣性對小麥產量的影響

土壤微生物群落結構越復雜土壤生態系統越穩定[29];較高的土壤微生物多樣性可以維持一個相對穩定和健康的土壤生態系統,有助于促進土壤養分循環[30],為作物生長發育提供充足養分。本研究發現,不同產量水平麥田土壤細菌β-多樣性差異極顯著(圖2,P<0.01)。通過PLS-PM模型分析表明細菌物種豐度對小麥產量有顯著正向影響(圖4a)。目前有關土壤細菌對作物產量的影響研究結果存在差異,如Fan等[11]通過結構方程模型分析得出土壤細菌多樣性對小麥產量有顯著正向影響;Wu等[22]認為土壤細菌多樣性以及屬水平豐度對超級稻產量影響顯著;Sun等[31]提出大豆產量與細菌豐度呈顯著正相關,與細菌多樣性無顯著相關性。土壤細菌多樣性受土壤類型、植被類型、氣候類型等諸多因素影響[32],Fan等[11]、Wu等[22]、Sun等[31]的研究結果可能就是這些因素的差異導致與本研究不同。此外,土壤細菌對環境變化十分敏感。本研究中,土壤理化性質(TN、SOM)對細菌物種豐度影響顯著(圖4a,P<0.05),細菌β-多樣性(NMDS1)與土壤全氮、有機質含量顯著相關(表6)。Tian等[33]也發現土壤全氮、有機質對細菌多樣性存在顯著影響。因此,土壤有機質、全氮是影響土壤細菌群落的重要環境因子。

3.3 影響小麥產量的土壤細菌類群

本研究結果顯示,小麥產量與裝甲菌門、芽單胞菌門、纖維桿菌門相對豐度呈顯著正相關(P<0.05),與Latescibacteria、Dadabacteria相對豐度呈顯著負相關(表5,P<0.05)。芽單胞菌門、纖維桿菌門、Latescibacteria相對豐度與銨態氮含量顯著相關(圖3)。有研究表明,裝甲菌門可促進土壤糖類降解以及參與氮循環[34, 35],芽單胞菌門能夠代謝糖類以及氨基酸聚合物[36],纖維桿菌門可促進纖維素降解[37],Latescibacteria可降解蛋白質、脂質和多糖[38],Dadabacteria可將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽,進而轉化為氨參與氮循環[39],這些細菌可能通過參與土壤碳、氮循環影響作物吸收養分,進而對作物產量產生影響。Latescibacteria相對豐度與氮肥施用量顯著相關[40]。本研究中Latescibacteria相對豐度與小麥產量呈負相關的原因可能與氮肥施用量有關。由于Dadabacteria主要存在于深達100 m的地下水中[41],目前有關其與作物產量的關系研究甚少,因此Dadabacteria相對豐度與小麥產量呈顯著負相關的原因需進一步研究。本研究還發現,小麥產量與Bryobacter、黃桿菌屬、芽單胞菌屬、豐佑菌屬、黏液桿菌屬、Dongia、Chryseolinea、Pantoea、陶厄氏菌屬、多囊菌屬、Chitinophaga等細菌屬的相對豐度顯著相關(表5,P<0.05)。Chryseolinea、陶厄氏菌屬在土壤氮循環中發揮著重要作用[42, 43]。本研究中,Chryseolinea、陶厄氏菌屬相對豐度與銨態氮含量顯著相關。豐佑菌屬通過將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽促進土壤氮循環[44],豐佑菌屬相對豐度變化與銨態氮、全氮、有機質含量顯著相關(圖3)。已有研究認為,Bryobacter、芽單胞菌屬、多囊菌屬、Chitinophaga可能在抑制土壤病原菌方面發揮作用[45-48];黃桿菌屬具有硝化能力,可參與土壤氮循環[49];黏液桿菌屬可產生胞外多糖[50];Dongia可保護植物免受熱脅迫[51];Pantoea在調節小麥根際水分含量方面發揮重要作用[52]。這些細菌可能通過影響土壤病原菌,參與碳、氮循環等途徑影響小麥生長發育,進而影響產量。本研究結果可能為實際農業生產中研發微生物菌肥提供參考。

4 結論

不同產量水平的麥田土壤細菌β-多樣性差異顯著。土壤細菌物種豐度(屬水平)對小麥產量影響顯著,土壤理化性質可通過顯著影響酶活性和細菌物種豐度,進而影響小麥產量。細菌門水平上,提高土壤芽單胞菌門、裝甲菌門、纖維桿菌門相對豐度,以及降低Latescibacteria、Dadabacteria相對豐度,有助于實現小麥增產。細菌屬水平上,提高Bryobacter、黃桿菌屬、芽單胞菌屬、豐佑菌屬、黏液桿菌屬相對豐度,以及降低Dongia、Chryseolinea、Pantoea、陶厄氏菌屬、多囊菌屬、Chitinophaga相對豐度,有利于小麥產量提高。