葡萄籽有效成分研究進展

林維晟,陳夢賜,解 田,苗志偉

(1.武夷學院生態與資源工程學院,福建 武夷山 354300;2.南開大學化學學院元素有機化學國家重點實驗室,天津 300071;3.赤峰瑞陽化工有限公司,內蒙古 赤峰 024000)

葡萄是世界上產量和消費量最大的水果之一,具有龐大的產業鏈,在世界各地均有栽培和種植,主要分布在歐洲和北美洲。我國也具有豐富的葡萄資源,種植區域主要在新疆、河北和山東等地。近年來,我國葡萄的種植面積高達約70萬hm2,年總產量達到1 200萬～1 300萬t,我國每年約有943萬t葡萄用于鮮食,約9萬t葡萄用于釀酒,剩下的做成果汁等其他產品,因而我國葡萄籽產量巨大[1]。葡萄籽是葡萄加工后產生的固體廢棄物,通常的處理方式是將其作為農業肥料或動物飼料,或者進行焚燒處理[2],不僅造成焚燒過程中環境的污染,還會造成資源浪費。

研究發現,葡萄籽中含有亞油酸、原花青素、蛋白質、粗纖維、礦物質等成分,其中含有的藥物活性物質具有抗氧化、抗衰老、降血脂、預防腫瘤和炎癥、預防神經系統疾病和緩解輻射傷害等諸多功效,具有極高的營養價值,并且在保健品、化妝品、食品添加劑等方面具有廣泛的應用。隨著綠色生態和可持續發展環保理念的盛行,如何充分利用、合理開發葡萄籽資源,避免環境污染和資源浪費,延伸葡萄籽產業鏈,提高其附加值成為人們關注的重點。

1 葡萄籽有效成分

葡萄籽中主要含有的物質包括葡萄籽油、葡萄籽多酚和葡萄籽蛋白質。

1.1 葡萄籽油

葡萄籽油是葡萄籽經過壓榨、脫水等工藝處理后得到的物質,具有獨特的果香,營養豐富,是一種優質的可食用油脂。葡萄籽油在葡萄籽中含量占比約為10%～14%,主要含有的活性成分為不飽和脂肪酸、甾醇化合物、脂溶性維生素三大類,此外還含有多羥基芪氏化合物白藜蘆醇以及18種以上氨基酸,同時含有K、Na、Ca、Fe、Zn、Mn等多種礦物元素[2]。

1.1.1不飽和脂肪酸

葡萄籽油含有的不飽和脂肪酸包括亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸,此外還含有微量的亞麻酸、月桂酸和肉豆蔻酸等物質,是評價葡萄籽油脂品質和營養價值的重要指標,具體的含量因葡萄的種類、提取技術和果實成熟度的不同而有所差異。

當前,氣相色譜法或氣相色譜-質譜法(GC-Ms)是檢測分析葡萄籽油化學成分的主要方法。GC-Ms法結合了氣相色譜法分離物質效率高和質譜法定性效果好的優勢,具有靈敏度好、準確率高的優點,適用于檢測沸點低于400 ℃的有機化合物[3]。Demirtast[4]采用氣相色譜法對七種土耳其葡萄品種葡萄籽提取物進行含量檢測,發現這幾種葡萄籽中含有的脂肪酸分別為亞油酸含量為56.38%～68.56%、油酸含量為16.45%～29.48%、棕櫚酸含量為8.19%～9.44%、硬脂酸含量為3.74%～4.98%。此外,Demirtast還在葡萄籽油中發現了花生醛酸、丙烯酸、棕櫚油酸、肉豆蔻酸和庚烷酸。劉永衡[5]對黑比諾葡萄籽油進行GC-MS檢測分析發現,黑比諾葡萄籽油含有5種酯類、5種脂肪酸和1種醛類化合物,其中,相對含量最高的是亞油酸(含量為55.36%),其次是亞油酸戊酯(含量為10.73%)、硬脂酸(含量為6.47%)。

總體而言,葡萄籽油中含有的脂肪酸和酯類化合物種類較多,并且每種脂肪酸在不同種類的葡萄籽中的含量有著較為明顯的差異,但總體上葡萄籽脂肪酸最主要的成分是亞油酸和油酸。亞油酸是人體細胞生長所必須的營養物質,與油酸均具有降低血脂等功效,與其他種類的植物油相比,葡萄籽油中亞油酸含量更高。

1.1.2脂溶性維生素

葡萄籽油中含有維生素A、D、E、K等多種物質,其中維生素E的含量最高。維生素E是生育酚、生育三烯酚等能夠顯示D-α-生育酚生物活性物質的總稱,分為α、β、γ、δ生育酚及其相應的生育三烯酚(見圖1),一般具有良好的脂溶性、熱穩定性和抗氧化性。人體自身不能合成維生素E,只能夠從植物油中獲得[6]。維生素E種類和結構見表1。

表1 維生素E種類和結構

圖1 維生素E結構

檢測維生素E的常用方法為液相色譜法。液相色譜法具有快速、分離度高、靈敏度高等優點,適用于高沸點、難揮發、穩定性差的有機化合物的檢測與分析,尤其適用于植物提取物等復雜成分的快速分離分析。Demirtas[4]采用高效液相色譜法對葡萄籽油中生育酚的異構體——生育酚和生育三烯醇進行了測定,發現葡萄籽油中生育酚的主要形式為α-生育酚、α-生育三烯醇和α-生育三烯醇,含量分別為77.33～225.40 mg/kg、137.19～264.33 mg/kg和74.79～322.18 mg/kg。

1.1.3植物甾醇

植物甾醇主要存在于水果、蔬菜、豆類、堅果等植物中,是一種含環戊并全氫化菲骨架結構的化合物(見圖2),由四個相并的環構成,此四個環分別標記編號為A環、B環、C環和D環,化合物結構上還含有三個側鏈,分別標記編號為R1、R2和R3。R1和R2通常為甲基,有時也為醛基和羥基;在C3位通常帶有一個羥基。β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇是最常見的植物甾醇。

圖2 植物甾醇結構

當前檢測植物甾醇的方法主要為氣相色譜法或氣質聯用法(GC-Ms)。目前使用這兩種方法檢測不同品種葡萄籽中植物甾醇含量較高的植物甾醇品種,結果顯示為β-谷甾醇、豆甾醇和油菜甾醇。Demirtas[4]將葡萄籽油樣品經過甲酯化處理后,使用配備了氫火焰離子化檢測儀(FID)的質譜儀檢測總甾醇含量,結果顯示在2 672～3 000 mg/kg之間,并檢測到包括β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇、谷甾醇、Δ5-阿維他醇和Δ7-阿維他醇等在內的13種甾醇組分。Verdani品種葡萄籽中的β-谷甾醇含量最高,占總甾醇含量的71.62%,其他品種葡萄籽中β-谷甾醇含量占總甾醇含量的64.19%～70.14%。Harbeoui[8]將葡萄籽油提取后,經過三甲基硅醚化處理,利用GC-Ms進行分析發現,在Merlot、Syrah、Carignan三種葡萄籽中,β-谷甾醇含量最豐富,含量為3 285.92 mg/kg,其次是豆甾醇含量為297.71～535.35 mg/kg,油菜甾醇含量為165.22～303.64 mg/kg,膽固醇只在Merlot品種的葡萄籽中存在。這些研究成果表明,葡萄籽中含有豐富的植物甾醇品種,這也是葡萄籽具有降低膽固醇、抗氧化、抗炎抗菌、促進細胞生長等生物功能的物質基礎。

1.2 植物多酚

多酚類物質廣泛存在于各種植物中,是植物體內復雜的酚類次生代謝產物。葡萄籽多酚主要包括兒茶素類和原花青素類兩種類型,兒茶素類葡萄籽多酚分為兒茶素、表兒茶素和沒食子酸(見圖3),是葡萄籽多酚中的單聚體。原花青素葡萄籽多酚[9]由多個不同的兒茶素類結構經過聚合作用形成,平均聚合度在2.4～16.7之間,分子結構末端以兒茶素結構為主,中間延伸鏈聚合單位以表兒茶素為主,其二聚體有8種結構形式(見圖4),分別命名為B1-B8。原花青素含有多個羥基,具有較強極性,易被氧化或與金屬離子發生絡合,因聚合度和聚合結構的不同而表現出不同的化學性質和生物活性。

圖3 兒茶素、表兒茶素和沒食子酸結構

圖4 原花青素二聚體結構

葡萄籽多酚的鑒定方法主要是使用液相色譜與質譜聯用法(LC-Ms)。楊代曉[10]利用LC-Ms法對葡萄籽提取物中的多酚化合物進行測定,證實了葡萄籽提取物中多酚組分主要為沒食子酸、兒茶素、表兒茶素三種單體酚和原花青素低聚體,其中,原花青素低聚體僅含二聚單酯和三聚單酯兩種成酯型聚合體。未檢測到4～5聚合度的成酯型聚合體,可以推測:隨著聚合度的增加,原花青素成酯的難度也隨之增加。

1.3 葡萄籽蛋白質和氨基酸

葡萄籽榨油脫酚后的餅粕中,蛋白質含量約為13%～16%,含有清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白等多種蛋白質,并且含有常見的天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸等17種氨基酸和酪氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸等人體所需的8種氨基酸,葡萄籽中氨基酸含量要高于大豆蛋白中的氨基酸含量,其中谷氨酸和天冬氨酸的含量較高[11]。將葡萄籽蛋白水解,可獲得對人體有特殊生理功效且更易被人體吸收的小分子多肽。測定葡萄籽中蛋白質的方法有凱式定氮法、分光光度法、燃燒法、雙縮脲法和Folin酚試劑法等方法。其中,凱氏定氮法是最主要的方法,其測定結果相對準確、重現性好、靈敏度高、干擾少,但是測定時間較長且試劑消耗量大[12]。

除上述有效成分以外,葡萄籽還含有角鯊烯、白藜蘆醇、類胡蘿卜素和多種礦物質。葡萄籽中具體的活性成分及其含量受到葡萄品種、種植的土壤環境和氣候條件的影響,另外,提取方法的不同和檢測儀器也會對檢測結果造成一定影響。

2 葡萄籽有效成分的功效

2.1 抗氧化延緩衰老

人體新陳代謝過程中會生成能夠引起人體脂質過氧化、生物膜損傷、膠原蛋白交聯、產生細胞凋亡活性自由基,造成人體衰老和病變。人體衰老時,組織器官抵御疾病的能力減弱,人體內氧化和抗氧化能力失衡,又轉而引起自由基堆積,進一步加速病變。Harbeouis[8]對Merlot、Syrah、Carignan三種葡萄提取物的萜類化合物、植物甾醇和生育酚進行了體外自由基清除實驗,在達到清除一半自由基的效果時,三種葡萄籽油提取物作為抑制劑的濃度(IC50值)均低于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)抗氧化劑,說明它們的抗氧化活性超過了BHT,其中Carignan葡萄籽油的抗自由基活性最高。上述研究成果說明,葡萄籽提取物中由于含有多酚、植物甾醇、維生素等多種天然抗氧話活性成分,可以幫助清除人體內過量自由基,從而具有維持體內氧化代謝平衡的效果,是一種天然的植物抗氧化藥物。

2.2 降血脂改善肥胖

高脂血癥是血液循環中以高甘油三酯或高膽固醇為特征的代謝疾病。葡萄籽提取物具有降低血脂、防止血栓生成、促進血液循環的效果,與降低心血管疾病風險密切相關。Cruz[13]給予大鼠高脂肪和高蔗糖飲食,同時給實驗組的飲食加入原花青素,發現服用葡萄籽原花青素的大鼠能夠有效降低體重、總脂肪含量和肝脂肪變性程度,改善高熱量飲食引起的代謝混亂。Mokhtar[14]發現在高膽固醇飼料中添加葡萄籽提取物(GSO),能夠顯著降低大鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TRIG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和極低密度脂蛋白(VLDL)水平,并顯著提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平,提高血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)含量,以提高肝功能水平,同時能夠降低血清中丙二醛(MDA)含量,提高血清中胱甘肽S-轉移酶(GST)含量,使大鼠的心臟和主動脈功能增強。表2描述了分別服用基礎飲食和高膽固醇飲食8周后大鼠生理指標的結果,以及服用了加入4%葡萄籽提取物的基礎飲食、服用了分別加入2%和4%葡萄籽提取物的高膽固醇飲食8周后大鼠生理指標的結果。

由于葡萄籽提取物中含有較多游離脂肪酸,如亞油酸等具有參與刺激人體細胞生長、調節血脂成分、提高抗氧化活性成分含量的功能,因此能夠降低高熱量飲食導致的肥胖程度,并促進生物體脂肪消耗和熱量代謝,調節生物體膽固醇、相關蛋白和酶水平的能力,從而達到增強生物體心血管功能的效果。

2.3 抗癌癥和腫瘤疾病

癌癥和腫瘤是危害人體健康的惡性疾病之一,而葡萄籽提取物的活性成分能夠通過調節腫瘤細胞及其下游靶點,有效作用于人體內細胞相關信號通路的表達,實現抑制癌細胞增殖的效果。例如,張麗明[15]通過網絡藥理學的方法,預測了葡萄籽油抗癌和抗腫瘤作用的關鍵靶點是信號轉導子和轉錄激活子(STAT3)、絲裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)等與腫瘤產生密切相關的生物酶,這些關鍵靶點通過調節酶結合等生物學功能,參與大腸癌、胰腺癌等癌癥通路的調控來治療癌癥和腫瘤。Mao[16]首次研究證實葡萄籽原花青素提取物能夠顯著降低肺部腫瘤細胞中miR-19a和miR-19b的表達,增加胰島素生長因子Ⅱ受體(IGF-2R)、磷酸酶和緊張蛋白同源物(PTEN)的mRNA和蛋白水平。此外,花青素提取物顯著增加了A549細胞中的PTEN活性,降低了肺部致癌因子AKT的磷酸化程度。

2.4 抗炎癥

全球死亡率的增加與慢性疾病的發展有關,各種慢性疾病通常伴隨著炎癥的發生,攝入具有抗炎功能的營養物質將有利于治療慢性疾病。葡萄籽具有良好的抗炎活性,這主要與其含有不飽和脂肪酸、維生素E、酚類物質和甾醇類相關。Tanideh[17]等人經過實驗研究表明,在關節內注射或者口服葡萄籽油對骨關節炎有良好的治療效果,用葡萄籽油進行治療的小鼠關節表面、基質、細胞分布、細胞群活力、軟骨鈣化和軟骨下骨的病理評估均優于對照組。

2.5 改善神經疾病

老年癡呆和帕金森綜合癥均為神經退行性疾病,以老年人患病居多。老年癡呆表現為認知能力下降、記憶喪失和日常行動能力下降。帕金森綜合癥在病理上表現為腦神經炎斑塊和神經纖維纏結導致神經突觸的結構和功能受損,Tau蛋白進行沉積、神經元被破壞而最終導致病癥。葡萄籽提取物則可作為一種能夠有效改善老年癡呆和帕金森等神經退行性疾病的神經保護劑,因葡萄籽中含有大量酚類化合物等抗氧化活性成分,而對多巴胺能神經元的存活產生積極影響,并緩解因氧化應激引起的阿爾茲海默癥,能夠有效預防老年癡呆。

Youssef[18]使用能夠誘導氧化損傷的神經毒素6-羥多巴胺(6-OHDA)對小鼠中腦多巴胺能細胞進行處理,模擬帕金森病中多巴胺能神經元的退化,證實原花青素通過抑制炎癥發生、減少活性氧(ROS)水平和減少細胞凋亡,能夠有效保護多巴胺能神經元免受6-OHDA的毒害,提高細胞多巴胺能神經元的存活率。Berahmand[19]經實驗證實,向大鼠注射葡萄籽提取物可顯著提高大鼠的空間記憶能力、乙酰膽堿水平和細胞活力,且治療效果與膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊相當。

2.6 緩解輻射損傷

輻射能夠導致人體內生物分子的化學鍵發生斷裂,引起人體DNA分子損傷和蛋白質的破壞,進而引起體內組織細胞的突變,引發人體組織和器官的損傷,造成代謝等功能紊亂,對人體健康造成巨大傷害。而葡萄籽提取物中的有效成分能夠通過幫助清除生命體內因受輻射而產生的過多自由基,并調節相關酶的水平等來緩解輻射對生命體造成的損傷,提高受傷細胞的活力。Ismail[20]發現口服CCl4并經γ射線輻射會對大鼠造成神經系統損傷等危害,但是口服葡萄籽油能提高大鼠體內抗氧化酶的活力,下調黃嘌呤氧化酶(XO)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)等基因的表達,對大鼠神經起到保護作用。Yarovaya[21]經過實驗發現,在0.10～31.25 μg/mL范圍內,葡萄籽提取物能呈劑量依賴性地顯著增加成纖維細胞活力,活力值最高可達132%。經過25 μg/mL濃度葡萄籽提取物處理成纖維細胞后,可使細胞存活率提高68%。

3 葡萄籽的開發和應用

葡萄籽營養價值高,對人體無毒副作用,不僅可以提取葡萄籽油作為食用油,而且可以開發成食品添加劑、保健品、化妝品等功能性產品,另外在生物油料、醫用高分子材料領域也具有極高的利用價值。

3.1 作為牲畜及水產養殖飼料

葡萄籽中含有蛋白質、脂肪和多種無機元素等營養物質,是良好的動物飼料,同時葡萄籽成本低廉,加工處理方便,能夠作為補充成分用于添加至牲畜、家禽和水產生物飼料中的添加劑,可以調節生物體內生理代謝平衡,從而改善動物的生長狀況,有效促進畜牧業和養殖業的發展。Farahat等[22]將葡萄籽提取物作為肉雞飼料補充劑,與用添加丁基羥基甲苯抗氧化劑飼料喂養的肉雞相比,經過添加該飼料補充劑喂養的肉雞,其生長情況、存活率、總脂質和高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇含量均優于前者,同時能夠使肉雞體內膽固醇密度降低、病毒抗體含量增加。Arslan等[23]研究發現,在飼料中添加1 000 mg/kg葡萄籽油能夠顯著提高虹鱒體內的抗氧化酶活性,并提高幼魚的存活率和脂肪含量,使其更加健康。

3.2 作為保健食品

葡萄籽油營養價值全面,具有特殊果香,在高溫烹飪過程中也不產生油煙和有害物質,可作為傳統食用油的替代品。李哲[24]將葡萄籽和亞麻籽油按照5∶95的比率制成調和油,改變了單一植物油營養和口味單調的弊端。葡萄籽中蛋白質因其特殊的性質被用來制成蛋白質飲品,鄒圣東[25]發明葡萄籽蛋白飲料,擁有蛋白飲料和果仁特有的醇香,口感細膩。這些應用表明,葡萄籽被應用于多種食品中,不僅有效地改善了食物的風味,還能夠增加產品的營養成分,促進人體的健康。

3.3 作為食品添加劑

向蛋糕、酸奶、面粉和肉制品等食品中加入葡萄籽提取物可以改善食物的風味、口感和質地,同時葡萄籽提取物中因含有大量抗氧化活性成分并具有顯著的抗菌性能,加入食品中可以延緩食品變質、抑制細菌滋生,延長食品的保質期。解春艷[26]將葡萄籽蛋白作為膨松劑用于制作蛋糕,可以中和雞蛋的蛋腥味,同時使營養更加豐富、風味更加獨特。Varedesara[27]在酸奶中添加葡萄籽蛋白質水解物,提高了酸奶的pH值和黏稠度,使干酪乳桿菌活力增強,讓酸奶具有更好的口感。Chen等[28]向小麥面粉中加入少量的葡萄籽粉,能夠提高面條的口感和勁道程度。Zhou等[29]經過研究發現,在西式煙熏香腸中加入葡萄籽提取物,能夠降低香腸的咀嚼性,并可顯著降低香腸內的防腐劑亞硝酸鹽含量。Xiong等[30]研究發現,在1%殼聚糖與3%明膠體系中加入0.5%的葡萄籽提取物,能夠進一步提高豬肉抗菌和抗氧化作用,延長冷藏保鮮時間。

3.4 作為化妝美容產品

葡萄籽油油質輕薄、易于吸收、安全無刺激,可用于制作口紅、潤膚霜和按摩油,其抗氧化性有助于延緩皮膚的衰老,是天然的護膚劑。林童[31]將葡萄籽油制作成可食用性口紅,其稠度和延展性等和市售口紅無顯著差異。周曉微[32]以葡萄籽為原料制備防曬霜,能夠有效緩解紫外線照射引起的皮膚老化。曹燕亞[33]用藏紅花、蘇木、枸杞、何首烏和葡萄籽油為原料制備按摩油,該按摩油具有良好的保濕效果,能夠提高皮膚彈性,具有一定的抗衰老作用。李雪峰[34]在香波里添加葡萄籽油,使得洗發香波具有更強的保濕性和抗氧化活性。這些新型化妝品的開發不僅豐富了葡萄籽油的應用領域,而且為化妝品升級換代提供了有效保證。

3.5 用于制作功能性薄膜

葡萄籽提取物可用于制作食品包裝,與傳統包裝相比,加入葡萄籽提取物的可食用薄膜涂層能夠直接接觸食品表面,同時提升了薄膜的親水性、滲透性、彈性、抗菌抗病毒等相關性能,增大了包裝薄膜的適用范圍。Marudova[35]研制了由羥丙基甲基纖維素和葡萄籽油制備而成的新型生物基多組分可食用性膜,葡萄籽油的加入增加了薄膜的親水性,提高了水蒸汽的滲透性,降低了薄膜的吸濕率,提升了薄膜變形、發生斷裂的上限,使其更富有韌性,此薄膜可作為水果的可食用涂層使用。Roy[36]將氧化鋅納米棒和葡萄籽提取物用于纖維素納米纖維復合薄膜的制備,葡萄籽提取物的添加能夠改善抗紫外線和蒸汽阻隔性能,增加薄膜抗菌和抗氧化能力。Fabra[37]在海藻酸鹽薄膜中添加葡萄籽提取物作為活性劑,使薄膜具備抗小鼠諾如病毒和甲型肝炎病毒的生物活性。

3.6 作為新型燃料油

近年來,石油和煤炭等不可再生能源的使用成本逐漸增加,在舊能源終將枯竭的危機意識下,尋找新型能源成為全球不可阻擋的趨勢。葡萄籽油作為從植物中提取的油脂受到新型燃料油領域的廣泛關注。Sridhar[38]研究發現,在柴油和葡萄籽油中分別混合20 mg/L濃度的氧化鋁添加劑后,兩者的制動熱效率幾乎相同,并且在同樣都與20 mg/L濃度氧化鈰混合的情況下,相比于柴油,葡萄籽油一氧化碳的排放量明顯減少,但是氮氧化物排放量高于柴油。因此,葡萄籽油和柴油都具有彼此的優劣勢,在柴油不可再生的特性下,擁有較好制動熱效率的同時又可再生的葡萄籽油,具有更大的環境保護意義,增加對葡萄籽油的開發和使用,將有助于節約資源、促進綠色環保。

3.7 用于制備醫用材料

葡萄籽提取物還被應用于醫用材料領域,例如被用于制作止血氣凝膠和骨組織再生支架,能夠對人體傷口治愈和組織的再生起到良好的促進效果,同時還可以被添加至抗腫瘤藥物中提高治療效果。Figueroa等[39]以氧化石墨烯和殼聚糖為原料制備了止血氣凝膠,添加葡萄籽提取物后,可提高氣凝膠的粗糙度和硬度。Chao等[40]利用葡萄籽油、蜂蜜和蜂膠制作模擬骨骼天然結構的支架,可用于骨組織再生。該支架具有熱穩定性高、表面粗糙度低、對人體細胞無毒且與血液能更好相容等特點。Lacatusu等[41]以葡萄籽油和月桂葉油為原料制備了脂質納米載體,具有較好的氧自由基清除作用,能破壞腫瘤細胞,顯著提高抗腫瘤藥物在臨床應用中的療效。

4 葡萄籽油和葡萄籽有效成分的提取方法

目前,葡萄籽油和其他有效成分的提取方法主要有機械壓榨法、溶劑浸提法、超臨界二氧化碳萃取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和水酶法。其中,葡萄籽蛋白質的主要提取方法是堿溶酸沉法、鹽析法、酸熱法和酶解法。不同提取方法對葡萄籽提取物活性成分的品質和作用效果具有不同影響。

4.1 機械壓榨法

機械壓榨法分為冷榨法和熱榨法,主要用于獲取葡萄籽油。冷榨法在工藝流程中不易引起天然產物的分解,使得到的油脂較為純正,但是該方法需要在前期涉及除雜、粉碎、軟化、壓榨、過濾等多步處理工藝,耗能大且出油率低。相比而言,熱榨法出油率更高,但是營養物質經過高溫處理之后損失較大[42]。

Juhaimi[43]用冷榨法獲取葡萄籽油,得到亞油酸的含量占所有提取成分質量的比例為59.61%～72.13%,α-生育三烯醇含量為13.21～34.71 mg/100g,兒茶素含量為427.80～847.14 mg/kg。任繼波[42]利用液壓熱榨法制備葡萄籽油,單批投料量為40 kg、壓榨壓力為40 MPa、物料粉碎度為60目,炸膛溫度為50 ℃條件下,壓榨60 min,蒸料40 min,葡萄籽出油率為12.2%,達到最高。對葡萄籽出油率的影響因素從大到小依次是物料粉碎度、炸膛溫度和蒸料時間。

4.2 溶劑浸提法

傳統溶劑浸提法使用索氏提取裝置和有機溶劑進行葡萄籽有效成分提取,該方法提取率高且不破壞天然產物的結構,但是可能會造成有機溶劑的殘留難以除去,使用深層共晶溶劑提取則能夠提高該方法的綠色環保性。Dabetic[44]用含檸檬酸或葡萄糖的氯化膽堿深層共晶溶劑提取葡萄籽多酚,該方法的提取效率高,所得提取物的抗氧化活性優于用酸化醇水溶液作為溶劑進行提取的方法。

4.3 酶解法

酶解法利用特定酶分解植物細胞與組織,加速細胞中成分的釋放并溶解到溶劑中。此方法條件溫和、安全無毒、工藝步驟少、節約成本,提取效率高。馬波[45]使用多粘類芽孢桿菌液體發酵技術得到富含果膠酶的發酵液,酶解葡萄籽后提取原花青素,粘類芽孢桿菌發酵液酶活性為313 U/mL,料液比為30 g/L,在pH值為9、溫度為45 ℃的條件下,提取70 min,可得0.033 9 mg/(1 000 mg原料)原花青素提取率,提取率遠大于單用水浸提的0.64%。李丹丹[46]用纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和胰蛋白酶以2∶1∶2∶1比例配制而成的復合酶,在體系pH值為6.5條件下,按照1∶9的料液比酶解葡萄籽9 h,得到葡萄籽油的最佳提取量為99.47 mg/g,蛋白質最佳提取量為74.86 mg/g,蛋白質提取量影響因素按從大到小依次是pH值、料液比、酶配比和酶解時間。

4.4 超臨界二氧化碳萃取法

該方法利用超臨界二氧化碳溶解萃取物,再通過調節壓力或者溫度等條件使活性組分析出達到分離目的。二氧化碳具有惰性無毒、傳遞性質好、非極性親脂等特點,該法提取條件溫和、安全環保、提取效率高,可回收溶劑。Duba[47]經過實驗發現,在恒溫條件下,葡萄籽油在超臨界二氧化碳中的溶解度隨壓力的增加而增加。在不同壓力條件下,溶解度隨溫度的變化情況則不同,在20 MPa壓力條件下時,溶解度隨著溫度的升高而降低,在大于35 MPa的高壓條件下,溶解度隨溫度的增加而增加。Porto[48]采用兩步提取法,先用超臨界二氧化碳去除葡萄籽中的非極性成分,再向超臨界二氧化碳中加入共溶劑,從葡萄籽中回收多酚,經過研究發現,在8 MPa壓力下,當二氧化碳流量為6 kg/h,且加入20%的乙醇-水混合物作共溶劑,100 g葡萄籽原料中能得到7 132 mg總多酚。

4.5 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法的工作原理是基于空化現象,在超聲處理中,因負壓產生氣泡,導致壓力和溫度升高,氣泡在靠近固體表面附近時發生破裂坍塌,由此產生的“沖擊波”會破壞細胞壁,有利于溶劑滲透到植物材料中,并允許生物活性化合物的釋放、增強細胞膜的傳質,具有操作簡便快捷、提取率高、不破壞有效成分的優點[49]。尹佳[50]通過響應面法優化提取工藝,得出當原料葡萄籽和溶劑乙醇混合時的固液比為1 g∶12.42 mL時,在超聲頻率為81.42 kHz和溫度為33 ℃條件下,超聲提取73.97 min為最優工藝條件,此時葡萄籽油脂的得率為20.26%。Vural[49]發現在溶劑乙醇濃度為61.76%、原料葡萄籽和溶劑乙醇溶液混合時的固液比為1 g∶30 mL,萃取溫度為50 ℃條件下,萃取20 min為最佳條件,可得到總酚25.96 ± 0.70 mg/g,抗氧化活性成分93.78% ± 0.42 g。溫度是影響多酚提取速率的關鍵因素,提升溫度可以降低物質的表面張力和黏度,提高多酚的擴散系數和溶解度,但超過50 ℃酚類物質會因變性而影響提取率。

4.6 微波輔助提取法

微波輔助提取法利用高頻電磁波使植物細胞破裂,并使有效物質在電磁場作用下加速擴散,具有環保、產物純度高、萃取時間短和溶劑選擇性高的特點。Chen[51]優化微波輔助提取法后的條件用濃度為94%乙醇為溶劑,在170 ℃下微波振蕩55 min,與不經過微波輔助處理相比,提取的單體兒茶素增加3.9倍,原花青增加5.5倍,且該法提取物比常規方法提取物具有更高的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性。

4.7 堿溶酸沉法

堿溶酸沉法是一種利用混合物中各組分酸堿性差異而進行分離提取的方法,常用于提取蛋白質成分。吳芳[52]用響應面法優化蛋白質提取工藝,發現溫度對提取率的影響最大,隨著體系內pH值的升高,蛋白質沉淀量呈先增加后減少的趨勢,即在溶液中的殘留率先減少后增加;在45 ℃、料液比1∶25(g/mL)條件下,用0.001 mol/L的NaOH溶液浸提40 min后,將溶液pH值調成3.8時,得到的蛋白質沉淀物最多,蛋白質最高提取量為9.75 mg/g(見圖5)。

圖5 溶液中蛋白質的殘留率隨溶液pH值變化的情況

4.8 酸熱法

酸熱法是首先通過鹽酸浸泡破壞植物的細胞壁,然后利用有機溶劑對活性成分進行提取的方法。呂慧威[53]經洗凈、烘干、粉碎、鹽酸浸泡、加石油醚振蕩、萃取、干燥、濃縮等步驟提取出純度較高的葡萄籽油,隨著酸度的增加,提油率先增加后降低,在鹽酸濃度為4.09 mol/L時提油率達到最大。提取最佳條件為料液比1∶6,酸熱時間59.37 min,酸熱溫度75.85 ℃,提油率為26%。

4.9 鹽析法

蛋白質在水中的溶解度由蛋白質分子上的親水基團與水形成水化膜的程度,以及蛋白質分子帶電荷的情況這兩種因素決定。中性鹽加入蛋白質溶液后,鹽對水的親和力大于蛋白質,從而使蛋白質分子周圍的水化膜減弱乃至消失,同時鹽中和了蛋白質表面電荷,使蛋白質在水中的溶解度降低,從而使蛋白質析出。鹽析法即是利用上述原理獲得蛋白質。溫小娟[54]研究發現,在葡萄籽粒粉碎粒度為60目、料液比為1∶20,提取溫度為40 ℃條件下,用濃度為1.0 mol/L的NaCl溶液浸提葡萄籽40 min烏海產葡萄籽樣品和銀川產葡萄籽樣品的蛋白質,提取率分別為64.46%和49.42%,影響樣品蛋白浸提量的因素為溫度、NaCl濃度、料液比和浸提時間。

上述各種提取方法均可以實現葡萄籽油和葡萄籽有效成分的提取和分離,其中,溶劑提取法多采用甲醇、乙醇、丙酮等極性較大的溶劑,提取時間較長,效率較低,而且會有有機溶劑殘留,造成對產品的污染。超聲、微波、超臨界二氧化碳萃取等新技術提高了提取效率,而且無溶劑殘留,活性成分和熱不穩定成分不容易被破壞,但是超臨界提取所需設備價格昂貴,生產成本高,目前還難以實現大規模工業化生產。再比如堿溶酸沉法、酸熱法、鹽析法等提取方法,同樣存在操作步驟繁瑣、提取效率不穩定等需要解決的實際問題,為此仍需研究開發更加高效和穩定的葡萄籽油和葡萄籽有效成分提取方法。

5 總結與展望

隨著我國葡萄產業的日益發展和壯大,生產中必定會產生大量的葡萄籽。葡萄籽中的營養成分包含不飽和脂肪酸、植物甾醇、維生素、原花青素等植物多酚,及具有特殊生物活性的葡萄籽蛋白質,且具有抗氧化、抗衰老、降血脂、預防腫瘤和炎癥、預防神經系統疾病、緩解輻射損傷等藥理功效,可廣泛應用于食品、保健藥品、美容化妝類產品、食品添加劑等領域。未來,圍繞葡萄籽的綜合利用將從以下3方面開展工作:①發展高效提取分離技術,進一步提高葡萄籽有效成分的提取率;②加大對葡萄籽有效成分生物活性和藥用功能研究,擴大葡萄籽有效成分應用領域;③創新葡萄籽有效成分加工技術,提高產品附加值生產高端葡萄籽下游產品。未來隨著針對葡萄籽有效成分研究工作的不斷深入,我國葡萄產業發展一定會更加興旺發達。