師毅君,王康君,郭明明,張廣旭,譚一羅,李曉峰,何茂盛,徐大勇,樊繼偉
(連云港市農業科學院,江蘇 連云港 222000)
甘油-3-磷酸?;D移酶(glycerol-3-phosph-ateacyltransferase, GPAT)是三酰甘油(Triacylglycerol, TAG)生物合成的關鍵酶,催化并限制其第一步反應的速度,是細胞膜、表皮蠟質、種內油脂等重要組分,對植物生長發育及抗逆能力具有重要影響[1]。具體而言,GPATs分為兩類:一類為sn-1型GPAT,負責將脂肪?;鶑孽;??;d體蛋白(-acyl-ACP)或?;o酶A(-acyl-CoA)向sn-1轉移;另一類屬于sn-2型GPAT,具有磷酸酶活性[2-4]。目前,已在多種植物中鑒定到GPAT基因家族成員,如擬南芥[5]、棉花[6]、玉米[7]、青稞[8]、大麥[9-10]等,其中,擬南芥GPAT家族包含10個成員[5],ATS1和AtGPAT9 屬于sn-1型GPAT,AtGPAT1~8 為陸生植物特有的sn-2型GPAT,這些酶參與磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol, PG)[11-12]、植物膜脂、植物油脂、角質和軟木脂[4,13]等多種脂質的生物合成[14]。研究發現,GPAT在植物響應冷、熱等脅迫中起著關鍵作用[15],例如,在不同抗冷性水稻中,GPAT核苷酸和推導氨基酸序列差異與抗冷性差異正相關[16]。番茄LeGPAT基因表達受低溫誘導,過表達可以提高甘油-3-磷酸?;D移酶含量而增強植株的耐冷性,抑制表達則可以增強耐熱性并影響番茄的育性[17]。百合LpGPAT基因也被證明與低溫脅迫有關[18]。在水稻品種J9516的葉綠體類囊體膜磷脂分子中,不飽和PG含量較高的植株能抵御低溫誘導的光抑制作用[16]。反之,GPAT酶通過提高質體中類囊體膜脂的飽和度來增加植物對高溫的耐受性。顏坤等[19-21]研究發現,高溫脅迫下,轉入GPAT基因的煙草類囊體膜上脂質飽和度增加,其光合速率較野生型的變化慢。
四倍體小麥分為硬粒小麥和野生二粒小麥,是栽培小麥的近緣物種,近年來,隨著其基因組測序的完成,已逐漸成為新的研究熱點,許多其他關于GPAT基因及其功能的類似研究已經被報道[14,22]。然而,人們對該基因家族在四倍體小麥中的作用知之甚少,特別是它們在冷或熱脅迫中的潛在作用。為了解四倍體小麥中GPAT基因家族進化及其功能,本研究通過比較基因組學系統分析硬粒小麥和野生二粒小麥GPAT基因家族的結構特性,進化關系等內容,為深入探索麥類作物GPAT基因家族的功能提供更多的信息。
從植物參考基因組數據庫EnsemblPlants(https://plants.ensembl.org/index.html)下載硬粒小麥、野生二粒小麥以及擬南芥的基因組數據,包括基因組序列文件、注釋文件、蛋白序列文件。利用從Uniportswissport(https://www.uniprot.org/)下載擬南芥GPAT蛋白序列,在Pfam網站(http://pfam-legacy.xfam.org/)下載GPAT蛋白保守結構域(PF01553)的隱馬爾可夫模型,使用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)軟件[23]在硬粒小麥和野生二粒小麥蛋白質庫進行BLASTP和HMMER搜索,得到包含結構域模型的蛋白序列。將HMMER和BLASTP的結果去冗余后,將序列提交到NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)數據庫對其結構域進行鑒定,保留包含有完整結構域的基因。通過網站ExPASY(https://www.expasy.org/)來分析硬粒小麥和野生二粒小麥GPAT基因家族成員分子量、等電點等理化性質,并用網站WoLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)來預測其家族成員的亞細胞定位信息。
使用軟件MEGA 11.0軟件內置muscle對硬粒小麥、野生二粒小麥、擬南芥的所有GPAT基因進行多序列對比分析,使用鄰接法Neighbor-joiningTree構建GPAT基因家族系統進化樹,Bootstrap值取1000。通過網站ITOL(https://itol.embl.de/)進行美化。
硬粒小麥、野生二粒小麥和擬南芥GPAT基因結構分析使用TBtools軟件中Visualize Gene Structure(Basic)工具,根據其基因組注釋gff3文件提取內含子和外顯子信息;通過網站MEME(http://memesuite.org/)預測蛋白的保守結構域(Motif設為10);通過網站NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)確認GPAT家族成員的保守結構域。使用TBtools軟件的GeneStructureView工具將上述結果進行合成及可視化。
根據硬粒小麥、野生二粒小麥和擬南芥全基因組及注釋文件,使用TBtools對其進行可視化的共線性關系分析,以此發現三者GPAT基因家族間的同源基因對。
利用擬南芥GPAT蛋白序列,在硬粒小麥和野生二粒小麥蛋白質庫進行BLASTP和HMMER搜索鑒定,最終確定硬粒小麥和野生二粒小麥各有33個GPAT基因家族成員。由表1可知,GPATs蛋白質成員的氨基酸長度為149(TdGPAT19)~589(TtGPAT1),分子量為16.22 kDa(TdGPAT19)~62.76 kDa(TtGPAT1),等電點為5.92(TdGPAT5)~11.39(TdGPAT7),但絕大多數蛋白(56個)的pI大于8,說明大多數GPATs蛋白富含堿性氨基酸,屬堿性蛋白。亞細胞定位結果顯示:有40.9%成員定位在質膜,25.7%成員定位在葉綠體,12.1%成員定位在內質網,10.6%成員定位在細胞液,6%成員定位在線粒體,1.5%成員定位在細胞壁,1.5%成員定位在細胞核,1.5%成員定位在液泡,結果暗示GPATs蛋白成員參與不同過程。
為解讀GPAT基因家族成員進化關系,以擬南芥、硬粒小麥和野生二粒小麥構建系統發育樹(圖1),將76個GPAT基因家族成員大致劃分為3類:其中GroupⅠ(5個)約占6.57%,GroupⅡ(16個)約占21.05%,GroupⅢ(55個)約占72.36%,Group Ⅲ中又分為3個小類(Ⅲ-a有21個、Ⅲ-b有8個、Ⅲ-c有26個),3個植物GPAT基因家族成員在3個大類中的分布見表2。
圖1 擬南芥、硬粒小麥、野生二粒小麥GPAT基因家族進化分析
表2 GPAT基因家族成員在系統發育樹的分布情況
為了進一步研究GPAT蛋白質的結構域,以此推測相同結構域可能具備的功能,利用MEME在線軟件對GPAT成員蛋白序列進行分析,如圖2A所示,同一分組的大多數家族成員具有相似的Motif構成,GroupⅠ和GroupⅡ的Motif缺失較為嚴重,而GroupⅢ幾乎涵蓋所有Motif,所有家族成員均含有Motif-2,推測該Motif可能具有特別的生物學功能。其中,Group Ⅰ除硬粒小麥GPAT蛋白成員外其他成員僅含有Motif-2。GroupⅡ所有GPAT蛋白成員均含有Motif-1、Motif-2,部分GPAT蛋白成員有Motif-3、Motif-5、Motif-7、Motif-9。
圖2 GPAT蛋白質保守基序(A)、保守蛋白結構功能域(B)和基因結構分析(C)
同時,從圖2-B可知,GPAT家族成員中共檢測到7個保守蛋白結構功能域,其分組與系統發育樹的聚類分析相似,在保守結構域方面進一步支持了GPAT基因家族分類。其中,GroupⅠ家族成員蛋白結構域較為保守,在組內成員中均發現PLN02349結構域;GroupⅡ組內成員保守結構域多樣性較高,鑒定到PLN02833、LPLAT_LPCAT1-like、LPLAT結構域;GroupⅢ中發現PLN02177、PLN02499、PLN02588結構域。
硬粒小麥與野生二粒小麥GPAT基因家族結構大致可以分為2類,這與大麥和青稞在基因結構方面表現相似[8,10]。如圖2C所示,GroupⅠ和GroupⅡ內基因的內含子較多,大多在7~12個之間,硬粒小麥中TtGPAT2、TtGPAT6、TtGPAT30、TtGPAT32,野生二粒小麥中TdGPAT2、TdGPAT11、TdGPAT31、TdGPAT32的內含子最多,由12個內含子組成;GroupⅢ內的基因結構較為簡單,插入的內含子較少,大部分在1~3個之間。
對擬南芥、硬粒小麥和野生二粒小麥進行共線性分析,結果表明:硬粒小麥和擬南芥基因組中僅有2個基因存在共線性關系,硬粒小麥和野生二粒小麥的共線性基因對數目為66個,說明四倍體小麥組間關系較為親密(圖3)。
圖3 GPAT基因在擬南芥、硬粒小麥和野生二粒小麥間的共線性分析
本研究從硬粒小麥和野生二粒小麥中各鑒定到33個小麥GPAT基因家族成員,在數量上超過了大麥、青稞等其他禾本科作物。理化性質結果表明:GPAT成員氨基酸長度為149(TdGPAT19)~589(TtGPAT1),分子量為16.22 kDa(TdGPAT19)~62.76 kDa(TtGPAT1),等電點為5.92(TdGPAT5)~11.39(TdGPAT7),但絕大多數蛋白(56個)的pI大于8,說明大多數GPATs蛋白富含堿性氨基酸,這與其他物種相似。
系統進化分析表明,四倍體小麥GPAT家族成員可分為3個分支,與擬南芥、玉米、大麥等其他物種研究結果相似[6-7,10],硬粒小麥和野生二粒小麥GPAT家族成員分布在3個分支的基因數量幾乎一致,表明四倍體小麥組間相似性較高。結合基因結構分析,GroupⅠ和GroupⅡ內大部分成員含7~12個內含子,GroupⅢ內大部分成員僅含1~3個內含子,表明相同亞家族中GPAT基因有著相似的基因結構,且其進化進程和基因功能也具有一定的相似性。共線性分析顯示,硬粒小麥基因與擬南芥的共線性較低,但是與野生二粒小麥的共線性關系較高,說明四倍體小麥之間親緣關系更近。