自感染性腹瀉樣品中分離的副溶血性弧菌菌株特征分析

王彧超，許海燕，靳秀秀，張 鑫，黃愛龍

(江蘇省南通市疾病預防控制中心微生物檢驗科，南通 226007)

據報道[1]，食源性疾病的發病率居各類疾病總發病率的第二位。2013 年，江蘇省構建起覆蓋全省所有行政區域內縣級以上醫院作為監測醫院的食源性疾病監測與溯源系統，以提高食源性疾病患者和食源性疾病事件早期監測能力[2]。副溶血性弧菌是一種常見的食源性致病菌，據估計，我國每年因副溶血性弧菌感染所致的食源性疾病發病高達495.1 萬人次[3]?，F通過回顧南通市區2018—2022 年食源性疾病系統監測資料，分析3 家哨點醫院感染性腹瀉患者糞便樣品的監測結果，總結副溶血性弧菌的流行情況。

1 材料和方法

1.1 樣品來源 選取南通市區哨點醫院，采集由食品或懷疑由食品引起的、以腹瀉癥狀為主訴就診的門、急診患者糞便樣品，同時收集患者的相關信息。診斷標準：選擇每日排便次數≥3 次患者的糞便樣品，糞便性狀異常，如水樣便、稀便、黏液便、血便或膿血便等。每份樣品采集2～5 g 或2～5 mL，放入Cary-Blair 運送培養基中，室溫條件下運送?？偣膊杉瘶悠? 040 份。

1.2 檢測試劑與設備 藥敏質控菌株ATCC25922及脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)所用的標準菌株H9812 均由江蘇省疾病預防控制中心提供。硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS 瓊脂)、堿性蛋白胨水增菌液、三糖鐵瓊脂、營養瓊脂等均購自廣東環凱微生物科技有限公司，內切酶SfiⅠ購自TAKARA-BIO 公司，Seakem－GoldAgarose 購自LONZA 公司，副溶血弧菌不耐熱溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)/耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)/耐熱相關溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購自赤峰眾康生物科技有限公司，BD Phoenix M-50 革蘭陰性生化反應及藥敏板購自美國BD 公司。所有試劑均在有效期內。BIORAD 脈沖場凝膠電泳系統(型號：CHEF Mapper Power Module)、BIO-RAD 凝膠成像系統(型號：Gel Doc XR+Universal Hood Ⅱ)、BD 全自動細菌鑒定/藥敏分析系統(型號：Phoenix M-50)、ABI 核酸擴增儀(型號：7500)性能良好。

1.3 檢測方法 根據行業標準WS271-2007 方法對副溶血性弧菌進行檢測。

1.3.1 分離鑒定 樣品至實驗室，取新鮮糞便接種于TCBS 瓊脂，37 ℃培養24 h；取糞便0.5 g 接種于10 mL 堿性蛋白胨水增菌液，37 ℃培養6 h 后，挑取增菌液接種于TCBS 瓊脂分離培養，37 ℃培養24 h；從瓊脂平板上挑取符合副溶血性弧菌反應特征的可疑菌落接種三糖鐵瓊脂及營養瓊脂培養基37 ℃培養24 h；從純化的瓊脂平板上挑取菌落制成0.5 麥氏濃度的菌液，加至BD 公司的革蘭陰性生化反應板，將板條放置于全自動細菌生化鑒定/藥敏系統BD Phoenix M-50，判讀結果。

1.3.2 毒力基因檢測 按照副溶血弧菌核酸檢測試劑盒說明書要求，對鑒定為副溶血性弧菌的菌株進行TLH、TDH 及TRH 核酸PCR 檢測，得到定性結果。

1.3.3 PFGE 分子分型 按照《脈沖場凝膠電泳(PFGE)操作規范》(PulseNet China 管理工作規范)對鑒定為副溶血性弧菌的菌株進行PFGE 實驗，得到菌株分子分型，利用Bio Numerics7.6 軟件進行聚類分析。

1.3.4 藥敏試驗 采用BD Phoenix M-50 自動微生物鑒定和藥敏分析系統對頭孢唑啉(Cefazolin,CFZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium,CTX)、頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、頭孢西丁(Cefoxitin,CFX)、氨芐西林(Ampicillin,AMP)、氨芐西林/舒巴坦(Ampicillin Sulbactam,AMS)、亞胺培南(Imipenem,IPM)、復方新諾明(Paediatric Compound Sulfamethoxazole Tablets,SXT)、四環素(Tetracyclines,TET)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、氯霉素(chloroamphenicol,CHL)、阿奇霉素(Azithromycin,AZM)、萘啶酸(Nalidixic acid,NAL)、環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)14 種抗生素進行藥敏試驗。

1.4 統計學方法 利用WPS Office 2016、SPSS 26.0及Bio Numerics 7.6 對實驗結果進行統計和分析。率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 副溶血性弧菌檢出情況 采集的2 040 份樣品中，共檢出副溶血性弧菌陽性樣品80 份，陽性率為3.92%。女性1 049 例中檢出副溶血性弧菌陽性46例，陽性率為4.39%；男性991 例中檢出陽性34 例，陽性率為3.43%，不同性別陽性率比較差異無統計學意義(χ2=0.425,P=0.569)。80 例陽性患者中71 例集中發生在8～10 月份，其余9 例散發在其他月份。不同年齡組副溶血性弧菌檢出率顯示，＞30～40 歲年齡組副溶血性弧菌檢出率最高8.82%(42/476)，與其余年齡組[0～10 歲1.18%(1/85)、＞10～20 歲0.65%(1/153)、＞20～30 歲2.97%(16/539)、＞40～50 歲6.48%(12/185)、＞50～60 歲1.36%(4/295)、＞60 歲1.30%(4/307)]比較差異有統計學意義(χ2=11.963,P=0.044)。

2.2 副溶血性弧菌陽性菌株的毒力基因結果 80株副溶血性弧菌的TLH、TDH 及TRH 核酸定性檢測顯示：73.75%(59/80)的菌株攜帶毒力基因TLH、TDH，不攜帶TRH；16.25%(13/80)的菌株攜帶毒力基因TLH、TRH，不攜帶TDH；10.0%(8/80)的菌株只攜帶毒力基因TLH，不攜帶TDH、TRH。毒力基因型分布集中在TLH+TDH+TRH-型。

2.3 副溶血性弧菌陽性菌株的PFGE 分型和聚類分析 按照PFGE 分子分型的規則，帶型完全相同的菌株劃分為同一PFGE 型別，除2019180、2022019、2022040 條帶降解外(可能與菌株攜帶某種基因簇有關，已送基因組測序，將持續關注反饋信息)，其余77株分為76 個型別(圖1)，總體條帶相似度為38.3%，其中2018211 與2018213 判定為100%相似，2019074與2019200、2019154 與2020139、2022138 與2022157、2020125 與2021073、2018150 與2018151、2020168 與2020164、2019199 與2019201、2021101 與2022137之間相似度分別為97.8%、97.6%、97.6%、97.4%、97.3%、95.5%、95.0%、95.0%，同源性極高。

圖1 2018—2022 年南通市副溶血性弧菌PFGE 分型聚類分析結果

2.4 副溶血性弧菌的藥敏結果 對80 株副溶血性弧菌進行藥敏試驗，有8 種抗生素的敏感率＞80%，分別為CTX、CAZ、CFX、AMS、IPM、SXT、GEN、CIP；只有CFZ 為100%耐藥，其余耐藥率均＜40%；對14 種抗生素的耐藥主要集中在只對CFZ 這一種抗生素耐藥(簡稱1R)，1R 59 株(73.75%)、2R 17 株(21.25%)、4R 4 株(5.00%)，見表1。

表1 80 株副溶血性弧菌陽性菌株藥敏試驗結果

2.5 感染性腹瀉病例涉及的食品分類、食品加工及包裝方式、進食場所分布情況 食源性疾病監測系統2018—2022 年2 040 例病例的監測數據顯示，排名前3 位的可疑暴露食品為混合食品(32.16%)、肉與肉制品(20.00%)、水產動物及其制品(19.85%)；可疑暴露食品加工方式以家庭自制(32.99%)和餐飲服務業(27.89%)為主；進食場所主要為家庭(57.99%)、街頭食品(11.23%)及飯店(酒店)(8.87%)。副溶血性弧菌陽性病例自述進食的可疑食品主要為水產動物及其制品、混合食品、肉與肉制品，加工方式以餐飲服務業和家庭自制為主，進食場所也是相對應的餐廳和居家為主，見表2。

表2 2018—2022 年可疑暴露食品、可疑暴露食品加工及包裝方式、進食場所分布情況(n,%)

3 討論

2018—2022 年南通市食源性疾病主動監測結果提示：副溶血性弧菌依舊是引起我市食源性疾病的重要細菌性致病因素，檢出率為3.92%，與本市2015—2017 年水平相近(4.58%)[4]。本研究顯示，副溶血性弧菌陽性病例的分布高峰為8～10 月份，表明夏秋季應是我市感染性腹瀉防控的重點季節。各年齡段均易感副溶血性弧菌，檢出的80 例中＞20～50 歲有71 例，尤其集中在＞30～40 歲的青壯年，這與副溶血性弧菌7～9 月份高發且以青壯年發病為多的流行特征基本一致[5]。

副溶血性弧菌的TLH 基因是其主要的毒素之一，具有廣泛的種屬特異性，研究[6]認為副溶血性弧菌無論是臨床分離株還是環境分離株均含有TLH基因；TDH 能使人或兔紅細胞溶血產生神奈川現象；TRH 具有與TDH 相似的毒性如致死作用和腸毒素作用但卻不能溶血。本研究中80 株副溶血性弧菌全部攜帶TLH 基因，其中TDH 基因陽性59 株(73.75%)，TRH 基因陽性13 株(16.25%)，與南通市2015—2016 年副溶血性弧菌毒力基因攜帶情況(TLH100%、TDH87.8%、TRH0%)比較[7]，TLH+TDH+TRH-菌株仍占絕大多數，同時這也與國內其他地區臨床分離株以攜帶TDH 基因為多的研究結果[8]類似。副溶血性弧菌中可能還存在與TDH 或TRH 協同作用的其他毒力因子[9]，因此，對于TDH-和TRH-的菌株，仍有致病的可能，正如本研究發現的8 例TLH+TDH-TRH-臨床菌株。

PFGE 分子分型可揭示菌株之間的流行病學聯系，為疫情溯源提供分子流行病學依據和支持，為建立感染性腹瀉的預警提供數據基礎。監測發現，南通市副溶血性弧菌的PFGE 帶型較多，呈現多樣化分布，分析得出76 個型別，無優勢型別，提示采集時段內無絕對流行株。其中有2 例菌株為同一型別，經追溯現場流調信息發現，菌株分別來源于同一家庭的2 位感染者，且有共同進食先后發生腹瀉的主訴，基本可以認定此2 例感染屬同源。另外有8 組菌株的同源性相對較高，達到95%以上，提示可能存在較近親緣。2019074 和2019200、2019154 和2020139、2022138 和2022157 均曾食用過水產動物及其制品；2018150 和2018151、2019199 和2019201、2020164和2020168 不僅有同日在餐飲行業就餐的情況，且菌株的毒力基因表型一致，進一步印證了存在密切相關菌株的可能性。這些菌株盡管未引起聚集性疫情，但在短時間內高度散發也應引起相關部門的高度重視。PFGE 分子分型雖具有極佳的溯源性，但由于PFGE 分子分型數據庫有限和病例的高度散發，加之此次監測僅局限于食源性腹瀉病例，未能成功追蹤到感染源，此后將擴大食品、水源及外環境監測并對副溶血性弧菌分離株進行PFGE 分子分型，不斷拓充菌株來源、擴展數據庫，為副溶血性弧菌病疫情預警提供有力的技術支撐。

菌株藥敏試驗結果顯示，80 株副溶血性弧菌的耐藥集中在CFZ(100.00%)、TET(36.25%)和AMP(26.25%)，這與多地近年的報道[10-13]一致，除CFZ、AMP、TET、CHL、AZM、NAL 外的其余8 種抗生素的敏感率均＞80%，在副溶血性弧菌感染的治療中可作為首選抗生素。監測不同來源菌株的耐藥情況，其結果對指導臨床合理選擇抗生素、減少多重耐藥菌株的產生具有現實意義，同時也為綜合防治副溶血性弧菌提供依據。

綜合食源性疾病監測系統信息發現，可疑食品暴露類別中，混合食品占比最高，其后依次為肉與肉制品、水產動物及其制品、水果類及其制品等，有明確分類的可疑食品以肉與肉制品所占比例最高，與本省2018 年度統計的的各市數據趨勢一致[2]。副溶血性弧菌感染病例所涉及的可疑食品以水產品占比最高，這與副溶血性弧菌的生存特性及高溫季節人們喜食生冷、涼拌海鮮水產密切相關。但主要進食場所為家庭和餐飲行業等場所的特征與文獻[2]報道結果并不完全一致，2018 年匯總的全省監測病例進食場所主要為飯店(酒店)、單位食堂和學校食堂，導致這種差異的原因可能在于相關行政部門對這些場所管理督察力度加大，使集中就(供)餐場所發生食源性疾病的風險大大降低，而家庭自制和街頭餐飲服務行業衛生意識相對薄弱，監管層面的漏洞使得食品安全隱患大大增加。因此，衛生部門仍需加強源頭監督和市場流通環節管理，避免引起散發病例和暴發疫情的可能性。

食源性疾病監測是系統地、連續地收集疾病信息，及早識別食品安全隱患，開展預警，為加強食品安全監管提供靶向性指導。南通市自2013 年建立食源性疾病監測與溯源系統以來，通過疾控中心與哨點醫院的加強協作，為制定食源性疾病防治策略提供了有力依據。今后應繼續提升預警和防控能力，保障食品安全。