基于轉錄組測序的輔助鑒定南方大豆皺葉癥分子標記開發

陳文杰 梁江 韋清源 湯復躍 郭小紅 陳淵

摘要：【目的】基于轉錄組測序（RNA-Seq）開發輔助鑒定南方大豆皺葉癥（SSCLD）的分子標記，為快速鑒定生產上遇到的大豆皺葉是否為SSCLD提供技術支撐?！痉椒ā坷棉D錄組測序技術分析遺傳背景相近的皺葉大豆和正常葉大豆材料在皺葉癥誘導環境下的差異表達基因（DEGs），從中去除核苷酸序列高度相似的同源序列，篩選出表達差異較大的DEGs進行分子標記開發，利用皺葉大豆材料和逆境處理試驗評價分子標記的表達專一性，并利用不同類型的皺葉表型樣本對分子標記進行表達專一性及可靠性驗證?！窘Y果】7株皺葉植株樣本和5株正常葉植株樣本的測序堿基錯誤率為0.0226～0.0238，Q20和Q30分別在99.00%和99.90%以上的堿基數量占總堿基數量均大于95.00%，GC含量為45.60%～46.24%，表明轉錄組測序數據質量較好。皺葉大豆材料較正常葉大豆材料有1063個DEGs上調表達，85個DEGs下調表達。根據基因的表達量和同源性，共篩選8個DEGs用作開發分子標記的候選基因，均表現為明顯上調表達。8個候選基因的實時熒光定量PCR檢測結果與轉錄組數據基本相符。此外，所篩選基因中有6個基因表達在不同程度上受干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫等逆境脅迫誘導，其中，種植于皺葉癥土壤中的皺葉型株系葉片GLYMA_18G033400基因的相對表達量均高于其在正常土壤中受干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽等逆境脅迫后的相對表達量。根據GLYMA_18G033400基因序列設計分子標記qCL-18G033400，并用該分子標記對19份不同皺葉類型的葉片樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結果發現，以ΔCt值小于10.00作為SSCLD的判定標準，分子標記鑒定結果同田間鑒定結果一致?！窘Y論】利用轉錄組測序技術開發的分子標記qCL-18G033400可輔助鑒定SSCLD。

關鍵詞：大豆；皺葉癥；分子標記；開發；轉錄組；輔助鑒定

中圖分類號：S565.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1587-11

Development of molecular markers based on transcriptome

sequencing for assisting the identification of southern soybean crinkle leaf disease

CHEN Wen-jie1， LIANG Jiang1， WEI Qing-yuan1， TANG Fu-yue1，

GUO Xiao-hong1， CHEN Yuan2*

（1Cash Crops Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning， Guangxi? 530007，China；

2Key Laboratory of Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi? 530007，China）

Abstract：【Objective】Molecular markers based on transcriptome sequencing（RNA-Seq） for assisting the identification of southern soybean crinkle leaf disease（SSCLD） was developed to provide technical support for quickly identifying whether the soybean leaves encountered in production were SSCLD. 【Method】Transcriptome sequencing technology was used to analyze differentially expressed genes between crinkle leaf and normal leaf soybean materials with similar genetic background in the crinkle leaf-induced soil environment. Homologous sequences with highly similar nucleotide sequences were removed， DEGs with large expression differences were selected for molecular marker development， the expression specificity of molecular markers was evaluated by using crinkle leaf soybean material and stress treatment test， and the expression specificity and reliability of molecular markers were verified by different types of crinkle leaf phenotype samples. 【Result】The sequencing base error rate of seven crinkle leaf plants and five normal leaf plants were 0.0226-0.0238， the numbers of bases in Q20 and Q30 were 99.00% and 99.90%， and the GC contents were 45.60% to 46.24%， indicating good quality of transcriptome sequencing data. Transcriptome data showed that 1063 genes were up-regulated and 85 genes were down-regulated in leaves from the crinkle leaf type material，compared to that from normal leaf type material. Based on the expression level and homology of the genes， eight genes were screened according to the expression level and the identification of the homology in soybean genome，and both of them were up-regulated genes. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis of the eight candidate genes generally agreed with the transcriptome data.The expression levels of six of these genes showed varying degrees of interference by diverse abiotic stress，including dry stress，water logging stress，cold stress，shade and salt stress，and the expression level of GLYMA_18G033400 in crinkle leaves from the crinkle leaf-induced environment was higher than that from normal soil under dry stress，waterlogging stress，cold stress，shade and salt stress. Molecular marker qCL-18G033400 was designed according to the GLYMA _ 18 G033400 gene sequence， and used to perform real-time fluorescence quantitative PCR on 19 leaf samples of different crinkle leaf types. The results showed that ΔCt value less than 10.00 was used as the determination criterion of SSCLD， and the identification results were consistent with the field identification results. 【Conclusion】Molecular marker qCL-18G033400 deve-loped using transcriptome sequencing can assist in the identification of SSCLD.

Key words： soybean； crinkle leaf disease； molecular marker； development； transcriptome； auxiliary identification

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32060490， 32260451）； Special Construction Project of China Agriculture Research System （CARS-04-CES30）； Guangxi National Science Foundation（2019GXNSFAA185009）

0 引言

【研究意義】大豆［Glycine max （L.） Merr.］是豆科大豆屬的一年生草本植物，是我國重要的糧、油、飼兼用作物，在我國國民生產中具有重要的作用。南方大豆產區是我國重要的高蛋白大豆產區之一，為大豆蛋白加工提供優質的原料。近年來廣西、廣東、福建和貴州等地大豆生產中出現類似但非大豆病毒病引起的葉片皺縮病癥，稱為南方大豆皺葉癥（Southern soybean crinkle leaf disease，SSCLD），發生嚴重時大豆可減產40%左右（陳文杰等，2022a），嚴重影響該產區大豆的生產。引發大豆皺葉的因素有病毒、除草劑、金屬離子、基因突變等，其中病毒、除草劑等引起的大豆皺葉與 SSCLD的葉片形態上存在相似性，受大豆品種等差異因素的影響，很難準確辨別生產上遇到的皺葉類型是否為SSCLD（陳文杰等，2022b）。然而，SSCLD葉片表型具有表達專一性，推測SSCLD葉片中存在特異表達基因，該基因可用于開發輔助鑒定SSCLD的分子標記。因此，開發輔助鑒定南方大豆皺葉癥分子標記，以期快速判定皺葉類型是否為SSCLD，對大豆皺葉癥檢測和防治及安全生產具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M展】鑒定由病毒引起的皺葉癥狀時，可根據病毒保守序列設計特異分子標記，再對其進行PCR擴增進行判斷。目前此類鑒定方法已很成熟，廣泛用于豆類（涂麗琴等，2019；吉穎等，2022）、馬鈴薯（魏瑤等，2020）、辣椒（龔明霞等，2022）和黃瓜（車海彥等，2020）等作物上。隨著酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金免疫層析法（Gold immunochromatography assy，GICA）等免疫學檢測技術的快速發展，使得病毒病的檢測快速便捷（王佳等，2021；董旭旭等，2022）。因此，病毒感染所導致的皺葉癥（Samertwanich et al.，2001；Ramon et al.，2014；王大剛等，2018；Yang et al.，2019）可通過免疫學檢測法和分子標記法（趙小慧等，2021）檢測，但SSCLD并非由病毒感染所致，無法利用這2種方法檢測。本研究團隊前期根據田間皺葉形態建立SSCLD鑒定方法（陳文杰等，2020）。該方法需將被鑒定大豆種質的種子種植于穩定誘發SSCLD的土壤中，根據大豆不同時期葉片形態表現進行鑒定。對于其他地區生產上出現的皺葉癥狀，單從形態上有時較難判定是否為SSCLD類型?！颈狙芯壳腥朦c】目前針對大豆皺葉的研究還比較少，具體何種因素導致SSCLD尚不清楚。SSCLD表型上具有表達專一性，推測SSCLD發生時會有特異表達基因，這些基因可用于開發分子標記進行輔助鑒定SSCLD，但目前鮮見開發輔助鑒定SSCLD分子標記的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用轉錄組測序（RNA-Seq）技術分析遺傳背景相近的皺葉大豆和正常葉大豆材料在皺葉癥誘導環境下的差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），從中去除核苷酸序列高度相似的同源序列，篩選出表達差異較大的DEGs進行分子標記開發，利用皺葉大豆材料和逆境處理試驗評價分子標記的表達專一性，并利用不同類型的皺葉表型樣本對分子標記進行表達專一性及可靠性驗證，以期開發分子標記用于輔助鑒定SSCLD。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的大豆品種為桂春8號（正常葉，皺葉癥級為0）和粵春2017-1（皺葉，皺葉癥級為7）有性雜交衍生的雜合異質系材料GY_C（皺葉癥誘導環境下表現皺葉）和GY_N（皺葉癥誘導環境表現正常葉）（陳文杰等，2022a）以及近雜合異質系材料F2：7，即從F2代取雜合單株進行株行種植，收獲皺葉單株，再進行株行種植，然后選擇分離的株行收獲皺葉單株繼續進行株行種植，按照此方法一直種至F2：6代的植株，單株收獲F2：6代中皺葉植株，得到F2：6代皺葉單株的種子F2：7，以上材料均由廣西農業科學院經濟作物研究所提供。主要試劑：總RNA提取試劑盒（RNAsimple Total RNA Kit）和反轉錄試劑盒［FastKing RT Kit （With gDNase）］均購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Es Taq MasterMix購自于康為世紀生物科技有限公司；2×ChamQTM Univarsal SYBR qPCR Master Mix購自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。主要設備儀器：LightCycler 480II實時熒光定量PCR儀（Roche，美國）

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 F2：7代皺葉癥田間鑒定試驗 F2：6代皺葉單株的種子F2：7于2020年3月8日播種于廣西農業科學院明陽基地（東經108°14′11″，北緯22°36′30″，海拔105.64 m，紅壤土），多年試驗證明該地塊為大豆皺葉癥表現穩定的地塊。選擇皺葉和正常葉分離的株行（圖1），于始花期分別取7株皺葉植株（C_3、C_6、C_10、C_11、C_18、C_23和C_24）和5株正常葉植株（N1_1、N1_3、N1_5、N1_6和N1_7）的頂部嫩葉2 g左右，分別用錫箔紙包好后置于液氮保存，隨后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行轉錄組測序。

采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit進行文庫構建，即提取總RNA后Oligo dT富集mRNA，然后對富集后的mRNA進行片段化處理，隨后利用反轉錄酶反轉錄合成cDNA，片段兩端連接adaptor后利用Illumina NovaSeq 6000平臺進行測序。測序完成后，圖像信號經Base Calling得到Raw bases，數據質控得到Clean data，使用TopHat2 （http：//tophat.cbcb.umd.edu/）與大豆參考基因組Wlliams82.a4.v1（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Gmax_Wm82a4_v1）進行對比得到mapped data（Kim et al.，2013），使用Cufflinks（http：//cole-trapnelllab.github.io/cufflinks/）將mapped reads進行組裝拼接（Trapnell et al.，2010），使用RSEM獲得每個樣本基因/轉錄本的Read Counts（Li and Deweg，2011），然后對其進行TPM（Transcripts per million reads）轉換，進而得到標準化的基因/轉錄本表達水平。TPM轉換方式：先將讀數計數除以每個基因的長度（以千堿基為單位），得到每千堿基Reads（Reads per kilobase，RPK）。計算各樣本中所有的RPK值，然后將其除以1000000，得到每百萬縮放因子（Per million scaling factor），最后將RPK值除以每百萬縮放因子即可得到TPM。

1. 2. 2 逆境處理試驗 為驗證在皺葉和正常葉中表達差異的基因是否具專一性，2021年7—12月利用皺葉材料GY_C進行干旱（Drought stress treatment，DST）、水漬（Water logging treatment，WLT）、冷害（Cold stress treatment，CST）、蔭蔽（Shading treatment，ST）和鹽脅迫（Salt stress treatment，SST）等逆境處理試驗。試驗采用盆栽方法，逆境處理使用土為營養土（皺葉材料表現正常），設置1個營養土對照（CKN）和1個皺葉土壤對照（CKC），重復3次。皺葉種子播種于花盆（口徑×底徑×高為21.5 cm×17.3 cm×14.8 cm），每盆播種4～5粒，待真葉期每盆留2株，隨后分別進行干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理。干旱脅迫處理參考王興榮等（2021）的方法，即第6片復葉期開始處理，停止正常供水3 d后取頂部嫩葉。水漬處理參考孫慧敏等（2010）的方法，即第3片復葉期開始水漬處理15 d后取頂部嫩葉。冷害處理參考蓋志佳等（2019）的方法，即第6片復葉期開始處理，3 ℃培養箱中處理12 h后取頂部嫩葉。蔭蔽處理參考劉婷等（2016）的方法，即第6片復葉期在透光率為50%的遮陽網下處理5 d后取頂部嫩葉。鹽脅迫參考嚴勇亮等（2021）的方法，即第6片復葉期開始處理，置于1.5%的NaCl溶液中處理3 d后取頂部嫩葉。CKN和CKC均于第6片復葉期取頂部嫩葉。嫩葉用錫箔紙包好置于液氮中保存備用。用RNAsimple Total RNA Kit提取嫩葉樣品總RNA，然后用FastKing RT Kit （With gDNase）進行反轉錄合成cDNA。

1. 2. 3 皺葉樣品采集及田間鑒定試驗 2021年7—9月分別在南寧、貴港和賀州等地取不同大豆皺葉類型的大豆植株，取嫩葉后提取其總RNA，然后反轉錄合成cDNA備用。同時用標牌標記好植株成熟后收獲該單株，2022年春季在廣西農業科學院明陽基地田間鑒定各材料的皺葉癥級，鑒定方法參考陳文杰等（2020），即始花期連續調查10株的皺葉癥級，根據以下公式計算皺葉病癥指數（DI）：

DI（%）=［∑（N×R）/（M×T）］×100

式中，N表示病害某一級別的植株數；R表示病害的相對病級數值；M表示病害的最高病級數值；T表示調查的總株數。然后根據皺葉癥指數劃定皺葉癥分級：0級為高抗（HR），DI=0；3級為抗（R），0<DI≤30%；5級為中抗（MR），30%<DI≤60%；7級為感（S），60%<DI≤90%；9級為高感（HS），DI>90%。

1. 3 DEGs篩選

為了篩選DEGs，對各基因的TPM值進行t檢驗，篩選皺葉和正常葉的DEGs。篩選條件：TPM-Cmin>TPM-Nmax或TPM-Cmax<TPM-Nmin、TPM-Cmin/TPM-Nmax≥5或TPM-Nmin/TPM-Cmax≥5。其中，TPM-Cmin表示某基因中皺葉個體TPM最小值；TPM-Nmax表示某基因中正常葉個體TPM最大值；TPM-Cmax表示某基因中皺葉個體TPM最大值；TPM-Nmin表示某基因中正常葉個體TPM最小值。

1. 4 DEGs同源性比對分析

因大豆屬于古四倍體，大多數基因屬于同源序列，導致擴增該基因難以保證其表達專一性。因此，設計分子標記時需刪掉候選基因中核苷酸序列高度相似的基因。將篩選得到的基因cDNA預測序列提交到NCBI數據庫上進行BLAST比對，以獲得大豆基因組內的核苷酸序列高度相似的序列，從候選基因中刪除這些序列。核苷酸序列高度相似的基因判定規則：Query cover≥80.00%且Percent identity≥80.00%；不存在高度相似基因滿足條件：NQP<1。NQP代表Query cover≥80.00%且Percent identity≥80.00%基因的個數。

1. 5 分子標記開發及表達驗證

利用Primer 5.0設計篩選得到候選基因的定量引物，引物擴增產物長度控制在100～250 bp。通過溫度梯度PCR檢測擴增引物的擴增效率和最適退火溫度（表1）。挑選擴增條帶清晰且不存在非表達專一性擴增的引物進行實時熒光定量PCR檢測。以皺葉癥誘導環境中的GY_C和GY_N株系葉片cDNA為模板，以GmActin為內參基因，引物見表1，用上述篩選出的引物驗證分子標記表達的差異性。利用2×Es Taq MasterMix試劑盒進行引物篩選。溫度梯度PCR反應體系25.0 μL： 2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，10 nmol/L上、下游引物各1.0 μL，4 ng/μL cDNA模板1.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL；擴增程序：96 ℃預變性2 min；96 ℃ 30 s，退火溫度（見表1）30 s，72 ℃ 10 s，進行36個循環，72 ℃延伸5 min。利用2×ChamQTM Universal SYBR qPCR MasterMix試劑盒對候選基因進行實時熒光定量PCR檢測，操作流程參考其說明書。

1. 6 分子標記表達專一性評價

以干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理及相應對照CKN和CKC的GY_C株系葉片cDNA為模板，Actin11為內參基因，對篩選出的優質分子標記進行實時熒光定量PCR檢測，進一步篩選出受逆境影響小的基因中的分子標記。

1. 7 分子標記可靠性驗證

以Actin11為內參基因，用篩選出的分子標記對南寧、貴港和賀州等地采集的不同皺葉類型的大豆葉片進行實時熒光定量PCR檢測。依據各基因的ΔCt值進行SSCLD鑒定，并將鑒定結果與田間鑒定結果相比較，以驗證分子標記鑒定結果的吻合度。

1. 8 統計分析

利用Excel 2019進行數據整理分析；采用IBM SPSS Statistics 19進行t檢驗。

2 結果與分析

2. 1 轉錄組測序分析結果

由轉錄組測序質控數據（表2）可知，12個樣本的測序堿基錯誤率為0.0226～0.0238，均在0.1000%以下，Q20和Q30分別在99.00%和99.90%以上的堿基數量占總堿基數量均大于95.00%，GC含量為45.60%～46.24%。由表3可知，每個樣本93.00%以上的reads均可比對到大豆參考基因組上，表明轉錄組測序數據質量較好，可用于后續數據分析。

2. 2 DEGs篩選及同源性分析結果

在皺葉癥誘導環境下，皺葉材料和正常葉材料葉片共同表達基因數為32100個，占表達基因總數的94.1%，其中在皺葉材料葉片中DEGs數為1351個，占表達基因總數的4.0%；在正常葉材料葉片中DEGs數為660個，占表達基因總數的1.9%（圖2-A）。與正常葉材料相比，皺葉材料中有1063個DEGs上調表達，85個DEGs下調表達（圖2-B）。其中，上調的DEGs中TPM-Cmin>TPM-Nmax的基因有540個，下調的DEGs中TPM-Cmax<TPM-Nmin的基因有39個。下調的DEGs中無TPM-Nmin/TPM-Cmax≥5.00的基因，上調的DEGs中在正常葉中不表達的共有13個，但其中11個基因的TPM平均值小于1.00，可作為備選基因。最終篩選出9個表達差異較大的DEGs（表4），且均表現為明顯表達上調。

提取上述9個DEGs的cDNA序列，并在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果顯示僅有GLYMA_15G156200基因在大豆基因組中存在2個高度相似基因（表4），且與GLYMA_09G049500基因的Query cover和Percent identity分別為88.00%和92.27%。因此選擇余下的8個DEGs用作開發分子標記的候選基因。

2. 3 輔助鑒定SSCLD的分子標記開發

根據篩選出的8個候選基因cDNA序列信息設計引物，以溫度梯度PCR篩選引物的最佳退火溫度。以皺葉癥誘導環境下的皺葉材料（GY_C）和正常葉材料（GY_N）株系葉片cDNA為模板，對8個候選基因進行實時熒光定量PCR檢測，結果（表5）顯示，與正常葉材料相比，皺葉材料葉片中8個候選基因的表達量均明顯增加，其中差異倍數最小的是GLYMA_13G167100基因，僅為2.55倍；差異倍數最大的是GLYMA_18G033400基因，達66.26倍。表達差異較小可能會影響SSCLD的鑒定效果。因此，選擇表達差異較大的GLYMA_18G033400、GLYMA_09G130800、GLYMA_15G160600、GLYMA_15G156200、GLYMA_04G242400和GLYMA_07G229500共6個基因開發的分子標記進行后續專一性評價試驗。

2. 4 分子標記專一性評價結果

干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫等逆境是生產中常見的非生物逆境脅迫。對皺葉材料進行干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理，利用實時熒光定量PCR對表達量差異較大的6個基因開發的分子標記進行專一性評價，結果（表6）顯示，qCL-09G130800在蔭蔽、干旱、冷害和鹽脅迫處理下的葉片中相對表達量較CKC和CKN均顯著增加（P<0.05，下同），qCL-15G160600在蔭蔽和鹽脅迫處理下的葉片中相對表達量較CKN顯著增加，qCL-04G242400在鹽脅迫處理的葉片中相對表達量較CKC顯著增加，qCL-15G156200在蔭蔽、和鹽脅迫處理的葉片中相對表達量較CKC顯著增加，表明這些基因的表達受逆境脅迫影響的程度高于SSCLD，盡管qCL-18G033400在蔭蔽、冷害和鹽脅迫處理植株葉片中相對表達量顯著高于CKN，但均顯著低于CKC。因此，選擇qCL-18G033400為輔助鑒定SSCLD的候選分子標記。

2. 5 分子標記可靠性驗證結果

2021年4—6月，從南寧、貴港和賀州等地采集不同皺葉類型的大豆葉片樣品共19份（圖3）。其中，從南寧明陽基地采集到14份樣品（編號為樣1～14），從貴港市良種繁殖示范場采集到2份樣品（編號為樣15和樣16），從賀州市黃姚鎮采集1份（樣17），從賀州市農業科學院基地采集到2份（編號為樣18和樣19）。利用GLYMA_18G033400基因開發的分子標記qCL-18G033400對19份皺葉樣品進行實時熒光定量PCR檢測。根據內參基因Actin11的表達量計算出各樣本GLYMA_18G033400基因的相對表達量ΔCt值，同時進行田間皺葉癥抗性鑒定，結果如表6所示。當材料的GLYMA_18G033400基因ΔCt值大于10.00時，田間鑒定為高抗性材料（皺葉癥級為0級）；當材料的GLYMA_18G033400基因ΔCt值小于10.00時，田間鑒定為中抗、感等材料，表明該標準可滿足分子標記輔助鑒定SSCLD的要求。

3 討論

SSCLD在我國南方多個?。▍^）可導致大豆嚴重減產（陳文杰等，2022a）。本研究課題組團隊發現SSCLD不同以往的大豆皺葉類型，極有可能由土壤中未知微生物所致，建立快速準確的SSCLD鑒定方法可為SSCLD的防治提供技術支持。陳文杰等（2022a）根據大豆葉片皺縮程度建立了SSCLD田間鑒定方法，但該方法需要穩定發病的田間環境，且無法直接鑒定生產上遇到的皺葉是否屬于SSCLD，若采用南方皺葉癥田間鑒定方法對種子進行鑒定，可能出現假陽性現象，比如對于攜帶皺葉基因（顯性）材料，葉片可能發生非SSCLD類型的皺縮，收集該材料種子進行田間鑒定結果就會出現假陽性。轉錄組測序技術廣泛用于植株分子標記的開發（胡小文等2022；秦英之等，2022；徐曉丹等，2023），尤其是用于沒有參考基因組的植物上（伍越等，2021）。為了克服表型鑒定SSCLD的缺點，本研究以遺傳背景相近的皺葉材料和正常葉材料為研究對象，通過轉錄組測序分析篩選其葉片在皺葉癥誘導環境中的DEGs，并進一步開發出輔助鑒定SSCLD的分子標記。

本研究篩選出用作開發輔助鑒定皺葉分子標記的候選基因GLYMA_18G033400。該基因在Soybase網站（https：//www.soybase.org/）查詢結果顯示，其序列全長為790 bp，含2個外顯子，編碼區序列僅為249 bp。再將該基因序列提交至NCBI數據庫進行比對，結果顯示，該基因與LOC114394687基因的序列一致。LOC114394687基因編碼一種lncRNA，但功能未知，在NCBI數據庫進行BLAST比對分析，結果顯示，僅有一條來自蕓豆（Phaseolus vulgaris）的mRNA與其同源。lncRNA雖不編碼蛋白，但在表觀遺傳調控（Gupta et al.，2010）、細胞周期調控（Kitagawa et al.，2013）和細胞分化調控（Yao et al.，2022）等生命活動中發揮重要作用。一些lncRNA是人類腫瘤重要的調控因子，在腫瘤發生和發展中具有表達專一性，故常被作為一種生物標志物用于腫瘤的診斷（王思宇和王宇，2022）。大量研究表明，lncRNA廣泛參與調控植物生長發育和響應生物或非生物逆境等生理過程（李寧等，2019），如lncRNASABC1基因通過響應化學信號等介導的早期快速抗性反應激活植物對病原的免疫（Liu et al.，2022）。本研究的實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與正常葉相比，GLYMA_18G033400基因在皺葉中的相對表達量顯著性增加，且其表達受遮蔭和干旱等生產上常見的非生物逆境脅迫影響較小，推測該基因在SSCLD發生過程中具有一定的表達專一性。GLYMA_18G033400基因是否在其他逆境誘導的葉片中表達量高于皺葉癥，目前尚未知需要更多的逆境試驗進行驗證，但其并不影響GLYMA_18G033400基因作為SSCLD鑒定的指示基因。在涉及大量皺葉性狀的材料需鑒定時，可利用該基因開發的分子標記進行初篩。低表達的皺葉類型可斷定為非南方皺葉癥類型，而對于高表達的皺葉類型可借助田間鑒定方法進行綜合判定。目前該分子標記鑒定采集的19份皺葉材料同田間鑒定結果一致性較好，但還需要更多的皺葉材料驗證該分子標記鑒定結果的準確性。另外，導致大豆皺葉的誘因還有很多，如病毒、除草劑、金屬離子等，分子標記在這些誘因導致的皺葉中GLYMA_18G033400基因是否過表達目前尚未知，還需要進一步收集這些誘因導致的皺葉樣品對qCL-18G033400進行驗證。

分子標記輔助鑒定SSCLD的方法較田間鑒定方法縮短了鑒定時間，能在較短時間內判斷生產上遇到的皺葉癥狀是否為SSCLD，為今后生產上SSCLD的快速診治提供技術參考。但目前生產上存在皺葉癥狀的嚴重程度不等的情況，目前還缺乏不同皺葉癥級與標記qCL-18G033400表達量方面的數據。因此，若要想精準判定葉片皺縮是否為SSCLD需盡快找出SSCLD致病因子，通過檢測土壤或植株中致病因子含量情況進行精準判定。

4 結論

根據遺傳背景相近的皺葉材料和正常葉材料的轉錄組數據，從DEGs中篩選出SSCLD表達專一性表達的基因GLYMA_18G033400，利用其開發的分子標記qCL-18G033400可輔助鑒定SSCLD。

參考文獻：

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（責任編輯 陳 燕）

收稿日期：2023-03-05

基金項目：國家自然科學基金項目（32060490，32260451）；國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-04-CES30）；廣西自然科學基金項目（2019GXNSFAA185009）

通訊作者：陳淵（1971-），https：//orcid.org/0000-0003-0876-0154，研究員，主要從事大豆栽培和遺傳育種研究工作，E-mail：chenyuan 313@163.com

第一作者：陳文杰（1982-），https：//orcid.org/0000-0002-3317-4205，副研究員，主要從事大豆遺傳育種及耐逆境機制研究工作，E-mail：cenwenji1030@163.com

陳文杰（1982-），副研究員，主要從事大豆遺傳育種及耐逆境機制研究工作。主持國家自然科學基金項目“新型大豆皺葉基因CL12的圖位克隆及其對產量性狀影響”和“大豆皺葉癥關鍵致病因子分析及其誘發的皺葉分子機制”2項、廣西自然科學基金項目“大豆皺葉癥抗基因鑒定及功能標記開發”1項，作為主要成員參與省部級項目8項；獲廣西科技進步獎二、三等獎各1項；以第一完成人育成已通過廣西農作物品種審定委員會審定的大豆新品種1個，作為主要參與者育成已通過廣西農作物品種審定委員會審定的大豆新品種8個；獲第一發明人授權發明專利7件，實用新型專利7件；在《中國油料作物學報》《南方農業學報》《大豆科學》等期刊發表科技論文35篇，其中以第一作者發表中文核心期刊論文14篇。