去泛素化酶JOSD2通過調控DNA損傷修復影響非小細胞肺癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性

葛孚晶，劉湘寧，張鴻宇，袁 濤，朱 虹，楊 波，何俏軍

浙江大學藥學院，浙江 杭州 310058

據統計，近年來亞洲新發肺癌患者逐年增加，我國肺癌發病率和病死率也呈逐年上升趨勢［1］。肺癌中80%～85%為NSCLC，其具有發病隱匿、早期癥狀不明顯的特點，確診時往往為中晚期，病死率居高不下，患者5 年存活率不到20%［2-4］。近年來，雖然針對NSCLC 的分子靶向藥物治療獲得一定進展，但仍有70%～80%的NSCLC 患者無法從中獲益。因此，迫切需要探究NSCLC進展的分子機制，尋找治療NSCLC新的靶點，從而開發行之有效的靶向治療策略。

泛素化修飾是一種動態可逆的翻譯后修飾，在細胞的蛋白降解途徑中發揮重要調控作用［5］。DUB 能夠特異性地移除底物蛋白上的泛素鏈，從而調控多種底物蛋白的降解過程。近年大量文獻報道，DUB 通過調控細胞內多種信號通路，從而影響細胞周期和凋亡，并最終促進宮頸癌、黑色素瘤和前列腺癌等腫瘤的惡性進展［6-11］。因此，針對DUB展開研究有望發現治療NSCLC新的靶點，為NSCLC 治療提供新的思路。本研究基于公共數據庫中數據的生物信息學分析，全面考察了NSCLC 中發揮關鍵調控作用的DUB，并分析其中分子機制，旨在為NSCLC的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

人NSCLC 細 胞 株PC-9 和NCI-H1299 購 自 中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；依托泊苷、多柔比星和奧拉帕尼為美國MedChemExpress公司產品；RPMI-1640 培養基、胎牛血清、Opti-MEM?、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺為美國Thermo Fisher Scientific 公司產品；SRB、丙酮酸鈉、聚凝胺和JOSD2 抗體為美國Sigma-Aldrich 公司產品；GADPH抗體為戴格生物技術有限公司產品；γ-H2AX 抗體為美國Cell Signaling Technology公司產品；辣根過氧化合物酶標記二抗（兔抗與鼠抗）為杭州聯科生物技術股份有限公司產品；DAPI 為 美 國Dojindo Molecular Technologies 公 司產品；pCDH-JOSD2-HA 質粒為山東維真生物科技有限公司產品；jetPRIME?為法國Polyplus 公司產品；si-JOSD2 為上海吉瑪制藥技術有限公司產品。

細胞培養箱和生物安全柜為美國Thermo Electron 公司產品；普通倒置顯微鏡和熒光顯微鏡為德國Leica 公司產品；電泳及轉膜裝置為美國Bio-Rad 公司產品；AI 600 成像儀為美國GE 公司產品；多功能酶標儀為美國Thermo Fisher Scientific公司產品。

1.2 NSCLC基因表達數據及臨床資料的收集

從基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus）下載NSCLC 轉錄組表達數據及臨床資料，篩選條件:①物種為人類；②疾病類型為NSCLC；③腫瘤原發位點為肺部；④數據形式為高通量測序或芯片數據；⑤數據類型為基因表達定量；⑥數據集樣本數100 例及以上；⑦其余篩選條件為默認或不選。下載各數據集的基因表達矩陣和分組信息，在R 4.2.1 軟件中利用相應的R 軟件包進一步處理。

1.3 篩選與NSCLC 患者預后相關的DUB 相關差異表達基因

首先，將不同數據集轉錄組測序數據進行數據清洗，并根據樣本來源分為正常組織和NSCLC組織。然后使用R 軟件包factoMineR 2.8 和factoextra 1.0.7 進行主成分分析及可視化。接著，使用R 軟件包limma 3.42.2 進行數據比較并計算差異表達基因，篩選上調差異表達基因的標準為P＜0.05 且差異倍數大于 1，篩選下調差異表達基因的標準為P＜0.05且差異倍數為＞0～＜1。再將多個數據集中的差異表達基因與DUB 列表取交集篩選出DUB 相關差異表達基因，并使用R 軟件包ggplot2 3.4.2 對各數據集中的DUB 相關差異表達基因的表達水平進行可視化。最后，使用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/）數 據 庫分析NSCLC 樣本中差異表達的DUB 表達量對患者總生存期的影響，篩選出與NSCLC 患者預后相關的DUB相關差異表達基因。

1.4 基因富集分析考察JOSD2 高表達患者信號通路的變化情況

將數據集NSCLC 樣本按照JOSD2表達量中位數分為JOSD2高表達組和低表達組，利用limma 分析篩選組間差異表達基因，并采用R 軟件包clusterProfiler 4.0 進行GO 與GSEA 富集分析。GO 富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組分三個層次。R軟件包org.Hs.eg.db 3.10.0用于ID 轉換。GSEA 分析參考基因集數據庫MSigDB（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）進行注釋。使用R 軟件包GSVA 1.48.0 進行GSVA 分析，并通過皮爾遜相關系數評估JOSD2表達水平與DNA修復相關生物學功能的相關性。

1.5 細胞培養

PC-9 和NCI-H1299 細胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL 青 霉 素 和100 μg/mL 鏈 霉 素 的RPMI-1640 培養基中，置于培養箱（37 ℃、5%二氧化碳）中培養。待細胞生長至合適密度時進行傳代培養，經0.05%胰蛋白酶消化傳代，所有實驗細胞均傳代十代以內。

1.6 轉染JOSD2過表達質粒

待PC-9細胞長至適宜密度時開始轉染，按照jetPRIME?轉染試劑說明將Jet-Buffer、pCDHJOSD2-HA 質粒和Jet-PRIME 共轉染至PC-9 細胞，轉染4～6 h 后更換成新鮮培養基，并按照實驗目的進行后續實驗操作。

1.7 構建DNA損傷細胞模型

待PC-9 細胞長至適宜密度時，利用DNA 損傷誘導劑多柔比星和依托泊苷構建DNA 損傷模型。利用梯度濃度的多柔比星（1、2 μmol/L）和梯度濃度的依托泊苷（100、200 μmol/L）處理細胞8 h，構建長時間內DNA 損傷修復模型。依據造模效果，選定200 μmol/L 濃度的依托泊苷分別處理細胞0、1、2、4、6、8 h，構建時間梯度的DNA 損傷修復模型。

1.8 蛋白質印跡法考察JOSD2和DNA 損傷修復通路相關蛋白的表達水平

收集處理后的PC-9 或NCI-H1299 細胞，加入2.5×上樣緩沖液裂解細胞，后置于95 ℃金屬浴加熱變性30 min 制成樣本。樣本進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入γ-H2AX 一抗（1∶1000）、JOSD2 一抗（1∶1000）和內參GAPDH 抗體稀釋液（1∶3000），4 ℃孵育過夜。1×PBST 漂洗三次后，加入對應屬性的二抗稀釋液（1∶5000）室溫孵育1 h，1×PBST 漂洗三次將ECL 顯影液按照1∶1 的比例配置，混合后均勻覆蓋于聚偏二氟乙烯膜表面，采用AI-600曝光儀進行曝光采集圖像。

1.9 免疫熒光法考察JOSD2細胞內定位

生長至合適密度的細胞棄去培養液，加入適量的4%多聚甲醛固定以及含有0.1% Triton X-100的1×PBS 透化細胞后，使用含有4%牛血清白蛋白的1×PBS 封閉細胞，隨后使用JOSD2 熒光一抗（按1∶100用4%牛血清白蛋白的1×PBS進行稀釋）4 ℃孵育過夜。第二天棄去熒光一抗，用1×PBS 洗滌，并加入熒光二抗孵育液（按1∶100 稀釋），室溫孵育1 h。棄去熒光二抗，用1×PBS洗滌后加入抗褪色的DAPI 染色液（按1∶1000 稀釋），1×PBS 洗滌。加入適量體積的抗淬滅劑封片，置于風機下吹干后，用熒光顯微鏡拍照。

1.10 SRB染色考察細胞存活率

利用細胞轉染技術進行RNA 干擾實驗，構造陰性對照siRNA 和si-JOSD2 的NCI-H1299 細胞系。待NCI-H1299 細胞生長至合適密度時，分別以3.0×104個/孔 的 細 胞 密 度 接 種 于96 孔 板 中（100 μL/孔），于細胞培養箱中培養24 h 后，給予梯度濃度的 多 柔比星（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50 和6.25 nmol/L）和奧拉帕尼（50.00、25.00、12.50、6.25、3.13 和1.56 μmol/L）孵育72 h。孵育結束棄上清液，每孔加入100 μL 10%三氯乙酸溶液固定，棄培養液，用雙蒸水洗滌后烘干。每孔加入100 μL SRB染色液（用1%冰醋酸配置，每500 mL 加入1.5～2.0 g SRB 粉末），室溫放置20 min，用1%冰醋酸洗滌干凈后烘干。每孔加入100 μL Tris-base 堿溶液溶解結合到細胞內的SRB 染色液，置于室溫搖床20 min 后，在波長為515 nm 下檢測吸光度，計算細胞存活率。實驗獨立重復三次，每次設置三個復孔。

1.11 統計學方法

采用RStudio、Excel 軟件和Graphpad Prism 7軟件進行實驗數據的分析和繪圖。計量數據均以均數±標準差（±s）表示，采用雙側student’st檢驗分析兩組數據間的差異，采用one-way ANOVA 分析多組數據間的差異，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 JOSD2 在NSCLC 組織中高表達且與患者預后不良相關

經初步篩選，五個獨立數據集GSE19188、GSE33532、GSE43458、GSE44077、GSE75037 納入考察。主成分分析結果顯示，不同隊列中NSCLC組織與癌旁正常組織的轉錄組主成分均存在顯著差異（圖1）。其中，DUB 家族中的JOSD2、USP5和PSMD14的表達量均顯著上調（P＜0.05，圖2、附圖1）。Kaplan-Meier Plotter 分析結果顯示，JOSD2表達水平與患者的總生存期和進展后生存期均顯著相關（P＜0.05），見圖3、附圖2。提示JOSD2表達水平高的NSCLC患者預后不良。

圖1 基因表達數據庫各數據集中NSCLC組織和正常組織轉錄組測序數據主成分分析結果Figure 1 Principal component analysis results of transcriptome sequencing data of NSCLC tissue and normal tissue in Gene Expression Omnibus

圖2 各數據集中非小細胞肺癌組織共同高表達的DUB相關基因Figure 2 Cross analysis illustrating the overlap of DUB related genes with elevated expression in NSCLC patients within five independent cohorts

圖3 JOSD2、PSMD14 和USP5 對非小細胞肺癌患者預后影響的生存分析結果Figure 3 Effect of JOSD2， PSMD14 and USP5 on the prognosis of non-small cell lung carcinoma patients

2.2 JOSD2高表達NSCLC組織中DDR相關通路顯著激活

GO富集分析結果顯示，JOSD2高表達組樣本中蛋白泛素化調控、葡萄糖代謝過程等通路發生顯著富集（均P＜0.05），DNA 生物合成過程的正向調控、參與DNA修復的DNA合成等途徑也發生顯著富集（均P＜0.05），見圖4。GSEA 結果顯示，JOSD2表達量高的樣本中DNA修復、DNA損傷檢查點信號傳遞、DNA構象改變和DNA雙鏈斷裂修復途徑發生顯著激活（均P＜0.05），見圖5。進一步行GSVA 和相關性分析結果顯示，JOSD2表達水平與DNA雙鏈斷裂修復、經同源重組的雙鏈斷裂修復和經非同源末端連接的雙鏈斷裂修復等途徑的激活呈顯著正相關（均P＜0.01，圖6）。上述結果提示，JOSD2高表達患者DDR 相關通路均激活，JOSD2可能通過調控DDR 途徑發揮促NSCLC作用。

圖4 JOSD2 高表達組差異基因的基因本體論富集分析結果Figure 4 Gene ontology enrichment analysis of differentially expressed genes in the JOSD2 high-expression group

圖5 JOSD2高表達組差異基因基因集富集分析結果Figure 5 Gene set enrichment analysis of differentially expressed genes in the JOSD2 high-expression group

圖6 JOSD2表達水平與DNA損傷反應相關通路激活程度的相關性分析結果Figure 6 Correlation analysis of JOSD2 expression levels and the activation status of DNA damage response related pathways

2.3 JOSD2 是DNA 雙鏈斷裂修復的潛在調節因子

蛋白質印跡法檢測結果顯示，在多柔比星和依托泊苷處理的情況下，相比對照組，過表達JOSD2的PC-9 細胞中γ-H2AX 的表達水平降低（圖7），提示JOSD2與DNA 損傷修復過程相關。

圖7 過表達JOSD2 對不同藥物誘導γ-H2AX 表達水平的蛋白電泳圖Figure 7 Western blotting analysis of γ-H2AX expression levels induced by different drugs in cells overexpressing JOSD2

2.4 DNA 損傷后JOSD2 入核并加快DDR過程

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與對照組比較，過表達JOSD2顯著加快了γ-H2AX 的下調（圖8）。免疫熒光檢測結果顯示，與對照組比較，200 μmol/L的依托泊苷處理2 h 后，JOSD2 在細胞核區域發生顯著富集（圖9）。提示JOSD2 在細胞DNA 損傷后入核并加快DDR過程。

圖8 過表達JOSD2加速γ-H2AX下調的蛋白電泳圖Figure 8 Western blotting analysis of γ-H2AX down-regulation rate in cells overexpressing JOSD2

2.5 si-JOSD2 顯著提高NSCLC 細胞對多柔比星和奧拉帕尼的敏感性

蛋白質印跡法結果顯示，si-JOSD2 組細胞中JOSD2 的表達量顯著降低（圖10）。SRB 結果顯示，50 nmol/L 多柔比星處理72 h 的條件下，si-JOSD2組的存活率顯著低于對照組（P＜0.05），對照組和si-JOSD2 組多柔比星的IC50分別為（90.38±8.98）和（46.32±16.11）nmol/L（P＜0.05）；12.5 μmol/L奧拉帕尼處理72 h 的條件下，si-JOSD2 組的存活率顯著低于對照組（P＜0.05），對照組和si-JOSD2組奧拉帕尼的IC50分別為（22.58±1.75）和（13.26±4.14）nmol/L（P＜0.05），見圖11。提示si-JOSD2 可提高NSCLC 細胞對多柔比星和奧拉帕尼的敏感性。

與二甲基亞砜處理后的細胞比較，200 μmol/L 的依托泊苷處理2 h 后，JOSD2 在細胞核區域發生顯著富集.標尺=100 μm.JOSD2:含約瑟芬結構域2蛋白；DAPI:4'，6-二脒基-2-苯基吲哚.

圖11 敲低JOSD2 后在不同濃度多柔比星和奧拉帕尼作用下細胞存活曲線Figure 11 Cell survival curves under different concentrations of doxorubicin and olaparib after depletion of JOSD2

3 討 論

NSCLC 是世界上最為常見的癌癥相關死亡原因之一，每年死亡人數超過6 萬人［12］。研究顯示，50%以上的NSCLC 患者存在致癌驅動突變，其中KRAS突變患者占比約25%，EGFR突變患者占比約15%，ALK 突變患者占比約7%［13］。靶向NSCLC 的驅動突變可以顯著改善相關患者的生存期，為NSCLC 的臨床治療提供了新的范式［14］。盡管隨著腫瘤標志物的不斷發現和靶向藥物的開發，NSCLC 患者的存活期顯著延長［15］，但對于缺乏明確致癌驅動的晚期NSCLC 患者，聯合化療仍然是主要的治療手段［16］。研究報道，盡管化療藥物改善了晚期NSCLC 患者的生活質量，但中位生存期仍不足3 年。因此，亟須探究NSCLC 的全新靶點，以提高晚期NSCLC 患者化療敏感性，延長晚期NSCLC患者的總生存期。

泛素化修飾是一種物種間高度保守的翻譯后修飾類型，其主要依賴于泛素激活酶、泛素偶聯酶和泛素連接酶將泛素分子連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上［17］。據研究報道，多聚泛素化修飾與底物蛋白的降解途徑高度相關，經多聚泛素化修飾的蛋白主要通過泛素-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑降解［18］。DUB 能夠特異性地將底物蛋白上的泛素分子移除，從而逆轉細胞內泛素化修飾的過程，維持細胞內泛素化-去泛素化的平衡［19］。近年來，DUB 被廣泛報道參與多種惡性腫瘤的發生和進展［20-21］。例如，USP14 通過結合并移除IDO1 上的多聚泛素鏈，從而抑制IDO1 的降解并促進色氨酸代謝，最終抑制T 淋巴細胞的活性并促進結腸癌的進展［20］。研究顯示，USP2 可調控E2F4 的穩定性，促進腫瘤細胞的自噬和鋅穩態，最終調控腫瘤的惡性進展［21］。因此，靶向DUB 是開發抗腫瘤藥物的潛在策略?；诖?，本研究考察了多個獨立NSCLC 隊列中均發生顯著失調的DUB。結果顯示，JOSD2、USP5和PSMD14的表達水平均顯著上調?；跀祿爝M一步考察了JOSD2、USP5和PSMD14對NSCLC患者預后的影響，結果顯示JOSD2的表達水平與NSCLC 患者預后不良顯著相關，提示JOSD2參與NSCLC 的惡性進展。

盡管USP5和PSMD14在預后分析中顯示與患者預后無顯著相關性，本研究未納入考察，但兩者在NSCLC 和其他腫瘤中的作用有廣泛報道［22-24］。例如，USP5 被證實直接結合并介導細胞核Beclin 1 的去泛素化，從而穩定Beclin 1 并促進p53 的特異性降解，在KRAS 突變驅動的肺癌中發揮關鍵作用［22］。此外，也有研究證實USP5 直接結合并移除程序性死亡蛋白-1 上的多聚泛素鏈，從而促進程序性死亡蛋白-1 穩定和免疫療法的耐受性［23］。除此之外，PSMD14 也被證實通過調控E2F1 的去泛素化激活AKT 信號通路，并最終介導頭頸部鱗狀細胞癌的化學耐藥［24］。以上報道提示，盡管本研究中所使用的篩選方法具有較高的普適性，仍須對排除在外的潛在靶點進一步研究。

JOSD2 是馬查多-約瑟夫結構域亞家族的成員之一，近年來不少研究報道其參與多種腫瘤的惡性進展［25-27］。例如，JOSD2 被鑒定為YAP/TAZ和CTNNB1 的去泛素化酶，能夠直接結合并移除YAP/TAZ和CTNNB1 上的多聚泛素鏈，從而提高YAP/TAZ和CTNNB1的穩定性，促進肝細胞肝癌的惡性進展［25，27］。此外，JOSD2還被證實直接結合多種代謝酶，通過發揮去泛素化作用介導代謝酶的穩定和累積，并最終促進NSCLC 細胞的糖酵解和惡性演進［26］。然而，JOSD2 在NSCLC中發揮促腫瘤作用的分子機制仍未完全闡明。為此，本研究依據JOSD2相對表達量將隊列中的樣本分組，并基于GO分析和GSEA分析探究發生顯著改變的信號通路。結果顯示，DDR 相關通路被富集且在JOSD2較高表達水平的組中顯著激活。

DDR 是細胞內一種維持基因組穩定性的復雜生物過程，其主要通過激活細胞周期檢查點和協調細胞代謝反應以修復受損的DNA。有研究報道，癌癥中多種參與編碼DDR 的基因發生突變，從而引起腫瘤細胞基因組不穩定性，并最終介導腫瘤的發生和發展［28］。因此，靶向DDR 途徑，從而增加腫瘤細胞額外的復制應激和復制壓力，是抗腫瘤藥物開發過程中的重要思路［29］。近年來，多項研究報道，DUB 廣泛參與細胞中的DDR 過程［30-31］。例如，USP38 通過結合并移除HDAC1 上的K63 型多聚泛素鏈，從而促進了HDAC1 去乙?；钚?，并最終導致腫瘤細胞中NHEJ 過程的激活和DNA 損傷劑的不敏感性［30］。USP17 通過移除Ku70 上的泛素鏈從而促進NHEJ，是PTEN缺失腫瘤細胞中發揮DDR的主要原因［31］。本研究基于GSVA 分析，計算了JOSD2表達水平與DDR 途徑的相關性。結果顯示，JOSD2的表達水平與DDR 途徑的激活程度呈顯著正相關。體外實驗進一步證實，細胞在發生DNA 損傷后JOSD2 的核定位顯著增加，且過表達JOSD2能促進DNA 修復過程。以上結果提示，JOSD2 可通過調控DDR 途徑發揮促NSCLC 進展的作用。

近年來，多種DNA 損傷類藥物體現了靶向DDR 途徑在腫瘤治療中的巨大價值［32］。奧拉帕尼是多腺苷二磷酸核糖聚合酶特異性抑制劑，其通過靶向DDR 過程抑制BRCA 突變腫瘤的惡性進展，被廣泛應用于BRCA 突變型乳腺癌、卵巢癌和急性白血病的臨床治療。多柔比星是一種強效的化療藥物，其主要通過誘導腫瘤細胞的DNA 損傷發揮抗腫瘤功能，被廣泛用于多種腫瘤的新輔助化療［33］。然而，多柔比星通過誘導氧化應激、細胞自噬和細胞凋亡產生嚴重的心臟毒副反應，極大限制了其在腫瘤治療中的臨床應用［34-35］。通過藥物聯用策略增強腫瘤細胞對DNA 損傷類藥物的敏感性是提高其抗腫瘤作用并降低其毒副反應的重要思路。本研究通過轉染技術和SRB 技術考察了敲低JOSD2對多柔比星和奧拉帕尼的敏感性。結果顯示，敲除JOSD2能顯著降低多柔比星和奧拉帕尼在NSCLC 細胞系上的IC50，提示靶向JOSD2 是增強NSCLC 細胞系對DNA損傷類藥物敏感性的重要思路。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析和體外實驗證實，JOSD2 通過調控DDR 發揮促NSCLC作用，靶向JOSD2是提高NSCLC 化療敏感性的重要舉措，為NSCLC 的臨床治療提供了新的思路。但是，盡管本研究證實JOSD2顯著降低了DNA 損傷劑引起的γ-H2AX 上調，觀察到JOSD2 在DNA損傷劑的誘導下入核，但具體的分子機制仍未完全闡明。近年研究報道，DUB 通過介導組蛋白和DNA 修復相關蛋白的去泛素化調控DNA 損傷修復途徑［30-31］。因此，課題組后續將從JOSD2 直接結合的蛋白出發，通過體內外實驗進一步考察JOSD2 經由酶活發揮促DNA 損傷修復作用，探索JOSD2發揮作用的具體分子機制。

本文附圖見電子版。

志謝 研究得到浙江省重點研發計劃（2022C03077）支持

Acknowledgements The work was supported by the Key R&D Program of Zhejiang Province (2022C03077)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)