新疆野生櫻桃李PsoRPM2與PsoLFY互作調控植株開花的分子機制

高朝遠 關平印 蒲文江 袁梓珍 羅嗣芳 胡建芳

(中國農業大學 園藝學院,北京 100193)

高等植物開花是其生命活動中的重要階段,也是由營養生長向生殖生長轉變的重要標志[1]。植物只有在適宜的時期開花才能完成授粉受精形成種子,繁衍后代并確保物種的自然延續[2]。早開花可以在農業生產中促進早坐果、早成熟和早上市從而提高經濟效益[3-4]。另外對于多年生實生繁殖的果樹而言,由于存在著較長的童期,提早開花可以縮短育種周期,提高育種效率,節約土地,獲得早期豐產[5-6]。因此,研究植物的早花對于園藝植物具有重要意義。

植物的開花過程涉及到成花誘導、花發育和花器官形成等階段,每一個發育階段都必須在前一個階段完成的基礎上而展開[7]。目前大多數研究都集中在成花誘導方面,因為這一階段容易受到外界環境和植物內部信號共同影響,是比較敏感的時期,也是調節植物開花時間和數量的關鍵時期[1]。對擬南芥的研究表明,成花誘導主要涉及6條途徑[8],即春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、自主途徑、溫敏途徑和年齡途徑。這些途徑彼此獨立又相互交聯構成復雜而精密的調控網絡[9-10]。雖然模式植物的成花途徑已經相當清晰,但對于多年生果樹而言其成花途徑有別于一、二年生植物。因為果樹一旦度過童期或營養生長階段每一年都循環往復地進行花芽分化、休眠、萌芽、開花坐果和果實成熟等,并且果樹的花芽分化時間較長,一般需要跨越2個年度,因此果樹的成花調控途徑可能更為復雜。但目前對多年生果樹的成花調控途徑還缺乏系統的研究。

成花調控網是由自身遺傳因素和環境因素共同決定的復雜過程,其內在原因是通過一系列成花基因在時間和空間上按特定順序進行特異表達從而精準調控植物的開花[11]。目前對擬南芥6條成花途徑中不同成花基因的表達順序和功能都有較系統和清晰的研究。在這些途徑中存在著一些成花信號整合因子,如CONSTANS(CO)、FlOWERINGLOCUST(FT)、SUPPRESSOROFCONSTANS1(SOC1)、LEAFY(LFY)、SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE(SPL)、TERMINALFLOWER1(TFL1)和FLOWERINGLOCUSC(FLC)等[12],它們對植物開花起著關鍵作用。在這些基因中既有促進成花的基因也有抑制成花的基因。對擬南芥的研究表明,至少有180個以上的基因可能參與了開花調控的過程[8]。但由于果樹在花芽分化中經歷的內外環境復雜而多變,加之果樹遺傳轉化較為困難,耗時長,不宜重復驗證,對于成花基因的研究大多參照模式植物進行,多數成花基因在果樹中的具體功能還不清楚。

植物的開花除了受到成花基因的調控,還受到寒冷、干旱、鹽分和病原體感染等環境脅迫影響[12-15]。擬南芥中的核因子Y(Nuclear factor Y)包括NF-YB2和NF-YB3,與脅迫應答有關,通常它們需要形成同源或異源二聚體或三聚體才能發揮作用。近期的研究發現,CO可以與NF-Y互作[16-17],CO可以代替NF-YA與NF-YB、NF-YC形成三聚復合物,YB2與YB3通過招募CO結合到FT啟動子上,促進植物開花[18-19]。這表明植物的開花調控還存在著一些未知的領域。

新疆野生櫻桃李(Prunussogdiana)是原產中國西部天山山脈原始森林中的一種珍貴野生果樹[21],具有耐瘠薄土壤、抗鹽堿、耐濕、抗寒性強和抗病等特點[21-25]。與杏、梨、桃和櫻桃具有嫁接親和性,可以作為核果類果樹的優良砧木[26-27]。前期課題組已從新疆野生櫻桃李實生抗病單株中克隆得到psoRPM2抗南方根結線蟲基因,并通過遺傳轉化鑒定了其功能;同時發現轉psoRPM2基因煙草大多表現為早花[28]。本研究在此基礎上,觀察了新疆野生櫻桃李實生群體的開花類型和花芽分化特點,分析了新疆野生櫻桃李不同開花類型的關鍵成花基因表達,對轉psoRPM2基因煙草的開花特性和與早花相關的成花基因進行了研究,同時探討了psoRPM2與PsoLFY蛋白之間的關系,闡明了PsoRPM2基因引起的早花現象,以期明確psoRPM2調控新疆野生櫻桃李開花時期的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

利用定植于中國農業大學上莊實驗站的新疆野生櫻桃李早花與晚花植株,于2021年6月15號、7月15號、8月15號、9月15號和10月15號分別收集花芽與葉芽。一部分用FAA固定,用于石蠟切片的制備;另一部分置于-80 ℃保存用于RNA提取。轉psoRPM2基因煙草利用實驗室前期的組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1開花生物學性狀及解剖與組織結構觀察

開花生物學性狀是利用本實驗室常年記載的開花物候期數據,通過統計分析,確定不同單株的開花特性。同時利用解剖刀對不同發育時期的花芽進行徒手切片,置于體試鏡下觀察。將固定液(FAA)固定的樣品經過不同濃度的乙醇脫水、二甲苯透明處理、沉浸石蠟和包埋等常規石蠟切片制作過程,獲得含有不同試驗材料的蠟塊;在切片機上切成8～12 μm厚的切片,用番紅-固綠染色后封片,在OlympusBX-51光學顯微鏡觀察和拍照。每個發育時期的花芽各統計20個樣品。

1.2.2RNA提取、半定量PCR及實時熒光定量PCR

采用CTAB法提取新疆野生櫻桃李花芽和葉芽的總RNA,通過反轉錄試劑盒(Promega)反轉成cDNA,用于半定量RT-PCR和實時熒光定量表達(RT-qPCR)分析。根據同源克隆得到的PsoLFY、PsoFT、PsoTFL、PsoFLC、psoRPM2基因序列和在NCBI上查詢到的煙草NtLFY(XM_016593842.1)、NtFT(KC485967.1)、NtTFL(XM_016590731.1)、NtFLC(XM_016599652.1)、NtSOC(NM_001326029.1)、NtSPL(NM_001326256.1)、NtFD(XM_016613899.1)基因序列設計RT-PCR和RT-qPCR引物(表1),RT-PCR反應產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。RT-qPCR反應體系使用Applied Biosystems 7500(Thermo Fisher Scientific,40 ℃)進行40個循環,95 ℃預變性10 s和60 ℃變性30 s。使用2-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)檢測mRNA的表達水平,使用RPⅡ作為參照基因的標準。用Excel整理數據,用GraphPad Prism 5軟件進行作圖。每個發育時期的花芽和葉芽器官至少3個生物學重復。

表1 本研究所用引物序列及退火溫度

1.2.3基因克隆與酵母雙雜交

利用上述得到的櫻桃李cDNA模板,分別克隆PsoLFY和PsoRPM2基因,將PsoLFY和PsoRPM2分別構建至酵母雙雜pGBKT7和pGAKT7質粒上。將BD-PsoLFY與AD-PsoRPM2、陽性對照、BD-empty與AD-PsoRPM2、BD-PsoLFY 與AD-empty、BD-empty與AD-empty轉入酵母感受態細胞,涂布于SD/-Trp/-Leu二缺培養基平板上,30 ℃培養箱中倒置培養4～5 d;挑選6個單菌落于SD/-Trp-Leu-His三缺培養基上,倒置培養3～5 d;將陽性克隆再點于SD/-Trp-Leu-His-Ade四缺培養基;對生長出來的菌落進行X-α-Gal染色(4 mg/mL,每個菌落5 μL),通過顯色分析α-半乳糖苷酶活性,觀察并拍照。

1.3 數據處理

采用Excel對新疆野生櫻桃李花芽切片原始數據進行統計分析,使用Graphpad prism 6作圖。

2 結果與分析

2.1 新疆野生櫻桃李開花生物學性狀

本研究對定植于上莊實驗站的112株實生野生櫻桃李開花生物學性狀進行觀察,開花類型分為極早花、早花、中花、晚花和極晚花5種類型。2021-03-25拍照發現極早花類型中已有30%以上開始露白,早花類型中有10%～30%露白,中花類型中露白比率不足5%,而晚花類型中花芽剛開始膨大,極晚花類型中大多數花芽還未有膨大(圖1(a))。對112株實生野生櫻桃李不同開花類型統計表明,極早花、早花、中花、晚花和極晚花類型的比率分別為11%、24%、44%、18%和3%(圖1(b))。極早花與極晚花類型的開花時期平均相差10～14 d。

(a)同一時期極早花、早花、中花、晚花、極晚花的發育狀態;(b)實生群體中不同開花類型所占的比例;(c)同一發育時期早花和晚花不同發育狀態的統計分析。條形圖上的小花分別為不同發育時期的代表圖。

本研究從早花和晚花類型中分別選取2株樹體在開花前的未露白期(平均花蕾直徑(4±1) mm)、露白期(平均花蕾直徑(5±1) mm)、小蕾期(平均花蕾直徑(6±1) mm)和大蕾期(平均花蕾直徑8±1 mm)進行統計分析。結果顯示早花類型的未露白期、露白期、小蕾期和大蕾期比率分別為2.20%、7.50%、5.20%和85.10%,而晚花類型的比例則為19.60%、9.50%、8.30%和62.60%(圖1(c))。

2.2 不同開花類型早花和晚花植株的花芽分化過程

由于新疆野生櫻桃李實生群體存在早開花和晚花類型,本研究對早花和晚花類型花芽分化過程的外觀形態和組織解剖學形態進行了觀察。利用徒手切片在6月15號(大約是上一年分化的花芽開花后65 d)分別觀察早花和晚花的花芽形態。此時早花和晚花都已分化出來5～7層鱗片,早花植株的生長點已經隆起呈半圓狀,晚花植株的生長點還沒有明顯的隆起(圖2(a))。7月15號早花植株的花芽生長點已經呈現柱狀,并已完成萼片的分化;此時晚花植株的花芽生長點才明顯隆起(圖2(b))。到8月15號早花植株已經進入到花瓣原基分化期,而此時晚花植株完成了萼片的分化,還未進行花瓣原基的分化(圖2(c))。9月15號早花植株已經進入到雄蕊原基分化期,此時的晚花植株剛進入花瓣原基分化期(圖2(d))。到入冬前的10月15號早花植株已經進入雌蕊分化期,晚花植株完成了雄蕊分化期(圖2(e))。早花和晚花植株的開花狀態存在明顯不同(圖2(f))。

圖2 新疆野生櫻桃李早花與晚花植株花芽外部及解剖結構

進一步利用石蠟切片觀察花芽分化過程,發現早花類型和晚花類型的花芽分化過程并沒有明顯差異,都經歷了未分化時期、原基膨大期、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基和雌蕊原基分化期。在未分化期莖端生長點較小,呈圓錐形,細胞排列整齊,鱗片緊緊包圍在生長點外部(圖3(a));其后分生細胞膨大,生長點開始突起,生長點變大,此時外部的芽鱗片向外擴展變得疏松(圖3(b));隨著生長點的繼續變寬變大,突起明顯呈現半圓形(圖3(c));之后生長點逐漸變長、變寬、頂端扁而平,在生長點外圍開始凸起即為萼片原基(圖3(d));隨著萼片原基的不斷向內彎曲分化,在伸長的萼片原基內側產生新一輪凸起即為花瓣原基(圖3(e));在花瓣原基內側繼續分化形成新的凸起分化出雄蕊原基(圖3(f));其后雄蕊原基繼續分化(圖3(g));隨后分化雌蕊原基(圖3(h));分化完全的花芽包括鱗片、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊原基(圖3(i)和(j));隨后在雌蕊原基中央開始分化心皮邊緣組織(圖3(k));進一步心皮邊緣組織融合形成單心皮子房(圖3(l))。

根據對早花和晚花類型進行統計分析發現,6月15日早花和晚花類型花芽大多數處于未分化階段,其比率分別為89%和95%。7月15日早花類型有70%處于分化初期,而晚花類型的70%處于分化初期。到8月15日早花類型有60%處于花瓣原基分化期,并且有30%的花芽已經進入雄蕊原基分化期;此時晚花類型的60%花芽處于萼片原基分化期,有10%花芽處于花瓣原基分化期,沒有花芽進入雄蕊原基分化期。9月15日早花類型的70%處于雄蕊原基分化期,有15%的花芽進入雌蕊原基分化期;晚花類型的70%花芽處于花瓣原基分化期,23%的花芽進入雄蕊原基分化期,沒有雌蕊原基分化期的花芽。到10月15日早花類型已經有90%的花芽完成了雌蕊原基的分化,而晚花類型只有60%的花芽完成雌蕊原基的分化(表2)。

表2 不同發育時期早花和晚花類型花芽分化所占比例

2.3 相關成花基因在野生櫻桃李早花和晚花花芽中的表達

對早花和晚花花芽分化過程中相關成花基因的表達進行分析,結果顯示,PsoLFY基因在7月15日和8月15日的早花花芽中其表達高于晚花,但在9月15日和10月15日的早花花芽中其表達量卻低于晚花類型(圖4(a))。PsoFT基因表達與PsoLFY基因相似,但在7月15日和8月15日的早花花芽中的PsoFT與晚花相比差距更大(圖4(b))。PsoFLC基因在7月15日的早花花芽中表達量高于晚花類型,其余的8月15日、9月15日和10月15日PsoFLC基因的表達都是晚花高于早花類型(圖4(c))。PsoTFL基因表達在早花與晚花花芽中差別不大(圖4(d))。

誤差線表示標準誤(SE)。數值為平均值±標準誤。

2.4 轉PsoRPM2基因煙草可以提早開花

本研究將PsoRPM2基因轉入煙草導致出現早花現象,共得到5個轉基因植系。對轉PsoRPM2基因煙草的早花性狀進行觀察發現,其中有1、2和5株系表現為早花,從愈傷再生到植株開花需要的天數分別為64、59和57 d,平均開花天數為60 d。而普通煙草在相同環境條件(4 000 LX光照強度、16 h光照時間、25 ℃)下生長1年左右時間才能開花(圖5(a))。轉基因株系3和4未表現為早花。另外3個轉PsoRPM2基因煙草在株高、葉片數和節間數方面都比同一時期的對照要多,尤其是花序數明顯高于對照(圖5(c))。

(a)野生型和轉PsoRPM2基因煙草表型圖;(b)PsoRPM2基因在不同轉基因煙草株系中的表達情況;(c)野生型和轉PsoRPM2基因煙草株系5生理性狀統計圖;(d)RT-PCR分析開花相關基因在野生型和轉PsoRPM2基因煙草株系5花芽和葉芽中的表達情況;(e)RT-qPCR分析開花相關基因及PsoRPM2基因在野生型和轉PsoRPM2基因煙草株系5花芽中的表達情況。株系W38為野生型煙草,株系1、2和5分別為轉基因煙草。

對轉PsoRPM2基因煙草花芽和葉芽中的相關成花基因進行RT-PCR分析。結果顯示,在葉芽中所有成花基因在轉PsoRPM2基因和對照之間沒有差異;但在花芽中,PsoLFY和PsoTFL基因在轉PsoRPM2基因和對照之間存在差異,而PsoSOC、PsoFLC、PsoSPL、PsoFT和PsoFD基因在兩者之間都沒有明顯差異(圖5(d))。進一步通過RT-qPCR分析轉基因株系3花芽中的成花基因表達,發現PsoLFY和PsoFT基因在轉PsoRPM2基因煙草花芽中的表達明顯高于對照,而PsoFLC和PsoTFL基因表達則明顯低于對照(圖5(e))。

2.5 野生櫻桃李早花和晚花類型芽中的PsoRPM2基因表達

上述研究表明轉PsoRPM2基因煙草可以促進植物提前開花,本研究進一步分析野生櫻桃李早花和晚花花芽與葉芽中的PsoRPM2基因表達。結果顯示,在6月15日PsoRPM2基因的表達量最低,同時在早花和晚花類型的花芽中其表達量幾乎沒有差異。到7月15日早花類型花芽中的PsoRPM2基因表達明顯高于晚花類型,兩者之間的差距最大。

在8月15日早花類型略高于晚花類型,但到9月15日和10月15日時早花和晚花類型花芽中的PsoRPM2基因表達幾乎沒有差異(圖6(a))。在早花和晚花類型的葉芽中PsoRPM2基因表達沒有明顯差異(圖6(b))。

2.6 野生櫻桃李PsoLFY與PsoRPM2的酵母雙雜分析

由于轉PsoRPM2基因株系花芽中的LFY基因表達明顯高于對照,同時在新疆野生櫻桃李7月15日成花誘導的花芽中PsoRPM2基因表達明顯高于晚花,本研究認為轉PsoRPM2基因植株之所以早花可能與LFY基因表達有關。因此進行了酵母雙雜試驗,結果顯示PsoRPM2與PsoLFY可以進行互作(圖7)。

3 討論與結論

野生資源是獲得果樹重要抗逆性狀的主要來源,是人們選育新品種開展生物技術研究的主要基因來源[29]。新疆櫻桃李原產于天山野果林,在中國僅分布在新疆伊犁地區霍城縣境內婆羅科努山的大西溝和小西溝,這一地區屬于溫帶荒漠區,野生果樹資源十分豐富,是栽培蘋果、杏、核桃、歐洲李和櫻桃李的起源中心,對研究果樹的起源、進化和演變具有重要意義[30-31]。在自然界,野生櫻桃李主要通過自然實生繁衍后代,形成了植株性狀、果實形狀、顏色、枝條和花等特征多種多樣的群體[32-33]。本研究通過對新疆野生櫻桃李物候期的觀察,發現其開花時間存在著較大差別,早開花和晚開花的類型開花時間大約相差14 d,表明新疆野生櫻桃李開花生物學具有多樣性。同時在植株高矮、枝條生長與節間長短、花形態、果實顏色和大小等方面也存在著較大差異[34]。

植物開花時間與花芽分化密切相關,花芽分化的進程是決定開花時間的主要因素[35]。從新疆野生櫻桃李花芽分化的階段來看,早開花與晚開花類型之間沒有明顯差異,兩者都經歷了未分化期、分化前期、分化初期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期,這一結果與李會芳等[35]和莫文娟等[36]的研究一致。但在花芽分化進程方面,早花類型各階段的分化時期明顯早于晚花類型,這可能是導致早花植株提前開花的原因之一。

成花基因在時間和空間上的特異表達對調控植物的開花起重要作用[10]。LFY基因是成花途徑中的關鍵基因,從多種植物中克隆并分析了LFY同源基因的功能[37]。在擬南芥中LFY基因在營養生長階段表達微弱,在花分生組織中有較強的表達[38]。在桃樹和山核桃中同源的LFY基因主要在成花誘導期及花芽形態分化初期表達[39-40]。FT和TFL1基因均屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白(Phosphatidyle-thanolamine-binding protein,PEBP)家族成員,具有保守的PEBP結構域,是開花調控網絡下游的2個重要基因,在調節植物開花中也起重要作用。FT與TFL1功能正好相反。FT促進成花轉換并啟動花發育,而TFL1抑制花原基形成[41]。其原因在于FT與TFL1通過競爭性結合FLOWERING LOCUS D (FD),從而調控下游LEAFY(LFY)基因的表達[42]。FLC基因是春花途徑中的關鍵基因,是抑制植物開花的基因,這種抑制是通過FLC基因抑制下游FT和SOC1這2個促進開花基因的表達而實現的。本研究中,PsoLFY和PsoFT基因在花芽分化前期(7月15日和8月15日),早花植株花芽中的表達高于晚花。此時,正值大多數早花植株花芽處于花芽誘導分化和花原基形成期,表明PsoLFY和PsoFT基因在新疆野生櫻桃李成花誘導和花原基形成階段起重要作用。PsoTFL基因在早花和晚花植株花芽中的表達幾乎沒有差別,表明該基因對開花時間的影響作用較小。而PsoFLC基因在7月15日的早花花芽中其表達量高于晚花類型,在其后的花芽分化階段都是晚花植株中的表達高于早花植株,并且這種差異隨著環境溫度的降低逐漸加大。表明PsoFLC基因在環境溫度較高的時期對花芽分化的影響作用較小,而在溫度較低的階段其抑制花芽分化的作用更明顯。

植物在環境脅迫下通常為了逃避逆境會加速生長提前開花,使植物能夠適當地縮短生長周期以應對脅迫[43]。在擬南芥中干旱脅迫可以加速植株開花,脫落酸(ABA)結合因子ABF3和ABF4通過轉錄調節花整合抑制因子FCONSTANS1(SOC1)基因的過度表達來調節干旱時的開花。表明ABFs和SOC1通過介導ABA信號加速開花,從而減輕干旱脅迫對繁殖產生的不利影響[44]。另外ABA還可以通過促進FLC的表達延遲開花[45]。本研究對PsoRPM2基因引起轉基因植株提早開花的現象研究發現,60%的轉psoRPM2基因植株表現為早花,同時轉基因煙草花芽中的LFY基因表達量高于對照;而其余成花基因在轉基因煙草中的表達與對照差異不大,表明在psoRPM2基因存在的植株中LFY基因可能對開花起著重要作用。同時對新疆野生櫻桃李早花與晚花單株分析psoRPM2基因的表達發現,在花芽分化的誘導期(7月15日)早花花芽中的psoRPM2基因表達明顯高于晚花,并且在7月15日和8月15日早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表達也高于晚花,說明psoRPM2基因可能與這2個基因存在著某種聯系。通過酵母雙雜實驗表明PsoRPM2與PsoLFY可以發生互作,但PsoRPM2與PsoFT之間沒有互作(結果未列出)。表明PsoRPM2可以通過與PsoLFY發生互作影響開花。

綜上,本研究表明新疆野生櫻桃李早花的原因在于花芽分化誘導期通過PsoRPM2與PsoLFY互作,提高了花芽中PsoLFY和PsoFT基因的表達,加快了花芽形態分化進程,從而導致植株早花。