背角無齒蚌和背瘤麗蚌中20種元素的積累特征

陳修報，姜濤，劉洪波，楊健

（中國水產科學研究院淡水漁業研究中心漁業微化學實驗室，江蘇 無錫 214081）

淡水貝類是淡水生態系統生物多樣性的重要組成部分，在淡水生態系統的物質循環和能量流動過程中發揮著重要作用，被譽為“生態系統工程師”[1-2]。此外，淡水貝類因具有活動范圍狹小、對污染物的高積累性和低代謝性、積累的污染物含量與水環境中污染物含量正相關等特點，被證實為評價水環境污染狀況的理想指示生物[3]。需要高度重視的是，由于受到水環境污染等因素的影響，全球淡水貝類資源量銳減[4-5]。從我國鄱陽湖里的特有物種背角無齒蚌（Anodonta woodiana）和國家重點保護的背瘤麗蚌（Lamprotula leai）來看，其資源量在過去的26 年間（1981—2007 年）分別下降了70%和40%[6]。背瘤麗蚌更是在2021年被列入國家二級重點保護野生動物。

元素根據生物功能可分為必需元素（包括常量元素和微量元素）和非必需/有毒元素[7-8]。從元素計量學的角度來看，生命體的物質基礎是元素[7]。不同物種的必需元素構成的穩態具有特異性[7]，如背角無齒蚌軟組織中Mn、Fe、Cu 和Zn 含量分別是斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）的71、3、7 倍和6 倍[9]。然而，非必需/有毒元素的積累可打破必需元素所構成的穩態，如Cd積累易破壞Ca穩態并擾亂其生物功能[10]，從而影響生物的生長發育甚至導致死亡[3，10]。由此可見，淡水貝類的元素積累特征關乎其種群資源量變化。前人對于淡水貝類的元素計量學研究主要聚焦于非必需/有毒元素[2-3]，鮮有同步分析必需元素和非必需/有毒元素及其兩者之間的耦合效應。

鑒于此，本研究擬探索資源量銳減的背角無齒蚌和國家重點保護的背瘤麗蚌對必需元素（常量元素Na、Mg、K、Ca；微量元素Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Mo）和非必需/有毒元素（Al、As、Sr、Cd、Ba、Tl、Pb）的積累量和積累相關性，進而進行元素積累評價，以期為我國淡水貝類的元素計量學及其對資源量影響提供必要參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

鑒于鄱陽湖中背角無齒蚌和背瘤麗蚌資源量銳減[5-6]，難以采到大量樣本，本研究于2019 年10 月在鄱陽湖都昌縣周溪鎮水域（29°06.8143′N，116°18.8464′E）采集規格一致的背角無齒蚌[殼長為（6.5±0.9）cm]和背瘤麗蚌[殼長為（6.9±0.4）cm]各5 個。兩種蚌均營底棲生活，活動范圍狹小。從貝殼年輪來鑒定，兩者均為2齡幼蚌。每種蚌各采集5個樣本，既可以滿足元素分析結果可靠性對樣本量的需求[11]，又盡可能地減少對其資源量的影響。

用不銹鋼解剖刀分離出蚌軟組織，然后用超純Milli-Q 水（電阻率為18.2 MΩ·cm，美國Millipore 公司）清洗樣本6遍，依次用電子天平（ME104E型，瑞士Mettler Toledo 公司）稱質量后放入80 ℃烘箱中干燥24 h 至質量恒定。根據軟組織的濕質量和干質量之比，得出背角無齒蚌和背瘤麗蚌軟組織的含水率分別為（78.3±13.2）%和（78.3±8.1）%。之后，用瑪瑙研缽將干燥的樣本磨成均一粉末狀。

1.2 元素測定

根據本實驗室建立的元素分析方法[12]，同步測定背角無齒蚌和背瘤麗蚌軟組織中必需元素（常量元素Na、Mg、K、Ca；微量元素Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Mo）和非必需/有毒元素（Al、As、Sr、Cd、Ba、Tl、Pb）含量。簡言之，精確稱量經80 ℃烘干24 h 并研磨均一化的粉末樣本（0.1±0.005）g 放入酸洗過的特氟隆消解管中，加入5 mL 濃HNO3（65%，德國Merck 公司），用微波消解儀（ETHOS A T260 型，意大利Milestone公司）進行徹底消解（120 ℃，10 min；170 ℃，15 min；再次170 ℃，15 min），最后轉移至酸洗過的特氟隆定容瓶并用Milli-Q 水定容至100 mL。應用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS；7500ce 型，美國Agilent 公司）同步分析這20 種元素。通過環境標準溶液（產品號：5183-4682，美國Agilent 公司）的添加及回收確認ICP-MS 的測量精度，所有元素的回收率為98%～110%。此外，應用標樣（NRC DOLT-5 鯊魚肝微量元素標準物質，加拿大）對元素進行準確性質控，元素的回收率為90%～110%。20 種元素的檢測限見表1。

表1 元素檢測限Table 1 Detection limits of elements

1.3 元素積累指數和殘留量指數的計算方法

為了總體評價背角無齒蚌和背瘤麗蚌的元素（包括必需元素和非必需/有毒元素）積累狀況，通過計算兩種蚌的元素積累指數（element accumulation index，EAI）進行比較分析[13]：

式中：N表示測定的元素種類，Ij指元素j的平均含量（x）與其標準差（δx）的比值。

此外，針對非必需/有毒元素，應用殘留量指數（Residual index，RI）評價其污染水平[14]：

式中，Ci指蚌中非必需/有毒元素i的含量測定值，Csi為非必需/有毒元素i的限量。其中，無機As、Cd和Pb的限量參考《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB 2762—2022）分別為0.5、2.0 μg·g-1和1.5 μg·g-1濕質量。背角無齒蚌軟組織中無機As 含量占As 的1.3%[15]；由于尚無背瘤麗蚌軟組織中無機As 含量的報道，因此參考我國常見淡水貝類中無機As 占總砷的平均含量為8.2%來計算[15]。鑒于目前我國水產品上還沒有Al、Sr、Ba 和Tl 的限量標準，因此它們暫不計入。當RI≤1 時，表明未受明顯污染；RI＞1 時，表明存在污染，且RI值越大代表污染越嚴重[14]。

1.4 統計分析

所有數據都以平均值±標準差的形式來表示。除了特殊說明之外，元素含量均以干質量計。應用SPSS 22.0 統計軟件的One-way ANOVA 分別檢驗背角無齒蚌和背瘤麗蚌中元素含量差異，進而用Mann-WhitneyU檢驗比較兩種蚌之間元素含量及殘留量指數差異。應用R 語言（4.0.2 版本）進行背角無齒蚌和背瘤麗蚌中元素積累的Pearson 相關性分析。P＜0.05表示差異水平或相關性顯著。

2 結果與分析

2.1 元素含量

2.1.1 必需元素含量

背角無齒蚌和背瘤麗蚌的常量元素（Na、Mg、K、Ca）含量見表2。背角無齒蚌中Na、Mg、K、Ca 含量差異不顯著（P＞0.05）。背瘤麗蚌中Ca 含量顯著高于K（P＜0.05），其余元素含量差異不顯著（P＞0.05）。背角無齒蚌和背瘤麗蚌相比較，兩者Mg和Ca含量相當（P＞0.05），而前者Na和K含量顯著低于后者（P＜0.05）。

表2 背角無齒蚌和背瘤麗蚌的常量元素含量（μg·g-1）Table 2 Concentrations of major elements in Anodonta woodiana and Lamprotula leai（μg·g-1）

背角無齒蚌和背瘤麗蚌的微量元素（Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Mo）含量見表3。背角無齒蚌中Fe含量顯著高于除Mn 之外的所有微量元素（P＜0.05），Zn 含量顯著高于Cu、Se、Ni、Co、Cr 和Mo（P＜0.05），Cu和Se 含量分別顯著高于Ni、Co、Cr 和Mo（P＜0.05）。背瘤麗蚌中Fe 含量亦顯著高于除Mn 之外的所有微量元素（P＜0.05），Zn 含量顯著高于Cr（P＜0.05），Ni 和Co含量均顯著高于Mo（P＜0.05）。背角無齒蚌和背瘤麗蚌中Mn、Fe、Co、Ni、Cu 和Zn 含量相當（P＞0.05），前者Se 和Mo 含量顯著高于后者（P＜0.05），而Cr 含量顯著低于后者（P＜0.05）。

表3 背角無齒蚌和背瘤麗蚌的微量元素含量（μg·g-1）Table 3 Concentrations of trace elements in Anodonta woodiana and Lamprotula leai（μg·g-1）

2.1.2 非必需/有毒元素含量

背角無齒蚌和背瘤麗蚌中非必需/有毒元素（Al、As、Sr、Cd、Ba、Tl、Pb）的含量見表4。背角無齒蚌中Ba、Al、Sr 含量顯著高于Tl（P＜0.05），Cd、Pb、As 含量差異不顯著（P＞0.05）。背瘤麗蚌中Ba、Al、Pb、Sr 含量高于其他元素（P＜0.05）。背角無齒蚌中Al、As、Sr和Cd含量均顯著高于背瘤麗蚌（P＜0.05）。

表4 背角無齒蚌和背瘤麗蚌中非必需/有毒元素的含量（μg·g-1）Table 4 Concentrations of non-essential/toxic elements in Anodonta woodiana and Lamprotula leai（μg·g-1）

2.2 元素相關性

背角無齒蚌和背瘤麗蚌中分別有37 對（圖1）和34 對（圖2）元素之間顯著相關。其中，必需元素Mg-Mo、Ca-Mn、Ca-Zn 和Mn-Zn 在兩種蚌中均呈顯著正相關（P＜0.05），此外，必需元素Ca、Mo 和非必需元素Sr（Ca-Sr、Mo-Sr）之間也呈顯著正相關（P＜0.05）。而必需元素Mg 和非必需元素Al（Mg-Al）以及必需元素Fe和非必需元素Tl（Fe-Tl）在兩種蚌中均呈顯著負相關（P＜0.05）。其余元素相關性在兩種蚌中表現出種間特異性。

圖1 背角無齒蚌元素含量的相關性Figure 1 Correlations between element concentrations in Anodonta woodiana

圖2 背瘤麗蚌元素含量的相關性Figure 2 Correlations between element concentrations in Lamprotula leai

2.3 元素積累評價

背角無齒蚌和背瘤麗蚌的元素（包括必需元素和非必需/有毒元素）平均含量與其標準差的比值（I）以及元素積累指數（EAI）見圖3。背角無齒蚌和背瘤麗蚌的EAI分別為3.7 和3.2，前者是后者的1.2 倍（圖3）。在此基礎上，進一步分析兩種蚌中非必需/有毒元素無機As、Cd 和Pb 的殘留量指數（RI）。由表5 可見，背角無齒蚌和背瘤麗蚌中Cd和Pb的RI均大于1。其中，無機As 和Pb 的RI 在兩種蚌之間差異不顯著（P＞0.05），而前者Cd的RI顯著高于后者（P＜0.05）。

圖3 背角無齒蚌和背瘤麗蚌的元素平均含量與其標準差的比值（I）以及元素積累指數（EAI）Figure 3 Ratio of the mean element concentrations to its standard deviation（I）and element accumulation indexes（EAI）of Anodonta woodiana and Lamprotula leai

表5 背角無齒蚌和背瘤麗蚌中非必需/有毒元素殘留量指數Table 5 Residue indexes of non-essential/toxic elements forAnodonta woodiana and Lamprotula leai

3 討論

3.1 背角無齒蚌和背瘤麗蚌的元素積累特征

鄱陽湖中背角無齒蚌和背瘤麗蚌的資源量銳減[5-6]，處于亟需保護的受威脅狀態[5-6]。正因如此，背瘤麗蚌被新列為國家二級重點保護野生動物。雖然本研究分析的背角無齒蚌和背瘤麗蚌僅采集一次且各有5 個，但是這已是當時調查時所能采到的全部樣本。盡管如此，貝類監測因具有活動范圍狹小、對非必需/有毒元素高積累而低代謝且積累量與水環境含量正相關等特征，基于一次采集的小樣本量（每個位點最低可至3 個樣本）已能有效反映出貝類及水環境的元素積累狀況[11，16-17]。例如，陳修報等[16]通過分析采自太湖梅梁灣和云南茈碧湖的各5 個背角無齒蚌，有效反映出兩個水域的元素背景；Varol 等[17]通過在每個監測位點采集3～8 個珠蚌Unio elongatulus eucirrus進行元素分析，有效反映出土耳其凱班大壩水庫（Keban Dam Reservoir）元素積累時空動態。

淡水貝類通過易化擴散、主動運輸和細胞內吞作用吸收水環境中必需元素和非必需/有毒元素[3]。貝類對元素的積累受到外因（如水環境條件）和內因（如貝類規格、元素積累性能）共同影響[18]。在元素含量高的水環境中，貝類軟組織的元素積累量相應增加[16]。而由于“生長稀釋”效應，在幼蚌階段可能出現生長迅速的貝類的元素含量低于小規格個體的情況[19-20]。本研究中背角無齒蚌和背瘤麗蚌來自鄱陽湖都昌縣周溪鎮的相同水環境，且兩者規格一致，因此，兩種蚌的元素積累差異應歸結為它們對元素積累性能之間的差別。

必需元素具有構成組織成分、作為酶的輔基或酶的激活劑、作為體液中的電解質以維持滲透壓及酸堿平衡并保持細胞形態、維持神經和肌肉的正常敏感性等重要生理功能[21]。在常量元素中，背瘤麗蚌Ca 含量顯著高于K，這不同于背角無齒蚌的Ca和K含量相一致。Ca 對淡水貝類至關重要，不僅是肌肉系統的關鍵組成成分[21]，軟組織中積累的Ca 還是貝殼形成的Ca 源[22]。背瘤麗蚌屬于“厚殼型”貝類，而背角無齒蚌屬于“薄殼型”貝類，相似規格的背瘤麗蚌貝殼質量是背角無齒蚌的4倍[23-24]，因此，背瘤麗蚌軟組織對Ca 的需求量要大于背角無齒蚌。盡管如此，背瘤麗蚌軟組織中K 和Na 含量仍顯著高于背角無齒蚌。K和Na 分別是細胞內、外最主要的陽離子[21]，可通過Na-K 泵在調解滲透壓平衡過程中發生重要作用[25]，提示背瘤麗蚌對體液中電解質濃度的需求量要高于背角無齒蚌。

在微量元素中，背角無齒蚌和背瘤麗蚌的共性特征是總體上Mn和Fe含量最高，Zn和Cu含量次之，而Mo 含量最低。在淡水貝類中，Mn 含量高是較為普遍的現象[26]，甚至超過常量元素Na 和K[22]，提示Mn 對淡水貝類具有特殊意義。Mn 是丙酮酸羧基化酶、超氧化物氣化酶等酶類的激活劑[21]。此外，Mn 在淡水珠蚌Unio pictorum mancus中還起到抗氧化作用，其Mn含量與抗氧化能力呈正相關的趨勢[26]。由于背角無齒蚌和背瘤麗蚌軟組織中Mn含量遠高于作為酶輔基或酶激活劑的需求量，因此，這兩者積累的Mn可能發揮抗氧化作用。Fe 是構成血紅蛋白的組分，且是過氧化物酶、過氧化氫酶、羥基酶和黃酮酶的激活劑[20]。然而，淡水貝類是以血藍蛋白（含Cu 呼吸蛋白）為氧氣運輸載體。因此，Fe 在背角無齒蚌和背瘤麗蚌中可能更多發揮酶的輔基或酶的激活劑作用。Cu 對生物功能具有“雙刃劍”作用。Cu 含量較低時，促進淡水貝類的生長發育，而其積累量較高時，則誘導機體產生過量的活性氧引發氧化損傷[27]。劉凱等[28-29]研究發現背角無齒蚌軟組織中Cu積累量達到100μg·g-1，便可造成背角無齒蚌外套膜出現細胞壞死以及斧足黏液細胞變形和上皮層損傷。本研究中背角無齒蚌和背瘤麗蚌軟組織中Cu 平均積累量分別高達192.7μg·g-1和193.3 μg·g-1。與Cu 類似，背角無齒蚌和背瘤麗蚌對Zn也表現出高積累，這可能是由于Cu和Zn是鄱陽湖流域沉積物中主要累積的元素[30]，淡水貝類營底棲生活會從沉積物中吸收大量Cu和Zn[31]。如此高的Cu 和Zn 積累量對背角無齒蚌和背瘤麗蚌的組織損傷及種群資源量的影響有待于進一步的研究。Mo是構成醛氧化酶和黃嘌呤氧化酶的組分[21]。Mo在背角無齒蚌和背瘤麗蚌中含量總體較低，這與前人研究結果相吻合[32]。盡管如此，背角無齒蚌中Mo 含量仍達到背瘤麗蚌的7 倍，提示背角無齒蚌對Mo 可能具有更高的生理需求。Se 是抗氧化劑，構成抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶的組分[21]。背角無齒蚌中Se含量顯著高于背瘤麗蚌，表明背角無齒蚌具有更強的抗氧化性能，Bielen 等[33]研究也證實了背角無齒蚌具有更強的抗逆性。Cr 在葡萄糖的利用過程中發揮重要作用[21]。然而，過量的Cr積累也會對淡水貝類產生毒性效應。張琦等[34]發現Cr 是影響湘江流域無齒蚌和背瘤麗蚌等貝類群落結構的關鍵因素之一。本研究中背瘤麗蚌軟組織中Cr含量較背角無齒蚌高6倍，平均達到416.4 μg·g-1，其對鄱陽湖中背瘤麗蚌資源的影響有待于進一步考證。

不同于必需元素的積累易受到生理調控影響，貝類對非必需/有毒元素的積累往往與其在水環境中的含量呈正相關[3]。背角無齒蚌中Al、As、Sr 和Cd 含量顯著高于背瘤麗蚌，其余非必需/有毒元素在兩者中含量相當，表明背角無齒蚌對這些非必需/有毒元素具有更高積累性。這與殘留量指數（RI）分析結果相一致。此外，兩種蚌的RI顯示其生存的鄱陽湖都昌縣周溪鎮水域可能受到Cd和Pb污染。劉佳偉等[30]研究也顯示鄱陽湖流域由于受到人為工農業活動影響導致重金屬污染，其沉積物中Cd達到中等危害水平，Pb 和As 處于輕微危害水平。水環境的非必需/有毒元素污染或在貝類體內過量積累可影響貝類的生長甚至存活[3]。下一步有必要對鄱陽湖非必需/有毒元素污染狀況進行全面監測，并分析湖中背角無齒蚌和背瘤麗蚌的資源動態與水環境Cd、Pb 和無機As 含量之間的關聯性。

當水生動物中Cr、Cd 或Pb 積累量高于100 μg·g-1，Ni、Cu、Se、Al或As積累量高于1 000μg·g-1，Mn或Zn積累量高于10 000μg·g-1，被認為是對它們具有超積累性[35]。由此可見，本研究中的背角無齒蚌對必需元素Mn 和非必需/有毒元素Al、Cd、Pb 具有超積累性，而背瘤麗蚌對必需元素Mn和非必需/有毒元素Pb具有超積累性。盡管如此，元素積累指數（EAI）結果顯示背角無齒蚌總體較背瘤麗蚌對元素具有更高的積累能力。這可能是由于前者對元素具有更高的吸收率和（或）更低的排放率所致。前人研究也顯示，背角無齒蚌的元素積累能力總體高于其他淡水貝類，如斑馬貽貝[9]、褶紋冠蚌（Cristaria plicata）[36]、圓頂珠蚌（Unio douglasiae）[36]和三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[37]等。正因如此，背角無齒蚌被確定為“淡水貝類觀察”研究體系的專用指示生物[2]。

3.2 背角無齒蚌和背瘤麗蚌的元素積累相關性

本研究中背角無齒蚌和背瘤麗蚌生存于相同的水環境，可是它們分別有37 對和34 對元素之間顯著相關，而在兩者中共同相關的元素僅有8 對，表明淡水貝類的元素積累相關性具有明顯的種間特異性。這可能是由于不同物種的元素積累動力學（包括對元素的吸收率、同化率、排出率等）差異造成的[38]。需要指出的是，目前關于淡水貝類的元素積累動力學研究尚處于起步階段[2]，急需加強該領域的深入研究。

具有相似理化性質（如原子大小、離子價態）的元素，若在積累過程中表現為協同關系，則元素之間呈正相關[39-40]；相反，若表現為拮抗關系，則元素之間呈負相關[39-40]。其中，必需元素之間的正相關積累，對淡水貝類往往發揮有益作用。例如，在背角無齒蚌和背瘤麗蚌中Mg-Mo、Ca-Mn、Ca-Zn、Mn-Zn、Ca-Sr 和Mo-Sr 之間均顯著正相關，這將有利于它們的生長、發育及存活。與之相比，更需重點關注非必需/有毒元素對必需元素負相關積累的危害作用。例如，Al在背角無齒蚌中與Mg、Ca、Mn、Fe、Zn 和Mo 含量顯著負相關，在背瘤麗蚌中亦與Mg含量顯著負相關，這勢必會造成兩種蚌的Al過度積累，引發Mg、Ca、Mn、Fe、Zn 和Mo 的流失，從而破壞電解質/滲透壓平衡、導致新陳代謝失調并產生基因毒性[41]。因此，在背角無齒蚌和背瘤麗蚌等淡水貝類資源保護過程中，還需重視非必需元素（如Al、Tl、Ba）積累對必需元素的負相關作用影響。

4 結論

（1）背角無齒蚌對Mn、Al、Cd 和Pb 具有超積累性，而背瘤麗蚌對Mn和Pb具有超積累性。兩者相比較，背角無齒蚌的元素積累能力總體高于背瘤麗蚌。

（2）背角無齒蚌和背瘤麗蚌的元素積累相關關系具有種間特異性。其中，非必需/有毒元素（如Al、Tl、Ba）對必需元素的負相關作用需引起重視。

（3）背角無齒蚌和背瘤麗蚌的殘留量指數揭示鄱陽湖都昌縣周溪鎮水域受到Cd 和Pb 污染。這些元素對淡水貝類資源量的影響有待于進一步研究。