年齡軌跡對細菌性陰道病女性陰道-宮頸宏基因組菌群的影響

陸瑞科,陳晨,高紅琴,王小雨,李少華,郝梨嵐,黃新程,關凌耀,張韻紅*

女性生殖道微生態因其對女性生殖健康的重要作用而受到日益重視,陰道內微生物群落與宿主、環境之間相互制約、相互協調,共同維系生殖道的動態平衡。乳桿菌或乳酸桿菌一直被認為是陰道微生物菌群的關鍵物種。這些微生物產生的乳酸有助于保持陰道處于pH值3.5～4.5的酸性環境,從而抵御致病微生物。臨床上能夠明確診斷病因和不明原因的女性生殖道疾病,都存在不同程度的陰道微生態失衡,包括各類陰道炎、盆腔炎、不孕、早產等。但是目前對于生殖道菌群與細菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV)的研究主要集中在育齡期女性,對于更年期以及絕經后女性的研究比較少,同時目前基于女性生殖道微生態系統研究多局限于16S rRNA基因測序方法研究,采用宏基因組鳥槍法測序技術的研究非常缺乏。宏基因組鳥槍法研究能避免16S rRNA基因擴增子測序的研究在分類學上對細菌種水平分辨率較低和缺乏物種特異性功能推斷能力的局限[1];可以從細菌、真菌、病毒等多維度描繪菌群特征。本研究擬采用宏基因組鳥槍法,探索BV與35～65歲女性下生殖道微生物的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

招募蘇州高新區2018年7月至2022年9月參與 “兩癌”篩查項目的女性,年齡35～65歲,現場充分知情告知并簽訂知情同意書者入組。采集這些志愿者的宮頸分泌物樣本、對應的個人信息,涉及臨床診斷相關資料來自“兩癌”篩查項目,資料和樣本齊全者納入分析,個人信息進行匿名處理。

從入組的女性中篩選125名BV女性為BV組,以107名健康女性作為對照組。由于研究人群是從兩癌篩查的現場招募,每天篩查量超過100人,故篩查現場對BV的診斷是臨床醫生結合臨床與實驗室檢查情況做出的簡化診斷,具體為:① 受檢人自述有臨床癥狀,如分泌物增多、有魚腥臭味,外陰有瘙癢或燒灼感等;② 陰道分泌物異常;③ 發現線索細胞;④ 陰道黏膜無明顯異常。入組標準:① 根據“兩癌”篩查對分泌物檢查的診斷結果進行篩選,BV組女性診斷結果為BV,且未合并其他疾病,對照組女性診斷結果為正常;② BV組和對照組HPV檢查均為陰性,無HPV、CIN以及子宮頸癌既往史;③ BV組和對照組均沒有檢測出子宮肌瘤、子宮腺肌病、宮頸息肉、霉菌性陰道炎等其他疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集和處理 志愿者在進行婦科檢查時,由醫生進行采樣,具體為使用無菌植絨拭子采集宮頸外口處的黏液,旋轉10～20圈,充分蘸取足量分泌物,將拭子頭折斷后置于裝有專用微生物保存液的保存管中,擰緊蓋后常溫保存。兩周之內寄往實驗室,并于-80℃冰箱保存。通過上述篩選標準,篩選出BV組和對照組。

1.2.2 微生物基因組總DNA提取及測序 采用美基生物通用型DNA抽提試劑盒(MagPure Universal DNA KF Kit)對宮頸分泌物樣本進行DNA提取,隨后用Qubit dsDNA HS assay kit對DNA產物進行定量。將DNA樣本進行測序文庫構建后,通過國產測序平臺DIPSEQ(華大基因,深圳)進行宏基因組鳥槍法測序(雙端測序,100 bp)。

1.2.3 物種注釋及菌群類型 對測序數據進行去除低質量序列、去除人源序列以及利用MetaPhlAn3軟件進行物種注釋。注釋結果選取種水平進行分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 女性陰道-宮頸菌群分布特點

BV組125名女性平均年齡(50±9)歲,對照組107名女性平均年齡(49±8)歲,兩組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。通過聚類方法將所有人群分成7種類型,分別為Type 1:以惰性乳桿菌(Lactobacillusiners)為主導;Type 2:以卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)為主導;Type 3:以加德納菌(Gardnerellavaginalis)為主導; Type 5:以二路普雷沃菌(Prevotellabivia)為主導;Type 6:以普雷沃菌(Prevotellatimonensis)和Sneathiaamnii為主導;Type 7:以安氏普雷沃菌(Prevotellaamnii)為主導;而Type 4:雜型(Diverse),為多種不同的、人群占比較少的亞型集合,即某種菌的相對豐度大于50%以上為一種亞型,且每種亞型數量都很少,包括皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)或兩岐雙岐桿菌(Bifidobacteriumbifidum)。占比相對其他幾種Type,Type 1、Type 2、Type 3主導菌在樣本中的相對豐度更高,菌群結構更單一。人群中占比最多的類型是惰性乳桿菌型(Type 1),約占人群的27.16%,其次是加德納菌型(Type 3),占人群的15.09%。而卷曲乳桿菌型(Type 2),僅占人群的10.78%,遠遠低于已報道的育齡女性人群的占比[2]。Type 5、6、7均屬于普雷沃菌屬主導的類型,其總和在人群的占比高達25%以上,遠高于已報道的育齡女性的人群占比[2]。詳見圖1(彩插1)。

2.2 BV對女性陰道-宮頸菌群類型的影響

與對照組的菌群類型進行對比,發現BV組女性乳桿菌型的含量整體下降(41% vs 35%),主要由惰性乳桿菌型(Type 1)貢獻,其在BV組比例(25%)低于對照組(30%),而卷曲乳桿菌型(Type 2)在兩組人群中占比保持一致(對照組:11%;BV組:10%)。加德納菌型(Type 3)在BV組女性的比例(19%)遠高于對照組(10%)。說明相對于健康女性來說,BV女性下生殖道的乳桿菌含量下降,并伴隨著加德納菌的增加。此外,安氏普雷沃菌(P.amnii)型(Type 7)在BV組的比例高于對照組。詳見圖2,彩插1。

2.3 影響BV女性陰道-宮頸的相關菌群標志物

在種水平上,采用Wilcoxon秩和檢驗的方法對BV組和對照組的陰道-宮頸菌群進行差異性比較,尋找影響BV的相關菌群標記物。結果發現,相比對照組,BV組女性陰道-宮頸部位的加德納菌(Gardnerellavaginalis)和皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)相對豐度顯著增加(Q<0.05),此外人型支原體(Mycoplasmahominis)、解脲支原體(Ureaplasmaurealyticum)、安氏普雷沃菌(P.amnii)、相對豐度也有增加的趨勢(P<0.05,Q>0.05);而海氏嗜凍菌(Peptoniphilusharei)、咽峽炎鏈球菌(Streptococcusanginosusgroup)和解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)相對豐度有減少的趨勢(P<0.05,Q>0.05),詳見圖3,彩插1。

2.4 衰老對BV女性陰道-宮頸的菌群影響

為進一步探索衰老對于BV女性陰道-宮頸菌群的影響,按年齡將人群分為4個亞組:中年對照組(<50歲;平均年齡43±4歲;55人)、中年BV組(<50歲;平均年齡42±5歲;61人)、老年對照組(≥50歲;平均年齡56±4歲;52人)、老年BV組(≥50歲;平均年齡57±4歲;64人)。中年兩亞組和老年兩亞組年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05)。研究發現,盡管中年BV組相對于中年對照組惰性乳桿菌型(Type 1)大幅度下降(中年對照組:44%;中年BV組:33%),但加德納菌型(Type 3)增加的并不明顯(中年對照組:2%;中年BV組:5%);而老年組則相反,乳桿菌型主要變化在卷曲乳桿菌型,在BV組沒有發現這種類型(老年對照組:4%;老年BV組:0),而加德納菌型(Type 3)在BV組明顯增加(老年對照組:19%;老年BV組:33%)。此外,以二路普雷沃菌(Prevotellabivia)為主導的Type 5和以安氏普雷沃菌(Prevotellaamnii)為主導的Type 7在老年BV組有明顯增加,而以多種雜型為主的Type 4大幅度減少。整體來說,相比中年組,老年組中BV對菌型影響明顯大得多。詳見圖4,彩插2。

圖5A-5B(見彩插2)分別展示了中年組、老年組影響BV的相關菌群標記物,也再次證實了老年組中BV對菌群的影響較大,即老年組BV相關的微生物標記物更多。老年組中,加德納菌(G.vaginalis)、人型支原體(M.hominis)和解脲支原體(U.urealyticum)等在老年BV組中顯著增加(P<0.05),而大芬戈爾德菌(Finegoldiamagna)、解糖胨普雷沃菌(P.disiens)、普雷沃菌(P.timonensis)等在老年對照組中顯著富集(P<0.05)。而在中年組中,只發現兩個BV相關的微生物標記物,皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)和Alcelaphine gammaherpesvirus 1病毒在中年BV組中富集。意外的是,加德納菌、支原體等一些常見的與BV相關菌在中年組女性中并不顯著。而年齡對乳桿菌及加德納菌的影響更大,圖5C-5D(見彩插2),結果顯示不論是健康的中年和老年女性之間,還是都患有BV的中年和老年女性之間,老年女性惰性乳桿菌(L.iners)和卷曲乳桿菌(L.crispatus)都顯著下降(P<0.05),而加德納菌(G.vaginalis)顯著增加(P<0.05)。尤其是針對BV患者,除了報道常見的BV相關菌加德納菌,還有解脲支原體(U.urealyticum)、微量需氧戴阿利斯特桿菌(Dialistermicraerophilus)、柯氣球菌(Aerococcuschristensenii)都在老年BV組中明顯富集(P<0.05,Q<0.05)。綜上所述,年齡對女性生殖道菌群影響非常大。以年齡為軸線,針對性去診斷和治療BV是很有必要的。

3 討論

陰道菌群在維持女性生殖健康上起著非常關鍵的作用。乳桿菌被認為是維持健康女性陰道環境最重要的陰道微生物。育齡女性體內較高的雌激素水平,使其陰道黏膜增厚,機體內豐富的糖原或糖原水解產物非常有利于乳桿菌的生長。乳桿菌產生乳酸和細菌素,維持陰道較低的pH值,抑制有害菌的繁殖[3]。目前認為,女性健康的陰道微生態環境是以乳桿菌占絕對優勢,且菌群多樣性越簡單越好[4];而“不健康”的陰道菌群環境表現為少或無乳桿菌、多種厭氧菌共存,菌群的多樣性較高[4],這種環境極大增加了BV的感染風險。BV是全球育齡期女性普遍存在的下生殖道感染,可引起孕婦早產、盆腔炎、產后子宮內膜炎及增加性傳播疾病,如淋病、HIV、HPV、HSV-2等感染風險[5-7]。多項研究已證明,BV患者的陰道菌群發生了明顯的轉變,即以乳桿菌為主的菌群,被大多數的兼性和嚴格厭氧菌所替代。

本研究選取的232名女性具有較大的年齡跨度(35～65歲),包含125名BV女性,平均年齡(50±9)歲,以及107名健康女性,平均年齡(49±8)歲。Ravel等[2]曾對396名來自5個種族育齡女性的陰道菌群進行16S rRNA基因測序,將陰道菌群分成5種類型,其中4種以乳桿菌為主,分別是卷曲乳桿菌(L.crispatus)、惰性乳桿菌(L.iners)、加氏乳桿菌(L.gasseri)和詹氏乳桿菌(L.jensenii),第5種是以少乳桿菌,高比例的厭氧菌為主,包括加德納菌(G.vaginalis)、陰道阿托波氏菌(Atopobiumvaginae)等。Jie等[8]通過對516名平均年齡在30歲的健康中國女性陰道菌群的宏基因組研究,發現卷曲乳桿菌型、惰性乳桿菌型以及加德納菌型是人群中最為主要的類型,分別占人群的24.61%、22.67%以及19.19%。在本研究中,不論健康人群還是BV人群,以卷曲乳桿菌為優勢菌的類型大大降低,僅占人群的10.78%左右。而惰性乳桿菌型的含量有所增加,尤其是對照組女性,在人群中比例占到30%。加德納菌是感染BV發生的關鍵菌,加德納菌會分泌毒性因子并黏附在宿主的上皮細胞,形成生物膜菌落,將乳桿菌在陰道環境中的生態位競爭掉[9]。在本研究中,對照組健康人群和BV組人群中加德納菌型也存在顯著差異(10% vs 19%)。除此之外,與既往報道的研究一致[10],人型支原體(M.hominis)、解脲支原體(U.urealyticum)也顯示在BV女性中富集。

目前對于陰道菌群的研究多集中在育齡女性,對于進入圍絕經期和絕經期的女性,研究非常有限。隨著女性年齡的增大,雌激素水平大大降低,特別是進入圍絕經期后,女性雌激素水平更是呈斷崖式下降。匱乏的雌激素水平很難為乳桿菌提供充足的糖原。因此,進入這一階段的女性,乳桿菌基本上不再是陰道的優勢菌,陰道菌群由育齡期較單一的菌群結構變為多樣性更高的菌群結構。在陰道菌群變化如此巨大的時候,BV對陰道菌群有何影響還有待進一步研究。

因此,本研究按50歲為界限,將人群分為中年組和老年組,分別比較了BV對不同年齡陰道菌群的影響。結果發現,BV對老年組女性陰道菌群影響更大。前面提到的加德納菌(G.vaginalis)、人型支原體(M.hominis)、解脲支原體(U.urealyticum)等BV相關的常見微生物標記物在老年組存在顯著差異。但這些標記物在中年組都不顯著,只有皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)和Alcelaphine gammaherpesvirus 1病毒顯示在中年BV組中富集。此外,老年BV患者相對中年BV患者,加德納菌(G.vaginalis)、解脲支原體(U.urealyticum)等更容易富集,也提示隨著年齡增加,BV對陰道菌群的影響可能也更加復雜。

此外,本研究在BV的診斷上存在一定的局限性。目前臨床上的金標準為Amsel法,即包含:① 鏡檢下有線索細胞;② 分泌物異常;③ 陰道pH>4.5;④ 胺試驗陽性(有魚腥臭味),滿足上述4條中的3條,即可診斷為BV。由于本研究的人群是從蘇州兩癌篩查的現場招募,現場每天的篩查量超過100人。大人群量篩查和檢測很難完全遵從嚴格的Amsel標準。篩查現場對BV的診斷是臨床醫生結合臨床與實驗室檢查情況做出的簡化診斷,具體為:① 受檢人自述有臨床癥狀,如分泌物增多、有魚腥臭味,有外陰瘙癢或燒灼感等;② 陰道分泌物異常;③ 發現線索細胞;④ 陰道黏膜無明顯異常。因有相當一部分BV患者為無癥狀患者,臨床治療BV的指征之一是有BV癥狀,第1點對于篩出有癥狀的BV很有必要;而第2～3點是Amsel標準中的其中兩條,陰道分泌物一般由臨床醫生肉眼觀察,分泌物是否灰白色,均質、稀薄特征,是否常黏附于陰道壁,容易將分泌物從陰道壁拭去;線索細胞是通過高倍鏡進行觀察,鏡檢下見到陰道上皮細胞邊緣呈顆粒狀或點狀桿菌聚集即為線索細胞,它是BV最敏感最特異的體征之一。第4點也是由臨床醫生肉眼觀察,一般需要陰道黏膜無充血的炎癥表現,且無出血點,來排除合并其他陰道炎癥的患者。綜上所述,盡管本研究存在大樣本人群檢測的局限性,對BV的臨床診斷僅包含了Amsel金標準中的其中兩條,但自述臨床癥狀也是篩選有癥狀BV的有利手段,從臨床角度來看,本研究的診斷方法有較高的檢出率,對于BV的診斷也有一定的臨床意義。

本研究通過宏基因組鳥槍法描述了35～65歲女性的下生殖道菌群結構,構建出中國蘇州大齡女性的陰道微生物圖譜。同時,通過分年齡段對BV女性和健康女性的陰道菌群進行比較,分別找出了中年和老年女性BV相關的菌群標志物,為后續以年齡為軸線,針對性進行BV的診斷、治療提供了重要的參考依據。

致謝:感謝深圳華大生命科學研究院(深圳國家基因庫)為本研究提供的樣本存儲、提取、測序等支持。