LPS與ATP共同誘導小鼠原代腹腔巨噬細胞焦亡模型的建立①

劉慧玲 吳傳新 龍賢梨 李 麗 李 飛 郭 暉 孫 航

（重慶醫科大學附屬第二醫院病毒性肝炎研究所，重慶 400010）

細胞焦亡是一種依賴半胱天冬蛋白酶（caspase-1/-4/-5/-11）活化的炎癥細胞死亡方式，其形態介于細胞凋亡和細胞壞死之間，且細胞焦亡的發生機制和調控機制與凋亡和壞死大不相同［1］。一直以來的觀點認為在感染性疾病中，免疫細胞的耗竭主要由細胞凋亡引起，然而近年來在HIV 感染的研究中發現CD4+T 細胞的耗竭不僅有凋亡參與，也有焦亡參與，這種炎癥性細胞死亡方式將更多的免疫細胞吸引到感染區域，最終對免疫系統造成嚴重破壞［2］。后續的研究進一步證實僅有5%的CD4+T 細胞耗竭由凋亡引起，而95%的CD4+T 細胞耗竭由caspase-1誘導的焦亡引起［3-4］。

研究發現在多種微生物感染中，caspase-1 的激活是一種宿主防御機制，感染過程中的局部炎癥會增強組織破壞和病原體傳播，但隨著感染的進展，caspase-1 的激活會限制病原體的復制，增強先天和適應性免疫反應，但若感染持續存在，焦亡可造成免疫細胞過度死亡，導致免疫耗竭，引起機體的免疫抑制狀態［1］。因此適宜的細胞焦亡是機體抵御病原入侵的重要機制，但過度激活細胞焦亡可使機體免疫失調進而加重炎癥反應，嚴重時可導致器官功能障礙，甚至威脅生命［5］。

鑒于細胞焦亡在應對外來病原感染時產生的“雙刃劍”作用，越來越多的科研人員開始關注這種特殊的炎癥性細胞死亡方式，并探索其對感染性疾病發生發展的作用機制。目前國內外研究細胞焦亡時的動物模型多使用不同濃度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠發生膿毒癥［6-7］；或直接使用基因敲除小鼠［8-9］。體外模型則多為LPS 單獨作用于細胞或LPS 和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（或其他細菌）共同誘導細胞焦亡［7，10-13］，但LPS 和ATP 的使用濃度及時間均不相同，且無法準確反映焦亡的發生率。本研究旨在通過LPS 和ATP 共同誘導巨噬細胞焦亡，并使用流式細胞術檢測焦亡發生率，探索LPS 和ATP 共同誘導細胞焦亡的最佳條件，為研究免疫細胞焦亡的分子機制提供穩定可靠的體外焦亡模型。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡SPF級雄性C57BL/6購自常州卡文斯實驗動物有限公司。LPS、ATP 購自美國Sigma 公司；DMEM 由本實驗室制備；胎牛血清（life）、青-鏈霉素復合溶液購自湖北賽維爾生物科技有限公司；Annexin V-PE/7-AAD（貨號：559763）、F4/80（貨號：565410）、CD-11b（貨號：557657）購自美國BD 公司；瑞氏-吉姆薩復合染液購自北京雷根生物技術有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；GSDMD（貨號：ab209845）、caspase-11（貨號：ab246492）、IL-1β（貨號：ab234437）、HMGB1（貨號：ab18256）購自英國Abcam 公司；caspase-1（貨號：D7F10）、ASC（貨號：D2W8U）、NLRP3（貨號：D4D8T）、IL-18（貨號：E8P5O）購自美國CST公司；IL-1β ELISA 試劑盒（貨號：CME0015）、TNF-α ELISA 試劑盒（貨號：CME0004）購自北京四正柏生物科技有限公司；流式細胞儀（CytoFLEX）購自德國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代腹腔巨噬細胞的分離及培養 6～8 周齡C57BL/6 小鼠腹腔注射1 ml 3%硫乙醇酸鹽溶液，3 d 后，用預冷的PBS 洗出小鼠腹腔液，400 g、4 ℃離心10 min，重懸于10%DMEM 完全培養基中。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養2 h 后，洗去懸浮細胞，余下的貼壁細胞即為原代腹腔巨噬細胞，更換為新鮮的10%DMEM 完全培養基，在培養箱中培養過夜。

1.2.2 原代腹腔巨噬細胞形態觀察 使用倒置光學顯微鏡觀察貼壁后的巨噬細胞形態；瑞氏-吉姆薩染色進一步觀察細胞形態，原代巨噬細胞接種于細胞爬片，貼壁后棄上清，多聚甲醛固定，晾干，瑞氏-吉姆薩復合染液滴加于整個爬片上，加入等量PBS，充分混合，水洗，干燥，鏡檢。

1.2.3 原代腹腔巨噬細胞純度檢測 貼壁后的原代腹腔巨噬細胞使用胰酶消化，EP 管收集細胞懸液，PBS 洗3 次，適量PBS 重懸，加入5%體積的F4/80 抗體，避光4 ℃孵育30 min，PBS 洗3 次，200 μl PBS重懸，流式細胞儀檢測。

1.2.4 PE Annexin-V/7-AAD 檢測細胞焦亡 分離出原代腹腔巨噬細胞，接種于24 孔板，每孔細胞約1×105個。貼壁后培養基更換為無血清的DMEM，根據HUANG 等［14］的研究，確定LPS 的濃度和作用時間分別為500 ng/ml 和24 h。將巨噬細胞隨機分為500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 1 h、500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 2 h、500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 4 h 和500 ng/ml LPS 24 h+3 mmol/L ATP 6 h，4 mmol/L ATP、5 mmol/L ATP 和6 mmol/L ATP 分組同3 mmol/L ATP，之后使用Annexin-V/7-AAD試劑盒檢測焦亡發生率。

1.2.5 實驗分組及處理 確定ATP 作用的最適濃度及時間后，后續實驗分為4 組：①control 組：差異貼壁的巨噬細胞培養基中加入無菌PBS 溶液；②LPS 組：500 ng/ml 的LPS 誘 導 巨 噬 細 胞24 h；③ATP 組：5 mmol/L 的ATP 刺 激 巨 噬 細 胞4 h；④LPS+ATP 組：500 ng/ml 的LPS 誘導24 h 后再加入5 mmol/L的ATP刺激4 h。

1.2.6 Western blot 檢測細胞焦亡蛋白表達 各組細胞棄培養基，PBS 洗滌2 次，裂解細胞，收集蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，采用SDS-PAGE 80 V 電泳20 min 后轉120 V 電泳60 min，300 mA 轉膜60 min，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST 洗膜3 次，15 min/次。分別用β-actin（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、caspase-11（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）和HMGB1（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育90 min，TBST 洗膜3 次，電化學發光法（ECL）檢測蛋白條帶。以目的蛋白與β-actin的灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

1.2.7 ELISA 檢測IL-1β和TNF-α的表達水平 收集各組細胞培養上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，通過標準曲線計算各組上清液中IL-1β 和TNF-α含量。

1.2.8 電鏡觀察細胞焦亡形態 經LPS 和ATP 共同處理巨噬細胞后，棄去培養液，加入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h，1%鋨酸、0.1 mol/L PBS（pH=7.4）室溫（20 ℃）固定2 h，脫水，滲透，包埋，切片，染色，分別使用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察，采集圖像分析。

1.3 統計學分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，組間差異比較采用One-Way ANOVA 分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代腹腔巨噬細胞形態 光學顯微鏡下可觀察到分離出的原代腹腔巨噬細胞貼壁后多呈不規則、梭形或偽足狀態。經瑞氏-吉姆薩染色后可觀察到胞核大且染色呈紫藍色，胞漿染色淡，呈淺藍色，可見明顯偽足（圖1）。

圖1 原代腹腔巨噬細胞形態Fig.1 Form of primary peritoneal macrophages

2.2 原代腹腔巨噬細胞純度 F4/80 是小鼠巨噬細胞的表面標志，小鼠巨噬細胞的特異表型為F4/80+，可通過流式細胞術進行檢測。結果顯示分離出的原代腹腔巨噬細胞經差異貼壁法去除未貼壁的細胞后，其純度可由50%升高至90%以上，完全可滿足后續實驗要求（圖2）。

圖2 原代腹腔巨噬細胞純度Fig.2 Purity of primary peritoneal macrophages

2.3 不同劑量ATP 與LPS 對原代腹腔巨噬細胞焦亡的影響 結果顯示經500 ng/ml LPS 刺激24 h 后再用ATP刺激4 h，巨噬細胞的焦亡發生率與ATP刺激的其他時間點具有明顯差異，且以5 mmol/L ATP誘導巨噬細胞4 h 后焦亡發生率最高，以上結果證明500 ng/ml LPS 24 h+5 mmol/L ATP 4 h為誘導巨噬細胞焦亡的最佳刺激方案（圖3）。

圖3 不同濃度ATP誘導巨噬細胞焦亡Fig.3 Pyroptosis of macrophages induced by different concentrations of ATP

2.4 LPS 和ATP 共同作用后焦亡相關蛋白與炎癥細胞因子的表達情況

2.4.1 焦亡相關蛋白表達水平 Western blot 檢測焦亡相關蛋白表達水平，結果顯示與空白對照組相比，LPS+ATP 組焦亡關鍵執行蛋白GSDMD、caspase-1、caspase-11、HMGB1、pro-IL-1β、pro-IL-18、NLRP3 和ASC 蛋白水平明顯升高，且LPS 組的pro-IL-1β、pro-IL-18、ASC、caspase-11 和NLRP3蛋白水平明顯高于空白對照組（圖4）。

2.4.2 焦亡相關炎癥細胞因子IL-1β 和TNF-α 表達水平 ELISA 檢測培養上清中炎癥細胞因子IL-1β 和TNF-α 的表達情況，與對照組相比，LPS 組和LPS+ATP 組中IL-1β 和TNF-α 表達水平均明顯升高，差異有統計學意義，且ATP 組培養上清中的IL-1β含量也明顯高于對照組（圖5）。

圖5 細胞培養上清中IL-1β和TNF-α的表達水平Fig.5 Concentrations of IL-1β and TNF-α in cell culture supernatant

2.5 電鏡觀察細胞焦亡形態 電鏡下可觀察到LPS+ATP 組多數巨噬細胞呈焦亡狀態，表現為細胞腫脹，細胞表面有破損。SEM 可觀察到焦亡的巨噬細胞形態不規則，偽足（PS）大面積減少、退化，個別斷裂；細胞膜大面積破損，大量細胞內容物釋放至胞外，細胞周圍可見游離細胞基質（CO），膜表面可見多處破損（圖6A、B）。經TEM 觀察可見焦亡細胞中度水腫，細胞核（N）呈近圓形，核固縮，局部核周隙增寬（圖6C 黑色箭頭處），線粒體（M）中度腫脹，基質溶解呈空泡狀，粗面內質網（RER）明顯擴張（圖6C），細胞膜完整性被破壞（圖6D黑色箭頭處）。

圖6 電鏡觀察巨噬細胞焦亡形態Fig.6 Form of pyroptosis macrophages observed by electron microscope

3 討論

膿毒癥是感染性疾病嚴重的并發癥，死亡率高達40%，LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，免疫系統紊亂是膿毒癥發生發展的主要機制，其中大量炎癥細胞激活和促炎介質釋放是免疫系統紊亂的重要原因，經證明TNF-α 和IL-1β 是膿毒癥發病機制中的早期促炎介質，而高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是膿毒癥發病機制中的晚期促炎介質，細胞焦亡的發生伴隨大量炎癥因子的釋放，這種大量炎癥因子釋放的表現可能與膿毒癥免疫系統紊亂相關［15-16］。目前針對膿毒癥的治療方案仍以控制感染、液體復蘇及生命支持為主，尚缺乏有效的針對性治療，因此細胞焦亡有望成為治療膿毒癥的突破口，而一個穩定可靠的體外細胞焦亡模型是研究其分子機制所必需的。

細胞焦亡可分為由caspase-1 激活的經典炎癥小體焦亡途徑和caspase-11 激活的非經典炎癥小體焦亡途徑。在經典炎癥小體途徑中，多種病原相關分 子 模 式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs）可激活炎癥小體，進而活化caspase-1。目 前NOD 樣 受 體 蛋 白3［nucleotidebinding domain（NOD）-like receptor protein 3，NLRP3］是研究最清楚的炎癥小體之一，該炎癥小體由模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）、凋亡相關斑點樣蛋白［apoptosis-associated speck-like protein containing a Caspase-recruitment domain（CARD），ASC］和caspase-1組成。在非經典炎癥小體途徑中，通常是LPS 直接激活caspase-11 誘導焦亡發生，還可在NLRP3 和ASC 的共同作用下激活caspase-1［17］。邵峰院士及其團隊在2015年提出GSDMD 是所有炎性caspase 的底物，是焦亡的關鍵執行蛋白，活化的caspase-1 可以切割多種底物，如GSDMD、pro-IL-1β和IL-18 前體（pro-IL-18），切割后的GSDMD 氨基末端（GSDMD-N）與細胞膜結合后形成孔洞，然后釋放出成熟的IL-1β和IL-18［13，16，18-22］。

目前國內外研究焦亡機制使用的體外模型大多為LPS 和ATP 共同作用于巨噬細胞系誘導焦亡，巨 噬 細 胞 系 焦 亡 模 型 尤 以RAW264.7 為 主［11-13］，RAW264.7 是小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，其形態和功能都與原代巨噬細胞有一定的差異［23］，而LPS和ATP 作用的時間和濃度多通過細胞活性和藥物毒性確定，此方法雖然將藥物的毒性作用控制到最低狀態，但無法確定細胞焦亡的發生率［12］。根據細胞焦亡同時具有壞死和凋亡表型特征，即焦亡細胞表現為膜聯蛋白-V（Annexin-V）和7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin，7-AAD）染色呈雙陽性［24-25］。故本研究以小鼠原代腹腔巨噬細胞為主要研究對象，通過流式細胞術準確快速地檢測模型構建過程中巨噬細胞焦亡的發生率，在確保LPS 對小鼠原代腹腔巨噬細胞的毒性作用最小的前提下，發現經500 ng/ml LPS 誘導24 h 后再使用5 mmol/L ATP 刺激4 h 為誘導小鼠原代腹腔巨噬細胞焦亡的最佳組合方式［14］。本研究發現LPS 組的NLRP3 和caspase-11與炎癥相關蛋白及炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18 明顯高于control 組，焦亡關鍵蛋白caspase-1和GSDMD則無明顯差異，此結果表明LPS成功誘導巨噬細胞炎癥模型。在LPS+ATP 組中，不僅炎癥相關的蛋白和細胞因子明顯高于control 組，焦亡關鍵蛋白caspase-1 和GSDMD 也明顯高于control 組，并且電鏡下也觀察到大量焦亡細胞，證明了焦亡模型構建成功。當LPS單獨作用于巨噬細胞時引起了炎癥反應，但caspase-1 和GSDMD 沒有增高，當加入ATP 之后，caspase-1 和GSDMD 則顯著升高，因此細胞焦亡的發生需要PAMPs 和DAMPs 共同作用，而caspase-1 的升高是受caspase-11 影響還是由于經典途徑的激活仍需進一步研究。

綜上，本研究在LPS 刺激小鼠原代腹腔巨噬細胞誘導炎癥反應后加入ATP 成功建立了穩定的焦亡模型，為后續研究膿毒癥免疫細胞焦亡的分子機制提供成熟的體外細胞模型。