活血化濕湯通過靶向TP53 抑制M2 巨噬細胞極化與非小細胞肺癌細胞的侵襲①

高莉萍 趙蘭婷 馮 倩 石軍年 （蘭州大學第二醫院呼吸內科，蘭州 730030）

非 小 細 胞 肺 癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌病理學分類的一種，也是其中最常見的亞型，預后差［1］。中藥對癌癥的治療作用已被廣泛認同，目前已發現多種單味中藥或復方湯劑對NSCLC 具有良好的治療作用［2］。如石泉玉珍湯抑制NSCLC 血管生成和腫瘤生長，促進免疫應答［3］。在中醫的范疇內，NSCLC 屬于“咳嗽、肺積、息賁”等，諸多國醫大師均認為NSCLC 的發病不離肺脾，治法不離益氣化濕［4］?；钛瘽駵砂酌└?、白術、赤芍、赤小豆、大黃、黨參、茯苓、紅花、益母草、茵陳、玉米須、澤蘭、梔子等組成，已經通過臨床試驗，對晚期肝癌黃疸具有良好的治療效果［5］。但對NSCLC的治療是否有效有待商榷。中醫方劑成分復雜，具有多作用途徑和多靶點的特征，而網絡藥理學能通過構建藥物-靶點-疾病網絡，相對系統地將多種成分、多種靶點的復雜特性展示出來，對藥物、靶點和疾病的相互作用進行分析［6］。本研究擬采用網絡藥理學方法，構建活血化濕湯-靶點-NSCLC 的相互作用網絡，分析活血化濕湯對NSCLC 的治療作用及潛在靶點，為開發新藥提供理論和基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 10 周齡清潔級雄性SD 大鼠10 只，體質量300～350 g，由蘭州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（甘）2018-0002。大鼠常規飼養，陰暗/光照各12 h，自由攝食和飲水，每3 d 更換飼料和飲用水。本研究經蘭州大學第二醫院動物倫理委員會審批（批號：D2021-083）。

1.1.2 主要試劑及儀器 活血化濕湯（基本方包括白茅根20 g、白術20 g、赤芍30 g、赤小豆20 g、大黃10 g、黨參30 g、茯苓20 g、紅花10 g、益母草10 g、茵陳30 g、玉米須20 g、澤蘭10 g、梔子10 g）由蘭州市中醫院熬制并制備為含生藥1 g/ml 的藥液，冷卻后置于-20 ℃備用；BEAS-2B 細胞（CL-0496）、NCIH1299細胞（CL-0165）、THP-1細胞（CL-0233）、RPMI-1640 培養基（PM150110）、PBS（PB180327）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；引物設計由南京金斯瑞制作合成；轉染質粒購自上海吉瑪基因；佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）（70-CS1001）購自杭州聯科生物技術有限公司；PE標記的CD206抗體（321105）、FITC 標記的CD86 抗體（374203）均購自BioLegend（北京）生物科技有限公司；ECL 顯影試劑（P0018S）購自上海碧云天生物技術有限公司；IL-1β ELISA 試劑盒（E-EL-H0149c）和CCL18 ELISA 試劑盒（E-EL-H1270c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；結晶紫染液（C8470）和Matrigel 基質膠（356234）均購自北京索萊寶；Lipofectamine 3000轉 染 試 劑（L3000007）、分 光 光 度 計（NanoDrop 2000）、Real Time PCR 系統（ABI 7500）均購自Thermo Fisher；TRIzol 試劑盒（15596-026）購自Invitrogen；PrimeScript RT 試劑盒（RR036A）、SYBR Premix ExTap Ⅱ試 劑 盒（RR820A）購 自TaKaRa；TP53（ab179477）、GAPDH（ab181602）和IgG（ab6721）抗體均購自英國Abcam；流式細胞儀（LSRFortessa）購自美國BD 公司；酶標儀（SynergyHT）購自美國Bio Tek 公司；顯微鏡（DM2000）購自徠卡顯微系統公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥有效成分及靶點的獲取 在TCMSP 數據庫（https：//tcmsp-e.com）中檢索活血化濕湯的主要組成：白茅根、白術、赤芍、赤小豆、大黃、黨參、茯苓、紅花、益母草、茵陳、玉米須、澤蘭、梔子的有效活性成分及作用靶點，檢索條件設置為：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-Likeness，DL）≥18。使用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）對靶點名稱進行歸一化處理，統一以基因名表示，同時刪除無法轉化的靶點并去掉重復靶點。

1.2.2 NSCLC相關風險基因的篩選 借助Malacards數據庫（https：//www.malacards.org）和DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/search）查找NSCLC發病風險基因，將兩個網站的結果進行綜合及去重復處理。

1.2.3 核心靶基因篩選 將NSCLC 的發病風險基因與活血化濕湯的潛在作用靶基因利用Evenn 在線工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/#/）取交集，將得到的交集在STRING 網站（https：//string-db.org/）中進行蛋白互作分析。

1.2.4 活血化濕湯含藥血清的制備 選用健康10 周齡雄性SD 大鼠10 只，體質量300～350 g，適應性喂養7 d 后，依據“動物和人體表面積折算的等效劑量”對大鼠進行灌胃，灌胃劑量為10.8 g/（kg·d），2 次/d。采血前使大鼠空腹禁食12 h，末次灌胃2 h后采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠并斷頸處死，取大鼠腹主動脈血，每只大鼠取血8 ml，采集的血液置于37 ℃水箱內水浴20 min，之后以3 000 r/min 離心20 min，去上清，過濾并除菌后置于-20 ℃備用。

1.2.5 MTT 法檢測活血化濕湯對NSCLC 細胞的最佳干預濃度和時間 取5×103個處于對數生長期的NCI-H1299 細胞置于96 孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養24 h 后加入濃度為5%、10%、20%的含藥血清各1 ml，同時設置加入等量PBS 的對照組。培養12 h、24 h和48 h后去除含藥血清培養液，加入100 μl MTT 試 劑，振 蕩 混 勻 后10 min 內 上 酶 標 儀 測 定570 nm處吸光度，統計并分析細胞增殖活力。

1.2.6 細胞培養和處理 將THP-1細胞、人正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B、人NSCLC 細胞系NCIH1299 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基中培養，培養條件：37 ℃、5%CO2。THP-1 細胞向巨噬細胞的誘導借助100 nmol/L PMA 完成，誘導時間48 h，之后收集THP-1 細胞并將其命名為M0 巨噬細胞用于后續研究。M0 巨噬細胞分別以PBS、活血化濕湯、活血化濕湯+TP53 過表達載體處理（TP53 過表達載體轉染24 h 后再以活血化濕湯處理48 h）。TP53 過表達載體的轉染參照Lipofectamine 3000 試劑盒說明書完成。

1.2.7 qRT-PCR 檢測mRNA 表達 TRIzol 試劑盒提取總RNA，NanoDrop 2000 分光光度計以及Prime-Script RT 試劑盒分別用于總RNA 濃度測定和逆轉錄操作執行。之后以反轉錄得到的cDNA 為樣本，借助SYBR Premix ExTap Ⅱ試劑盒完成PCR 反應，并結合7500 實時PCR 系統完成操作，反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循 環40 次。GAPDH 作為內參。TP53 正向引物：5'-GTTATGAGCTATCGCGCTATA-3'，反向引物：5'-AATAGGCTTAGAGATATTGA-3'；GAPDH 正 向 引 物：5'-GGTTCTCTCTCAGCCCATCAAGT-3'，反向引物：5'-ACCTCGTGCACCTAAGTGTGCAA-3'。應用2-ΔΔCt法計算TP53的相對表達量。

1.2.8 Western blot 檢測蛋白表達 RIPA 裂解液對細胞進行裂解，并借助BCA 試劑盒完成蛋白濃度的測定。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入TP53（1∶10 000）、GAPDH（1∶2 500）一抗4 ℃孵育過夜。隔天TBST 洗膜，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。膜上加入ECL 顯影試劑使蛋白條帶可視化，Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

1.2.9 流式細胞術檢測M1 型（CD86）和M2 型（CD206）巨噬細胞標志物表達 將M0 巨噬細胞以1×105個/孔接種于24 孔培養板，使用PBS、活血化濕湯、活血化濕湯+轉染過表達TP53處理后收集細胞，使用PE 標記的CD206 與FITC 標記的CD86 抗體與細胞共孵育30 min 后，轉移至流式細胞儀上分析，計算陽性細胞比例。

1.2.10 ELISA 檢測IL-1β、CCL18 的濃度 收集PBS 組、活血化濕湯組、活血化濕湯+TP53 組巨噬細胞上清，以3 500 r/min 離心5 min 后，ELISA 法測定細胞上清中IL-1β、CCL18的濃度。首先在對應組細胞孔板中加入100 μl標準品，37 ℃孵育90 min，去除板內液體并加入100 μl 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板。之后每孔加入100 μl 的HRP 酶結合物工作液，37 ℃孵育30 min并洗板。加入90 μl底物溶液，37 ℃孵育15 min 后加入50 μl 終止液，酶標儀測定450 nm處OD值。

1.2.11 Transwell 檢測細胞侵襲 在Transwell 小室上室預涂1 層Matrigel 膠，將1×105個NCI-H1299細胞接種于上室，下室加入含胎牛血清的培養基進行誘導。此外，將NCI-H1299 細胞和不同條件（PBS、活血化濕湯）處理的巨噬細胞共培養，以1∶1比例混合并分別接種于上室，下室同樣加入胎牛血清培養基誘導。24 h 后多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡對侵襲細胞進行觀察和計數。

1.3 統計學分析 所有計量資料采用SPSS23.0軟件進行分析，以±s表示。采用t檢驗分析兩組間數據差異，單因素方差分析比較多組間數據差異。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 活血化濕湯含藥血清對NSCLC 細胞的最佳干預濃度和時間 MTT檢測結果顯示，相對于PBS組，活血化濕湯組各濃度梯度細胞活性均降低（均P＜0.05），其中，10%活血化濕湯干預組的細胞活性最低。此外，活血化濕湯處理24 h 的細胞增殖活力顯著低于12 h 和48 h（均P＜0.05），提示活血化濕湯對NSCLC 細胞的最佳干預濃度和時間分別為10%和24 h。見圖1。

2.2 活血化濕湯的有效活性成分及靶基因篩選TCMSP 數據庫檢索“活血化濕湯”組成藥物的有效活性成分及靶基因發現，白茅根活性成分7種、靶蛋白83種；白術活性成分7種、靶蛋白23種；赤芍活性成分29 種、靶蛋白151 種；赤小豆活性成分5 種、靶蛋白39種；大黃活性成分16種、靶蛋白110種；黨參活性成分21種、靶蛋白213種；茯苓活性成分15種、靶蛋白30種；紅花活性成分22種、靶蛋白439種；益母草活性成分8 種、靶蛋白320 種；茵陳活性成分13 種、靶蛋白362 種；玉米須活性成分12 種、靶蛋白119 種；澤蘭活性成分2 種、靶蛋白62 種；梔子活性成分15 種、靶蛋白356 種。經Uniprot 數據庫轉換，去除重復基因，共得到217個靶基因，采用Cytoscape將靶基因可視化，構建藥物-靶點互作用網絡（附圖1，www.immune99.com）。

2.3 核心靶基因的篩選 在Malacards與DisGeNET網站中查詢NSCLC的發病風險基因，分別得到46個和107 個NSCLC 的發病風險基因，數據經過綜合去重后得到131個風險基因。將風險基因與活血化濕湯的靶基因取交集，得到17 個交集基因（附圖2，www.immune99.com）。將這17 個靶基因上傳至STRING 網站與Cytoscape 進行蛋白互作分析，結果顯示TP53與其他基因的交互作用最強，可能對其他基因的表達產生影響（圖2）。

圖2 核心靶基因的篩選結果Fig.2 Screening results of core target genes

2.4 活血化濕湯能抑制TP53 在NSCLC 中的高表達 GEPIA 網站中顯示，相較于正常肺組織，TP53表達在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）與肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）組織中均上調（圖3A）。本研究選擇NCI-H1299 細胞進行研究，并檢測細胞中TP53 的表達發現，NCI-H1299 細胞中TP53 表達較正常支氣管上皮細胞BEAS-2B 顯著上調，但經活血化濕湯處理后的NCI-H1299 細胞中TP53表達下調（均P＜0.05，圖3B～D）。

圖3 活血化濕湯抑制TP53在NSCLC中的表達Fig.3 Huoxue Huashi Decoction inhibits expression of TP53 in NSCLC

2.5 活血化濕湯通過降低TP53 的表達抑制M2 巨噬細胞極化 使用活血化濕湯處理M0 巨噬細胞，觀察巨噬細胞向M2 和M1 型巨噬細胞極化的趨勢。流式分析顯示，活血化濕湯處理后CD86 陽性細胞百分比上調，CD206陽性細胞百分比下調，在細胞中轉染TP53過表達載體后，CD86陽性細胞百分比下調，CD206 陽性細胞百分比上調（均P＜0.05，圖4A、B）。同時，活血化濕湯處理后M1 巨噬細胞相關因子IL-1β 濃度升高，M2 巨噬細胞相關細胞因子CCL18濃度降低，轉染TP53 過表達后，以上數據被部分逆轉（圖4C）。提示活血化濕湯抑制了巨噬細胞向M2方向的轉化，促進向M1方向轉化，而過表達TP53能部分削弱活血化濕湯的作用。

圖4 活血化濕湯通過抑制TP53 表達進而降低M2 型巨噬細胞極化Fig.4 Huoxue Huashi Decoction reduces M2-type macrophage polarization by inhibiting expression of TP53

2.6 活血化濕湯通過抑制TP53表達抑制NCI-H1299細胞侵襲 Transwell 結果表明，活血化濕湯處理后的NCI-H1299 細胞侵襲數量顯著減少，但過表達TP53 后侵襲數量有所增多（均P＜0.05，圖5A）。將不同條件處理的巨噬細胞與NCI-H1299 細胞共培養，結果發現經活血化濕湯處理后的巨噬細胞能顯著抑制NCI-H1299 細胞的侵襲，在NCI-H1299 細胞中過表達TP53 能部分抵消以上作用（均P＜0.05，圖5B）。提示活血化濕湯可通過抑制TP53 進而抑制M2 巨噬細胞極化，從而抑制NCI-H1299 細胞侵襲。本研究機制圖見圖5C。

3 討論

網絡藥理學以系統生物學為基礎，強調從藥物靶點出發促進藥物治療效果的提高，對促進藥物實驗的成功率以及降低研發經費均具有重要意義［7］。本文首先通過網絡藥理學方法篩選活血化濕湯治療NSCLC 的主要潛在靶點，首先選出TP53。TP53是一種腫瘤突變蛋白質，該蛋白在癌癥中普遍發生突變［8］。LUO 等［9］發現在斑馬魚中，肝臟特異性PTEN 和TP53突變之間的合作在遺傳上能誘導肝癌發生。WAN 等［10］發現在血管肉瘤標本中TP53 免疫染色顯著升高。關于NSCLC 的研究揭示了耐藥NSCLC 細 胞 中TP53 的 表 達 升 高［11］。本 研 究 通 過GEPIA 網站預測到TP53 在LUAD 與LUSC 組織中表達均上調；qRT-PCR 發現在NSCLC 細胞系NCIH1299 細胞中TP53 表達也較正常細胞顯著上調，活血化濕湯可抑制TP53表達，初步確認活血化濕湯可能靶向TP53在NSCLC中發揮潛在作用。

巨噬細胞源于單核細胞，被證實是細胞免疫調控中非常重要的因素［12］。巨噬細胞在功能上存在異質性，主要分為M1 和M2 兩個亞群，M1 型巨噬細胞仍具有抗原遞呈能力，可促進Th1反應，與抗腫瘤有關；而M2 型巨噬細胞則具有促進腫瘤活性作用［13］。在癌癥早期，機體內趨化因子誘導巨噬細胞向M1 轉化，發揮機體免疫作用，當癌癥達到進展期，會促使M2 型細胞轉化來抑制免疫反應，促進腫瘤進展［14］。此外，M2型巨噬細胞也被證實能夠參與肝癌細胞的惡性生物學進展［15］。CD86 和CD206 分別為腫瘤M1 型和M2 型巨噬細胞的特異性標志物，其狀態的改變與腫瘤的遷移和侵襲等存在密切關聯［16-17］。IL-1β 是M1 型巨噬細胞的標志基因，與癌細胞的侵襲轉移有關［18］。而CCL18 是M2 型巨噬細胞標志物，與癌細胞的惡性行為及癌癥患者的預后不良存在關聯［19-20］。本研究發現活血化濕湯能抑制NSCLC 中M2 型巨噬細胞活化，進而抑制癌細胞的侵襲能力，且該作用被TP53 部分逆轉，進一步說明活血化濕湯通過TP53發揮對M2巨噬細胞活化與癌細胞侵襲的抑制作用。

本研究通過網絡藥理學初步預測出活血化濕湯調控TP53，又進一步通過細胞實驗證實該猜測，并證明了活血化濕湯可通過TP53 抑制NSCLC 中M2 型巨噬細胞極化與癌細胞侵襲能力。但本研究未使用動物實驗進行驗證，結果可能存在差異，需要進一步研究驗證。綜上，本研究證實了活血化濕湯對NSCLC發展的抑制作用，為NSCLC的治療提供了新的方案和藥物治療靶點。