基于鎮痛作用的金骨蓮膠囊生物活性測定方法研究*

楊 帥，劉 慧，周家華，周祖英，朱 迪，鞏仔鵬，李月婷，鄭 林，黃 勇△

（1.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室·國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550004； 3.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001）

金骨蓮膠囊源于經典苗藥組方，該組方在《本草圖經》《滇南本草》中均有記載［1］。其是以透骨香等5 味中藥材組方的復方中藥制劑，具有除濕、消腫、止痛、祛風等功效［2］，臨床主要用于鎮痛、改善組織腫脹等［3-4］。目前，已被收載于《國家中成藥標準匯編：腦系經絡肢體》［5］和《國家基本醫療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄（2022 年）》［6］?，F行質量標準中僅對大血藤、透骨香、金鐵鎖進行薄層色譜鑒別和對漢桃葉中富馬酸進行含量限定（不低于0.01%）［7］，難以全面控制該制劑的質量。課題組在前期研究中建立了同時測定金骨蓮膠囊中9種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法及指紋圖譜法［7-8］，但單一的化學分析方法無法全面控制金骨蓮膠囊的質量，無法保障其臨床安全性與有效性［9］。目前，生物活性測定已成為中藥質量控制發展的重要方向［10-11］，2020 年版《中國藥典（四部）》中已增加9015中藥生物活性測定指導原則（以下簡稱指導原則）［12］。為進一步完善金骨蓮膠囊的質量控制方法，有必要開展生物活性檢測研究。優選和建立與藥效相關且符合藥品檢定要求的中藥生物活性測定方法是實現中藥質量生物控制的前提和關鍵［13］。參考指導原則，本研究中基于鎮痛功效［2-3］建立了金骨蓮膠囊的生物活性測定方法?，F報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：1 mL 一次性注射器；EL - 240 型電子天平（梅特勒- 托利多儀器有限公司，精度為0.1 mg）；KQ - 500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；WP - UP -IV - 20 型超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；12號灌胃針。

試藥：阿司匹林腸溶片（神威藥業集團有限公司，批號為2010281，規格為每片25 mg）；金骨蓮膠囊（貴州益佰制藥股份有限公司，批號分別為190816，191001，191010，191102，191108，200607，200711，201021，201101，201205，規格為每粒0.25 g）；冰醋酸（重慶川東化工＜集團＞有限公司，批號為20191001）；生理鹽水（貴州科倫藥業有限公司，批號為E121051506）；羧甲基纖維素鈉（CMC - Na，大連美侖生物科技有限公司，批號為J0826A）。

動物：SPF 級昆明小鼠50 只，雌雄兼用，體質量18～22 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號為SCXK（湘）2019 - 0014。動物進入實驗室后，雌雄分開飼養，每籠20 只，光照充足，通風和空調設備良好，室溫20～24 ℃，相對濕度50%～70%。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取阿司匹林腸溶片和金骨蓮膠囊內容物各適量，分別置容量瓶中，精密稱定，加0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液定容，搖勻，即得。

2.2 分組、給藥與建模

將50 只昆明小鼠隨機分為空白對照組（等量0.5%CMC - Na），金骨蓮膠囊低、中、高劑量組（113.75，227.50，455.00 mg/kg），陽性藥對照組（阿司匹林36.40 mg/ kg），各10 只。分別按每1 kg 體質量灌胃10 mL藥物，每日1次，連續給藥7 d。末次給藥前12 h，禁食、自由飲水。末次給藥1 h 后，按每1 kg 體質量小鼠腹腔注射10 mL 1%醋酸溶液，以誘導扭體反應。

2.3 評價指標與統計學處理

記錄腹腔注射醋酸后20 min 內各組小鼠扭體反應的次數，評價指標為小鼠的腹部是否內凹、臀部是否抬高、后肢是否伸展。根據扭體次數計算各給藥組的鎮痛率［14］，鎮痛率（%）=（扭體次數空白組-扭體次數給藥組）/扭體次數空白組×100%。

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD-t法進行比較，方差不齊時用Dunnett T3法進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.4 限值劑量確定

由表1 可知，與空白對照組比較，陽性藥對照組及金骨蓮膠囊低、中、高劑量組小鼠20 min 內的扭體次數均顯著減少（P＜0.01）；與金骨蓮膠囊低劑量組比較，金骨蓮膠囊高劑量組小鼠20 min 內的扭體次數顯著減少（P＜0.05）。為增加實驗的可靠性與重復性，選擇455.00 mg/kg（相當于臨床等效劑量的2 倍）作為限值劑量。

表1 不同劑量金骨蓮膠囊對小鼠鎮痛率的影響（n=10）Tab.1 Effect of different doses of Jingulian Capsules on the analgesic rate of mice（n=10）

2.5 方法學考察

重復性試驗：取同一批樣品（批號為191001，劑量為455.00 mg/kg）進行6次平行試驗，考察方法重復性。結果6 次試驗均能顯著減少小鼠的20 min 內扭體次數（P＜0.01），平 均鎮痛率（47.43 ± 2.30）%，RSD為4.85%（n=6），表明方法重復性良好。詳見表2。

表2 重復性試驗結果（n=10）Tab.2 Results of the repeatability test（n=10）

日間精密度試驗：由同實驗室不同人員采用455.00 mg/kg的金骨蓮膠囊連續灌胃給藥7 d后，測得各組小鼠的平均鎮痛率為（46.63 ± 2.51）%，RSD為5.39%（n=3），與正常對照組比較，各給藥組小鼠的扭體次數均顯著減少（P＜0.01），表明儀器日間精密度良好。詳見表3。

表3 日間精密度試驗結果（n=10）Tab.3 Results of the intra-day precision test（n=10）

方法適用性試驗：測定10批金骨蓮膠囊，通過與空白對照組和金骨蓮膠囊高劑量組間比較，考察方法適用性。結果10批給藥后小鼠的鎮痛率均大于40.00%，平均鎮痛率為（47.44±3.61）%，RSD為7.61%（n=10）；與空白對照組比較，金骨蓮膠囊高劑量組小鼠20 min 內的扭體次數均顯著減少（P＜0.01），表明方法適用性良好，不同批次金骨蓮膠囊質量均一。詳見表4。

3 討論

中藥材因其來源廣泛、制備工藝煩雜，難以控制其質量，且中藥多成分，多活性，藥理作用較多，單一成分難以控制其質量和反映中藥的療效［15］。為更好地保證中藥的安全性和有效性，有必要將質量控制和療效評價標準相結合，以更好地保證每批藥品用于臨床的安全性和有效性［16］。生物活性測定方法可作為常規理化測定方法的補充，可進一步完善金骨蓮膠囊的質量控制標準。

目前，對于鎮痛藥物藥效的篩選，常用的經典模型有物理致痛模型（如熱、電及機械刺激）和化學致痛模型（如甲醛、冰醋酸等）［14，17］。本研究中采用化學致痛模型，向小鼠腹部注入一定量冰醋酸，刺激臟層和壁層腹膜，引起腹部較大面積、較長時間的炎性疼痛，導致小鼠在一段時間后出現扭體反應（表現為腹部內凹、伸展后肢、抬高臀部、蠕行等）［18］，此模型能直觀地通過小鼠的扭體情況來反映小鼠的內臟疼痛，其疼痛程度可通過扭體次數和扭體潛伏期時長等觀察指標進行量化，簡單易行，對藥物的鎮痛作用較敏感，重復性好，是目前公認的篩選鎮痛藥物的經典模型之一［17］。通過預實驗發現，熱板實驗所得數據重復性較差，結果不穩定?？紤]到實驗的重復性及穩定性，本研究中選用化學致痛冰醋酸誘導小鼠的疼痛反應作為實驗模型進行研究。

本實驗在課題組前期研究的基礎上，結合本品功能主治鎮痛藥效成分，選擇經典的小鼠醋酸扭體模型，以建立其鎮痛生物活性檢測方法，以具有鎮痛功效的阿司匹林作為陽性對照藥。由表1 可知，與空白對照組比較，金骨蓮膠囊低、中、高劑量組小鼠20 min 內的扭體次數均顯著減少（P＜0.01）；與金骨蓮膠囊低劑量組比較，金骨蓮膠囊高劑量組小鼠20 min內的扭體次數均顯著減少（P＜0.05）。為增加實驗的可靠性和重復性，選擇高劑量（455.00 mg/kg）進行方法學驗證，結果表明，該方法的重復性、精密度及方法適用性均良好，且操作簡單，經驗證可用于揭示金骨蓮膠囊的生物活性信息，以及全面評價藥品品質。另外，建議采用該方法時，第1次結果若有統計學意義，則可判定為合格；第1 次結果若無統計學意義，則可增加樣本量進行1 次復試，復試時應增設陽性藥對照組，復試結果若有統計學意義，則判定為合格，否則為不合格。