肽酰精氨酸脫氨酶4和組蛋白H3瓜氨酸化與高級別腦膠質瘤的相關性研究

孔晨旭 ,李振江 ,耿慧霞 ,王來

1 河南大學 淮河醫院,河南 開封 475004;2 河南大學 護理與健康學院,河南 開封 47600;3 河南大學 生命科學學院,河南開封 47600

腦膠質瘤又稱為神經膠質瘤,是中樞神經系統惡性程度最高的腫瘤,WHO 將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個級別。低級別膠質瘤向高級別類型轉化、進展迅速,且具有很強的侵襲性和對化療的不敏感性。膠質瘤的級別越高,患者的生存期越短,如Ⅳ級別膠質瘤患者的生存期一般小于15個月。多種病理機制參與膠質瘤級別的進展,如腫瘤細胞分泌胞外囊泡通過調控腫瘤微環境內細胞之間信息的交流,促進膠質瘤的級別的進展、復發、侵襲和抗藥性[1]。

肽基精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminases,PADs)是蛋白質翻譯后加工過程中的一類同工酶,該酶可將蛋白質表面的精氨酸殘基脫氨后轉變為瓜氨酸殘基,具有很強的底物結合特異性并且在不同的組織中發揮不同的生理功能[2]。高等生物共有PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6等5類肽酰精氨酸脫亞胺酶亞型[3]。PAD4由于具有經典的核定位信號,推測其為唯一一個定位于細胞核內的肽基精氨酸脫氨酶,暗示其在基因表達調控方面的重要作用[4]。PAD4通過瓜氨酸化H3和H4組蛋白中的多個精氨酸殘基,在中性粒細胞胞外誘捕網絡(neutrophil extracellular traps,NETs)形成和機體抵御微生物入侵的先天免疫方面發揮重要作用[5]。近年的研究發現,PAD4調控組蛋白的瓜氨酸化廣泛參與腫瘤的形成、發展和轉移。然而,PAD4的表達水平及其介導的組蛋白3瓜氨酸化(citrullinated Histone H3,H3cit)與高級別腦膠質瘤之間的關系并不明確。本研究以腦膠質瘤患者手術標本為研究材料,觀察PAD4和H3cit的表達水平與高級別腦膠質瘤的關系,以期對膠質瘤的診斷和治療提供科學的參考。

圖1 正常與高級別腦膠質瘤PAD4的表達情況

圖2 正常組織與高級別腦膠質瘤組蛋白3瓜氨酸化表達情況

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2021年1月—2022年1月在河南大學淮河醫院進行手術治療的腦膠質瘤患者30例,其中:男22例、女8例;年齡36～72歲,平均(50.1±6.3)歲。取瘤旁正常組織為對照組。按照世界衛生組織(WHO)中的分級法對腫瘤進行分級,Ⅲ級有18例,Ⅳ級有12例。本研究已獲得河南大學生物醫學科研倫理分委員會的準許(HUSOM2021-0106),并獲得了患者或家屬的書面知情同意書。

1.2 免疫組織化學檢測

將所有的組織標本用中性甲醛固定,石蠟包埋,石蠟切片機以4～5 μm的厚度切片;烤箱烤片,二甲苯脫蠟,不同梯度乙醇水化,去離子水漂洗充分。切片浸泡檸檬酸抗原修復液中,微波爐加熱進行抗原修復。切片置于去離子水中浸泡,滴加內源性過氧化物酶,室溫避光放置5 min,PBS緩沖液沖洗。滴加小鼠抗PAD4一抗(1∶200,Abcam,貨號:128086)和兔抗H3cit一抗(1∶150,Abcam,貨號:5103),37 ℃孵育2 h,PBS緩沖液沖洗3次。滴加HRP標記的抗小鼠/兔IgG二抗(中杉金橋),室溫孵育30 min,PBS緩沖液沖洗。DAB顯色試劑盒(Solarbio,貨號:DA1010)顯色。光學顯微鏡下觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤PAD4表達增加

臨床標本檢測(圖1)顯示,PAD4在細胞核內表達,但在正常組織內,表達水平較低,而Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤細胞表達水平遠遠高于正常組織,且表達水平的高低隨膠質瘤分期的增加而增加。

2.2 Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤組蛋白H3瓜氨酸化增加

臨床標本檢測(圖2)顯示,Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤細胞核內組蛋白3的瓜氨酸化急劇增加,而正常組織細胞的核內,組蛋白3的瓜氨酸化水平較低,且隨著膠質瘤分期的增加而瓜氨酸化水平亦增加,呈現一定的正相關。

3 討論

腦膠質瘤屬于中樞神經系統高度異質性腫瘤,嚴重威脅人類健康,預后效果極差[6]。WHO 根據腫瘤細胞周圍血管增生與細胞核分裂情況,將Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤歸為低級別,將Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤歸為高級別。膠質瘤的級別越高,患者的生存期越低,其中,膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的惡性程度最高,5 a生存期低于6.9%[7]。目前,手術切除和術后的藥物化療相結合是治療膠質瘤的主要選擇,但患者的預后依然很差[6]。隨著小分子藥物和抗體藥物的研發和應用促使了腫瘤患者精準治療的實現,因此探討不同分級腦膠質瘤的特異分子更為重要[8]。

PADs的主要生物學功能是參與蛋白質翻譯后精氨酸殘基的瓜氨酸化。PAD4通過調控中性粒細胞組蛋白H3的瓜氨酸化從而參與胞外誘捕網絡(neutrophil extracellular traps,NETs)形成,參與機體的固有免疫反應。進一步的研究表明,PAD4調控的機體多種蛋白多肽鏈的精氨酸殘基瓜氨酸化組成了關節炎、神經退行性疾病、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡和腫瘤等多種疾病的病理基礎[9]。哺乳動物有5 個PADs 酶家族成員,其中PAD2 和PAD4在腫瘤的發生、發展、轉移方面發揮重大作用[10]。PAD2超表達轉基因鼠促進皮膚癌的形成,通過STAT3信號通路的磷酸化調控腫瘤微環境狀態增強癌細胞的惡變率和轉移[11-12],而PAD4調控腫瘤細胞染色質絲形成促進癌細胞的侵襲和轉移[13]。對星形膠質細胞瘤的研究[14-15]也表明,PAD4的表達增高,然而并沒有檢測到PAD2 和PAD3表達水平的增加。本文研究結果顯示,PAD4和H3cit在Ⅲ和Ⅳ級的腦膠質瘤組織比正常組織表達水平增高,且隨著膠質瘤級別的增加,表達量增加明顯,提示PAD4和H3cit的高表達與高級別腦膠質瘤的進展相關,有可能作為腦膠質瘤的精準治療靶點。

外分泌體是促進膠質母細胞瘤促瘤微環境形成的主要調控因子。肽酰精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminases,PADs)調控膠質細胞瘤胞外囊泡(exosomes and microvesicles,EVs)的形成,影響囊泡內分子變化,改變其功能[16]。廣譜PAD 抑制劑Cl-amidine影響膠質母細胞瘤外分泌體的釋放和外分泌體攜帶microRNA 水平,如降低促瘤microRNA21的水平,增加抗瘤microRNA126的水平。膠質母細胞瘤細胞內,觀察到阻抑素瓜氨酸化的增加,從而維持細胞內線粒體穩定性和癌細胞的抗藥性。廣譜PAD抑制劑處理1 h后,PHB的瓜氨酸和表達水平降低,H3的瓜氨酸化也降低。這些結果提示,PAD修飾GBM 細胞內蛋白的瓜氨酸化變化及內分泌體的釋放表明PADs是修飾GBM 腫瘤細胞間通訊的新的靶標[17]。不同PADs亞型的特異性抑制劑作用不同GBM 細胞系提示對外分泌體的釋放和miRNA的影響是不同的,提示不同PAD的表達決定GBM 的異質性并具有潛在的特異性治療特性[18]。這些研究結果提示,PAD4活性的小分子抑制劑有可能作為抑制膠質瘤進展的潛在治療藥物。

綜上所述,PAD4和H3cit的高表達水平與高級別腦膠質瘤存在一定的相關性,對這兩個蛋白分子的檢測有利于高級別腦膠質瘤的病理診斷,也為腦膠質瘤患者的精準治療提供參考依據。