基于網絡藥理學和分子對接技術分析連理湯治療潰瘍性結腸炎的分子機制▲

鄧亞勝 黃 慧 梁天薇 林 江

(廣西中醫藥大學基礎醫學院,廣西南寧市 530000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復發作的結直腸慢性非特異性炎癥疾病[1],主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉及黏液膿血便等,通過結腸鏡和組織病理學檢查可明確診斷[2]。目前,UC的發病機制尚未明確,大多數學者認為與遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應失調、環境等因素有關[3-5]。UC病變范圍廣,病變部位常累及直腸、降結腸,甚至可以延伸至整個結腸,病情反復,遷延難愈,可發生于任何年齡段,被WHO列為現代難治病之一[6]。

西醫治療UC的主要藥物有氨基水楊酸類、糖皮質激素類、免疫抑制劑、抗生素及生物制劑等[7-9],用藥后癥狀得以緩解,但長期服用可能會出現胃腸道反應、過敏反應、激素副作用、感染等副作用。部分患者可選擇手術治療,但手術指征多為增生或病變、病情遷延難愈、藥物控制不佳或不耐受等[8]。因此,亟須尋找可以治療UC的新方法以改善患者的癥狀,提高療效。中醫藥治療UC歷史悠久,且獲得較好的療效[10-11]。其中,連理湯是治療UC的常用方劑,全方由干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術、人參組成。祁正平[12]采用連理湯治療UC,其臨床總有效率高達95.24%,高于采用美沙拉嗪治療的對照組;趙靜等[13]發現,與柳氮磺胺吡啶治療相比,連理湯治療UC的療效更顯著。因連理湯具有多成分、多靶點協同作用的特點,其治療UC的作用機制尚不明確。網絡藥理學是一種以疾病、靶點、基因和藥物相互作用網絡為基礎,集計算機生物學、蛋白組學和系統生物學于一體的分析方法。本研究運用網絡藥理學結合分子對接技術探討連理湯治療UC的作用機制,以期為連理湯治療UC作用機制的探索提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 連理湯性味-歸經的檢索 通過查閱《中華人民共和國藥典(2020年版)》及《中藥學(新世紀第五版)》,獲取連理湯所含藥物的性味、歸經,并使用Cytoscape 3.8.2軟件構建“性味-歸經”網絡圖。

1.2 連理湯活性化學成分及其作用靶點的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://tcmsp-e.com/)檢索連理湯的活性化學成分,并設置藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%為活性化學成分的篩選標準。然后在該平臺上檢索活性化學成分對應的作用靶點,剔除尚無明確作用靶點的活性化學成分。在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)中,將物種設置為人類,將作用靶點名稱轉換為標準基因名,匯總后去重。

1.3 UC相關靶點的篩選 以“Ulcerative Colitis”為關鍵詞,在TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數據庫(https://go.drugbank.com/)、OMIM?數據庫(https://omim.org/)、PharmGKB數據庫(https://www.pharmgkb.org/)、CTD數據庫(http://ctdbase.org/)、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)、GeneCards?數據庫(https://www.genecards.org/)、DISEASES數據庫(https://diseases.jensenlab.org/)檢索UC相關靶點,檢索時間為建庫至2021年10月23日?？紤]到CTD數據庫、DisGeNET數據庫、GeneCards?數據庫、DISEASES數據庫中的靶點過多,分別以推理分數>15、Scoregda≥0.05、關聯分數>5、Z值≥4為篩選標準,對檢索到的靶點進行進一步篩選。匯總上述8個數據庫檢索得到的靶點,進行格式調整、標準基因名轉換等處理后刪除重復的靶點,獲得UC的相關靶點。

1.4 “中藥-活性成分-靶點”網絡構建 將1.2和1.3得到的靶點導入Draw Venn Diagram在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖,獲得交集靶點,即為連理湯治療UC的相關靶點。把連理湯活性化學成分及其作用靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件中,利用Network Analyzer插件的Merge功能繪制“中藥-活性成分-靶點”網絡,并根據網絡拓撲學參數篩選出主要活性化學成分。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及核心靶點的提取 將交集靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)中,將置信度設為>0.4,獲取蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡,并保存為TSV格式文件。將該TSV文件導入Cytoscape 3.8.2軟件,利用Network Analyzer插件進行網絡拓撲學參數分析,并進行可視化展示,選取度值排名前10的靶點作為核心靶點。

1.6 功能富集分析與通路富集分析 為進一步了解連理湯治療UC所涉及的生物過程、分子功能、細胞組分及信號通路,將交集靶點上傳至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),限定物種為人類,進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。根據Benjamini-Hochberg矯正法,按-lgP值由大到小對富集分析結果進行排序,設定P<0.05為篩選條件,篩選出排名前20的信號通路及排名前10的生物過程、分子功能、細胞組分。

1.7 分子對接 將“中藥-活性成分-靶點”網絡篩選得到的主要活性化學成分作為配體蛋白,將PPI網絡篩選得到的核心靶點作為受體蛋白。首先在RCSB-PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中獲取上述蛋白的“PDB”格式,并在TCMSP平臺下載活性化學成分的“MOL2”格式,利用AutoDock 1.5.6軟件對受體蛋白和配體蛋白進行去水、加氫、計算電荷及尋找可旋轉化學鍵等處理,再根據受體蛋白和配體蛋白大小設置合適的對接盒子,并利用Lamarckian遺傳算法進行分子對接,最后在Pymol軟件中進行可視化分析。對接結合能越小,說明受體與配體對接的穩定程度越高。

2 結 果

2.1 連理湯“性味-歸經”網絡圖的構建 通過查閱《中華人民共和國藥典(2020年版)》及《中藥學(新世紀第五版)》,獲取干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術、人參的性味和歸經,構建連理湯“性味-歸經”網絡,見圖1。由圖可知,本方性味辛、溫、熱升散,苦、寒降泄,甘、淡滲利;歸經則上中下三焦兼顧。全方寒熱共用,苦辛并進,輔以補益。

圖1 連理湯“性味-歸經”網絡圖

2.2 連理湯活性化學成分及其作用靶點的篩選結果 通過TCMSP初步獲取干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術、人參6味中藥的化學成分分別為148個、280個、48個、34個、55個、190個,以OB≥30%、DL≥0.18為條件篩選得到連理湯的活性化學成分155個,其中干姜5個、甘草(炙)92個、黃連14個、茯苓15個、白術7個、人參22個,剔除未找到相應作用靶點的活性化學成分后,上述各組分的活性化學成分分別為5個、86個、11個、6個、4個、1個,其中干姜、人參存在共有活性化學成分β-谷甾醇(MOL000358),干姜、甘草(炙)存在共有活性化學成分谷甾醇(MOL000359),黃連、甘草(炙)存在共有活性化學成分槲皮素(MOL000098),排除重復活性化學成分后,連理湯的活性化學成分共為110個。利用Uniprot數據庫將110個活性化學成分對應的2 146個靶點名稱轉換為標準基因名,匯總后去重,最終得到229個作用靶點。

2.3 UC相關靶點的篩選結果 在TTD數據庫、DrugBank數據庫、OMIM?數據庫、PharmGKB數據庫中獲得UC相關靶點分別為39個、69個、7個、14個。在CTD數據庫中獲得UC相關靶點15 500個,以推理分數>15為條件篩選得到UC相關靶點987個;在DisGeNET數據庫中獲得UC相關靶點1 458個,以Scoregda≥0.05為條件篩選得到UC相關靶點349個;在GeneCards?數據庫中獲得UC相關靶點4 800個,以關聯分數>5為條件篩選得到UC相關靶點549個;在DISEASES數據庫中獲得UC相關靶點8 577個,以Z值≥4為條件篩選得到UC相關靶點131個。將上述數據庫獲得的相關靶點去重合并,共獲得UC相關靶點1 538個。將1 538個UC相關靶點與229個連理湯活性化學成分的作用靶點取交集,共獲得134個交集靶點,即連理湯治療UC的相關靶點。見圖2。

圖2 連理湯活性化學成分作用靶點與UC相關靶點的韋恩圖

2.4 “中藥-活性成分-靶點”網絡 采用Cytoscape 3.8.2軟件構建“中藥-活性成分-靶點”網絡圖,此網絡圖包含455個節點,2 167條邊,見圖3。使用Network Analyzer插件進行網絡拓撲學參數分析,依次提取大于2倍中位數及1倍中位數的度值,最終度值中位數為30,篩選出度值>30的主要活性化學成分有11個,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素等,見表1。

表1 11個主要活性化學成分信息表

圖3 “中藥-活性成分-靶點”網絡圖

2.5 連理湯治療UC相關靶點的PPI網絡及核心靶點的篩選結果 將交集靶點導入STRING數據庫中,獲取連理湯治療UC相關靶點的PPI網絡(見圖4A),該網絡圖由134個節點、2 804條邊組成,平均節點度為41.9,平均局部聚類系數為0.688。使用Network Analyzer插件對該PPI網絡進行網絡拓撲學參數分析,計算出拓撲網絡度值,以度值≥84為條件篩選出10個核心靶點,分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1,AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤抑癌蛋白p53(tumor suppressor protein p53,TP53)、IL-1B、原癌基因C-Jun(proto-oncogene C-Jun,JUN)、Caspase-3、前列腺素內環氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)、信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)3,見圖4B。

圖4 連理湯治療UC相關靶點PPI網絡圖及核心靶點

2.6 KEGG通路富集分析結果 將交集靶點上傳至DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析,共得到116條信號通路(P<0.05),根據-lgP值由大到小進行排序,排名前20的信號通路包括乙型肝炎、癌癥相關通路、TNF信號通路、弓形體病、缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K-AKT)信號通路、小細胞肺癌、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路、p53信號通路、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路、T細胞受體信號通路等,見表2和圖5。

圖5 連理湯治療UC的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 GO功能富集分析 將交集靶點上傳至DAVID數據庫進行GO功能富集分析,共獲得526條生物過程條目、46條細胞組分條目、84條分子功能條目(P<0.05)。根據-lgP值由大到小進行排序,其中生物過程條目以藥物反應、凋亡過程的負調控、凋亡過程、炎癥反應、信號轉導等為主;細胞組分條目以細胞核、胞質溶膠、蛋白質復合物、膜筏、核質等為主;分子功能條目以酶結合、轉錄因子結合、蛋白質結合、細胞因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結合等為主,見圖6。

圖6 連理湯治療UC的GO功能富集分析氣泡圖

2.8 分子對接 將“中藥-活性成分-靶點”網絡中的主要活性化學成分與PPI網絡中的核心靶點進行分子對接,同時記錄對接結合能,見表3和圖7。結果顯示,MAPK3與主要活性化學成分均沒有完成對接,而異鼠李素與PTGS2對接結合能為-10.4 kcal/mol,對接穩定性最好,其次為山柰酚與STAT3的對接結合能,為-10.1 kcal/mol,部分分子對接的可視化模型見圖8。分子對接結合能<-5.0 kcal/mol提示結合活性強,本研究中大部分主要活性化學成分與核心靶點對接的結合能均<-5 kcal/mol,說明連理湯中各中藥的主要活性化學成分與核心靶點對接較穩定。

表3 分子對接結合能(kcal/mol)

圖7 分子對接結合能熱圖

圖8 部分分子對接的模型圖

3 討 論

在中醫學上UC被稱為“痢疾”“腸游”“滯下”“泄瀉”“腸風”“腸癖”等,病位在大腸,涉及肝、脾、肺、腎等臟器,病程漫長。中醫認為UC以素體脾氣虛弱為發病基礎,以飲食不潔、情志失調、感受外邪等為主要發病誘因[14]?；颊咂馓撊?運化傳導失司,釀生濕熱之邪,導致氣血搏結,腸道絡脈受損,脂膜腐敗潰爛,腐敗之物化為膿血,故而引起本病。連理湯首載于《秘傳證治要訣及類方》,方由干姜、甘草(炙)、黃連、茯苓、白術、人參組成。方中干姜辛熱,溫中散寒,回陽通脈,為君藥。黃連苦寒,清熱燥濕,入胃、大腸經,清腸胃濕熱之邪,為臣藥;君臣相合,平調寒熱,辛開苦降,且干姜能防黃連苦寒傷陰之弊,黃連又可制干姜辛溫助熱之失。人參甘而微溫,補氣健脾;白術苦溫,健脾燥濕,助人參健脾而復升降;茯苓甘淡,利水滲濕,健脾,三藥共為佐藥。甘草(炙)甘溫,補中益氣,緩急止痛,兼和諸藥,為使藥。諸藥寒熱并用,升降共調,共奏清熱燥濕、補氣健脾之效。臨床研究顯示,連理湯可以改善UC患者臨床癥狀,提高患者生活質量[15-16]。但連理湯治療UC的機制尚未明確,故本研究基于網絡藥理學探究連理湯治療UC的活性化學成分、作用靶點及相關信號通路,為連理湯的臨床應用提供理論依據。

本研究結果顯示,連理湯的主要活性化學成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、柚皮素、芒柄花黃素、β-谷甾醇等。其中,山柰酚、槲皮素、異鼠李素、柚皮素均屬于黃酮類化合物,β-谷甾醇屬于甾醇類化合物,芒柄花黃素是一種異黃酮類植物雌激素。研究表明,槲皮素具有抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗氧化等作用,但其作用機制尚未明確。有學者認為,槲皮素通過抑制環氧化酶2、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NF-κB、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和MAPK的表達而發揮抗炎作用[17-18]。同時,槲皮素還能抑制TNF-α的產生,而TNF-α是一種多功能細胞因子,可調節活化白細胞的生長、增殖、分化和活力,同時還會誘發其他細胞因子、趨化因子等炎癥介質的表達[19-20]。此外,槲皮素還通過干擾細胞周期[21]、抑制存活信號蛋白(蛋白激酶C-α)和激活死亡信號蛋白(蛋白激酶C-δ)[22]等發揮抗腫瘤作用。山柰酚主要通過抑制TLR4/NF-κB通路的激活來改善腸道屏障的完整性,并抑制腸道炎癥[23-24]。異鼠李素、柚皮素通過抑制NF-κB的激活,同時抑制巨噬細胞iNOS的表達和一氧化氮的產生,發揮抗炎作用[25-27]。研究顯示,β-谷甾醇可通過濃度依賴的方式降低結腸炎小鼠模型腸道組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平,從而促進腸上皮細胞抗菌肽的表達,同時抑制腸道致病菌的存活,避免腸道受到炎癥的影響[28]。此外,β-谷甾醇還可以通過抑制NF-κB通路中脂多糖與TLR4的結合來減輕高脂飲食誘導的小鼠腸道炎癥[29]。芒柄花黃素可作用于多條致癌信號通路,包括PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、酪氨酸蛋白激酶和信號傳導與轉錄激活因子信號通路和胰島素生長因子1/胰島素生長因子1受體信號通路,從而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移過程[30-33]。上述研究表明連理湯的多個藥物活性成分通過抗腫瘤、抗炎等機制,發揮治療UC的作用。

本研究通過構建PPI網絡,得出AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1B、JUN、Caspase-3、PTGS2、STAT3、MAPK3是連理湯治療UC的核心靶點。其中,TNF有抗感染、調節免疫、促進細胞增殖分化等功能,對機體具有一定保護作用,而高水平TNF可引起局部炎癥反應[34]。IL-6參與機體細胞免疫、體液免疫的調節,在自身免疫、炎癥反應等方面起重要作用[35]。PTGS2又稱為誘導型環氧合酶2,在調節炎癥反應中起關鍵作用[36],是前列腺素生物合成中的關鍵酶,在細菌脂多糖、真菌病原體和炎癥細胞因子等刺激下,可促進前列腺素的表達[37]。AKT1是AKT家族成員之一,可增強細胞自噬,從而降低炎癥因子的表達[38]。TP53是防止突變細胞擴增的重要“守護者”,寬型TP53是一種腫瘤抑制基因,當機體發生DNA損傷時可以延緩細胞周期的進程[39]。IL-1B是編碼促炎因子IL-1β的基因,異常的免疫應答可引起IL-1β的異常激活,導致腸黏膜損傷,其在UC的發展中起到關鍵作用[40]。作為原癌基因的JUN目前尚未有研究證實其與UC相關,但其細胞同源物AP-1轉錄因子與癌癥和腫瘤轉化有關,AP-1參與多種細胞活動,包括分化、增殖、存活和凋亡等[41]。AP-1轉錄因子已被證明可以激活或抑制iNOS表達[42],UC患者結腸黏膜中iNOS表達明顯增高,表明其與UC的發病關聯密切[43]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族成員之一,在細胞凋亡和致癌過程中起到關鍵作用[44],腸道黏膜上的Caspase-3異常表達會激發T淋巴細胞對細胞凋亡的抵抗力,引起T淋巴細胞積累和慢性腸道炎癥的產生[45]。MAPK3是絲裂原活化蛋白信號轉導途徑的重要組成部分,參與調節細胞的增殖、分化、分裂和凋亡[46],在UC的發病中起到重要作用,其激活被認為是導致UC細胞因子和炎癥介質釋放的主要原因之一,抑制MAPK信號通路是治療UC的重要手段[47]。STAT3是免疫反應的重要調節因子,可以被以IL-6為代表的促炎因子激活,可通過免疫應答、介導炎癥信號傳導、調節黏膜屏障及促進腸道纖維化等多方面參與UC的發展[48-49]。

本研究中GO功能富集分析結果顯示,連理湯治療UC的相關靶點主要涉及蛋白質復合物、核質、細胞外間隙、胞質溶膠等細胞組分,以及酶結合、轉錄因子結合、蛋白質結合、細胞因子活性等分子功能,這些靶點可通過凋亡過程、信號轉導、炎癥反應等生物過程來發揮治療UC的作用。KEGG通路富集分析結果顯示,連理湯治療UC涉及的信號通路包括TNF信號通路、TLR信號通路、PI3K-AKT信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路、癌癥相關通路、HIF-1信號通路等。研究顯示,UC的發生是由于完整的腸黏膜免疫屏障遭到破壞所引起[50-51],而腸黏膜免疫屏障遭到破壞后,腸道免疫反應被異常激活,TLR信號通路和NF-κB信號通路是參與腸道免疫反應的核心通路[52]。TLR具有免疫防御和識別外來微生物的作用[53],當TLR被激活后,可識別及結合病原體,促使髓樣分化因子88-IL1受體關聯激酶-TNF受體關聯因子6-轉化生長因子β活化激酶1信號復合體形成,從而激活NF-κB信號通路[54]。NF-κB是炎癥反應的關鍵調節因子,與UC的發生和發展關系密切,NF-κB信號通路的激活不僅會加重炎癥反應,而且會促進腫瘤細胞的產生與增殖,是加速UC病情進展的重要因素[55-58]。AKT是一種原癌基因,具有調節不同細胞活動的功能,包括細胞增殖、生長、存活、凋亡、代謝、轉錄和蛋白質合成,PI3K/AKT信號通路中的AKT活化后可激活NF-κB信號通路,從而參與UC的發生和發展過程[59]。此外,TNF信號通路[60-61]、p53信號通路[62]、HIF-1信號通路[63-64]等均與UC的發生密切相關。

綜上所述,連理湯主要通過異鼠李素、槲皮素、山柰酚等主要活性化學成分作用于AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1B、JUN等靶點,通過調節TNF信號通路、TLR信號通路、PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路等發揮抗炎、免疫調節、維持腸黏膜免疫屏障、調節腸道菌群等作用,從而達到治療UC的目的。