特應性皮炎外周血單個核細胞轉錄組特征及其在度普利尤單抗療效預測中的應用

王鈺，李巍

作者單位：200040 上海，復旦大學附屬華山醫院皮膚科

1 背景

特應性皮炎是一種高度異質性的炎癥性皮膚病[1]，其特征為Th2細胞主導的炎癥反應[2]，其他Th細胞亞群(如Th1、Th17和Th22細胞)也有不同程度的參與[3-6]。除T細胞外，2型先天淋巴樣細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞也參與了AD的發病[7-8]。深入探討AD分子表型可以為闡明發病機制、評估預后和預測治療反應提供線索。

2 方法

本研究納入來自復旦大學附屬華山醫院門診56例中重度成年AD患者，根據Hanifin &Rajka標準診斷[9]AD?；颊呔邮芏绕绽葐慰怪委?，具體給藥方法為在負荷劑量600 mg后，每隔一周自行皮下給予度普利尤單抗300 mg治療。采用濕疹面積及嚴重程度指數(eczema area and severity index，EASI)和特應性皮炎嚴重程度評分(Scoring Atopic Dermatitis，SCORAD)評價疾病嚴重程度。在基線和治療16周后，對患者進行疾病嚴重度評估并收集血液樣本。此外，本研究招募了30名無特應性或其他疾病史的健康志愿者作為健康對照。

對35例來自AD患者基線和16周度普利尤單抗后的PBMCs樣本，以及30名健康對照的PBMCs樣本進行RNA測序，針對測序結果進行差異基因分析及富集分析。并使用WGCNA分析探尋對度普利尤單抗療效有預測作用的基因，在另外21例AD患者中進一步驗證了這兩個基因的預測能力。

3 結果

3.1 AD患者PBMCs轉錄組特征分析

將進行測序的100例樣本分為健康對照組(NC組)，AD患者基線組(AD組)及AD患者度普利尤單抗治療后組(AD-dupi組)，使用IPA分析(ingenuity pathway analysis)進行富集分析。結果發現AD的失調通路主要與免疫和炎癥通路有關。與NC組相比，AD組表現出增強的2型炎癥，具體表現為Th2通路及IL-13信號通路的上調；此外，還發現AD患者IL-8信號通路上調，而NK細胞信號通路下調。度普利尤單抗治療后，Th2通路和IL-8信號通路在AD-dupivs.NC中不再富集(圖1)。

圖1 差異基因鑒定及通路富集分析A.NC組與AD組(左)、AD組與AD-dupi組(右)之間的差異基因火山圖；B.基于NC、AD和AD-dupi組所有檢測基因的主成分分析；C，D.NC組與AD組(C)、AD組與AD-dupi組(D)之間的前20條IPA富集通路NC：正常對照；AD：特應性皮炎組；AD-dupi：度普利尤單抗治療組

還使用GSVA(gene set variation analysis)方法定量分析三組中各Th信號通路及NK細胞信號通路。發現在AD組中Th2/Th22通路、Th17抗菌肽相關基因以及天然調節性T細胞(nTreg)豐度上調，而TGF-β信號和NK細胞信號下調。度普利尤單抗治療后，Th2細胞因子受體表達的增加被逆轉，而Th2細胞因子表達量并沒有顯著變化。另外Treg相關IL-10信號通路及Tr1細胞豐度在治療后存在一定程度回升(圖2)。

3.2 AD患者PBMCs轉錄組WGCNA分析

為了從復雜的轉錄組數據中探尋與度普利尤單抗療效相關的基因，使用WGCNA分析將35例AD患者治療前后的轉錄組數據分組為基因共表達模塊。一共鑒定出10個基因模塊，其中2個基因模塊在度普利尤單抗治療后發生顯著變化，且與度普利尤單抗療效相關：黑色模塊基因在治療后表達顯著升高，其基線表達量與基線嚴重程度及度普利尤單抗療效呈負相關，而綠色模塊的結果正好相反。重點分析這兩個基因模塊，使用這兩個模塊內的基因構建蛋白互作網絡，選擇在蛋白互作網絡內且與療效指標具有較強相關性的核心基因進行進一步分析。由此篩選出了黑色模塊的核心基因MAP2K3和綠色模塊核心基因UBE2L3進行具體分析驗證(圖3)。

圖3 加權基因共表達網絡分析A.模塊特征基因與外部臨床特征的關系；B.黑色模塊(上)和綠色模塊(下)與EASI75基因顯著性的相關性散點圖；C.黑色模塊(上)和綠色模塊(下)內基因的信號通路富集

3.3 MAP2K3和UBE2L3具有一定度普利尤單抗療效預測價值

在轉錄組測序數據中，MAP2K3和UBE2L3與療效指標具有較強相關性：基線MAP2K3表達量與治療后EASI評分的下降百分比呈顯著負相關，而基線UBE2L3表達量與治療后EASI評分的下降百分比呈顯著正相關(MAP2K3：r=-0.44，P=0.009；UBE2L3：r=0.41，P=0.015)。以EASI75為結局變量進行ROC分析，這兩個基因均具有較高AUC值(MAP2K3：AUC=0.819；UBE2L3：AUC=0.796)。進一步以EASI評分下降百分比為結局變量進行線性回歸也證實，較低水平的MAP2K3基線表達量或較高水平的UBE2L3基線表達量的患者更容易獲得度普利尤單抗治療較好的療效(MAP2K3：β=-0.41，P=0.021；UBE2L3：β=0.41，P=0.027)(圖4)。

圖4 度普利尤單抗療效相關模塊分析A、B.利用STRING數據庫構建的黑色模塊(A)和綠色模塊(B)的核心基因(Hubgene)蛋白互作網絡(PPI)；C.黑色模塊中核心基因MAP2K3基線表達量與EASI減少百分比的散點圖；D.MAP2K3預測EASI75的ROC曲線；E.綠色模塊中核心基因UBE2L3基線表達量與EASI減少百分比的散點圖；F.UBE2L3預測EASI75的ROC曲線；G.以EASI減少百分比為結局變量的MAP2K3及UBE2L3的線性回歸分析(經SCORAD調整)ROC：受試者工作特征曲線；AUC：曲線下面積

為了進一步驗證上述結果，在其余21例AD患者中使用qPCR的方法檢測MAP2K3和UBE2L3的基線表達量，并將其與療效指標進行分析。同樣發現這兩個基因基線表達量與療效顯著相關，ROC分析中兩基因均具有較高AUC值，線性回歸分析也證實了以上兩基因具有一定的療效預測能力。

圖5 MAP2K3和UBE2L3在另外21例AD患者中作為度普利尤單抗療效預測因子的qRT-PCR驗證A.EASI75和未達到EASI75的患者MAP2K3基線表達量的比較；B.MAP2K3基線表達量與EASI減少百分比的散點圖；C.MAP2K3預測EASI75的ROC曲線；D.UBE2L3基線表達量在EASI75和未達到的患者中的比較；E.UBE2L3基線表達量與EASI減少百分比的散點圖；F.UBE2L3預測EASI75的ROC曲線；G.以EASI減少百分比為結局變量的MAP2K3及UBE2L3的線性回歸分析(經SCORAD調整)

4 討論

本研究首次報道AD患者PBMCs轉錄組特征，及其在度普利尤單抗治療后的變化，為揭示AD發病機制提供線索；同時，本研究也利用WGCNA分析，發掘了兩個可能對度普利尤單抗療效有預測作用的分子。然而，本研究也具有一定的局限性，PBMCs作為血液中單個核細胞的混合物，包括了T細胞、B細胞和單核細胞等多種細胞，通過PBMCs轉錄組辨別其中細胞亞群的轉錄組特征較困難；另外，本研究測序隊列及驗證隊列樣本量都較小，所挖掘的預測分子需要在更大的隊列進一步驗證其療效預測能力。