桑白皮多糖通過調控miR-122表達對氧糖剝奪/再灌注誘導的PC12細胞損傷的影響

尉建輝,劉虎軍

腦卒中是具有高致殘率、致死率的常見腦血管疾病,其中缺血性腦卒中占70%[1]。臨床采用物理或藥物溶栓、恢復血流供應的方式治療缺血性腦卒中,但此過程常引發腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)。缺血/再灌注損傷發病機制復雜,其中神經細胞氧化應激損傷、細胞凋亡是導致缺血/再灌注損傷的重要原因[2]。因此,抑制神經細胞氧化應激損傷及凋亡有利于減輕缺血/再灌注損傷。桑白皮為?？浦参颩orus alba L.的干燥根皮,富含多糖、黃酮類化合物、類固醇、揮發油等多種成分,可瀉肺平喘、利水消腫[3]。研究顯示,桑白皮多糖可抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡、氧化應激,保護心肌細胞免受氧化損傷,其作用機制與調控circDLGAP4/miR-320軸有關[4]。但還少見桑白皮多糖影響腦缺血/再灌注引起的神經細胞損傷的相關報道。微小RNA(miR)-122是一種在缺血/再灌注損傷大鼠腦組織、缺血再灌注誘導的神經細胞中均表達增加的微小RNA,下調miR-122可通過促進DJ-1基因表達及增強磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路活性抑制神經細胞凋亡,miR-122可作為減輕缺血/再灌注損傷的分子靶點[5]。本研究建立氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)誘導PC12細胞損傷模擬缺血/再灌注損傷,主要探究桑白皮多糖對缺血/再灌注損傷過程中細胞氧化損傷、凋亡的影響及其能否通過調控miR-122發揮作用,以期為缺血/再灌注損傷治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

PC12細胞購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司(批號:20190203);桑白皮多糖購自上海益本生物醫藥科技有限公司(純度:≥98%,批號:20190408);胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司(批號:20190511);乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:20181203,20181118,20181223);DMEM培養液、LipofectamineTM2000試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒,北京索萊寶科技有限公司(批號:20190107,20190121,20190123);一抗[活化的半胱天冬酶(Cleaved-Caspase)-3、Cleaved-Caspase-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]、山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司(批號:20180911,20181224,20181217);逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)實驗相關試劑盒購自大連寶生物(批號:20190214);引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成;轉染物均購自廣州銳博生物。StepOnePlus的qRT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司;FACS Calibur流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特;電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和OGD/R處理

用完全培養液(含10% FBS的DMEM培養液)于二氧化碳培養箱(37 ℃、5%二氧化碳、95%空氣)中培養PC12細胞。參照文獻[6]方法建立OGD/R模型:先用無糖無血清DMEM培養液于缺氧培養箱(37 ℃、5%二氧化碳、95% N2)培養2 h,再換為完全培養液于二氧化碳培養箱中培養12 h。

1.2.2 細胞分組

于6孔板中(1.0×105個/孔)常規培養PC12細胞12 h后,分為對照(Control)組、OGD/R組、OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組。OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組分別用含0.1、0.2、0.4 μg/mL桑白皮多糖的培養液于二氧化碳培養箱中培養24 h[4],再建立OGD/R模型;OGD/R組用不含桑白皮多糖的培養液于二氧化碳培養箱中培養24 h,再建立OGD/R模型;Control組用不含桑白皮多糖的培養液于二氧化碳培養箱中培養38 h。各組培養結束后,收集細胞培養上清液、細胞,分別進行指標檢測。

1.2.3 比色法檢測LDH漏出率、MDA含量、SOD活性

將收集的上清液350 r/min離心10 min,取上清10 mL,利用LDH試劑盒檢測上清液中LDH水平,LDH漏出率(%)=(LDH實驗組-LDH對照組)/LDH對照組×100%。裂解收集細胞,350 r/min離心10 min,取上清液,分別利用MDA、SOD試劑盒檢測上清中MDA含量、SOD活性。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)對收集細胞清洗,300 r/min離心5 min,棄上清液。加Binding Buffer重懸細胞,至密度為1.0×106個/mL。取100 μL細胞懸液,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達

用RIPA試劑裂解收集細胞對總蛋白進行提取,二喹啉甲酸法(BCA)檢測蛋白濃度。SDS-PAGE實驗對總蛋白進行分離,轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,并于5 %脫脂奶粉中封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用cleaved-Caspase-3(1∶500)、Cleaved-Caspase-9(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育12 h,洗膜。室溫下,用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h。滴加顯影液顯影,曝光拍照,Image J軟件分析條帶灰度值,以Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9與GAPDH灰度值的比值表示其相對表達量。

1.2.6 qRT-PCR法檢測miR-122表達

利用miRNA提取試劑盒對細胞中總RNA提取,逆轉錄為cDNA后,行PCR擴增。引物序列:miR-122正向5′-CGTGGAGTGTGACAATGGTGTT-3′,反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;U6正向5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′,反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法計算miR-122相對U6的表達量。

1.2.7 細胞轉染與處理

于6孔板中(1.0×105個/孔)培養PC12細胞24 h,利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉染anti-miR-122、anti-miR-NC、miR-122 mimics、miR-NC,轉染12 h,qRT-PCR法檢測miR-122表達驗證轉染效果。轉染anti-miR-122、anti-miR-NC的PC12細胞接種至6孔板中,均按照OGD/R組處理,分別記為OGD/R+anti-miR-122組、OGD/R+anti-miR-NC組;轉染miR-122 mimics、miR-NC的PC12細胞接種至6孔板中,均按照OGD/R+桑白皮多糖高劑量組處理,分別記為OGD/R+桑白皮多糖+miR-122組、OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC組。按照上述試驗步驟分別檢測各組氧化應激指標(LDH、MDA、SOD)、細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量。每組實驗設置3個復孔,實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞氧化損傷的影響

OGD/R組LDH漏出率、MDA含量高于Control組(P<0.05),SOD活性低于Control組(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組LDH漏出率、MDA含量低于OGD/R組(P<0.05),SOD活性高于OGD/R組(P<0.05),且各檢測指標在OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞氧化損傷的影響

2.2 桑白皮多糖對OGD/R誘導PC12細胞凋亡的影響

OGD/R組凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量高于Control組(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量低于OGD/R組(P<0.05),且各檢測指標在OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞凋亡的影響

表2 桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞凋亡的影響比較

2.3 桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞miR-122表達的影響

OGD/R組miR-122表達量高于Control組(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組miR-122表達量低于OGD/R組(P<0.05),且miR-122表達量在OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞miR-122表達的影響

2.4 干擾miR-122表達對OGD/R誘導的PC12細胞損傷的影響

miR-122在轉染anti-miR-122的PC12細胞中的表達量為(0.25±0.02),低于轉染anti-miR-NC的細胞(1.00±0.00),差異有統計學意義(t=-112.500,P<0.05),說明轉染anti-miR-122的PC12細胞中miR-122表達受到干擾。OGD/R+anti-miR-122組LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量均低于OGD/R+anti-miR-NC組(P<0.05),SOD活性高于OGD/R+anti-miR-NC組(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 干擾miR-122表達對OGD/R誘導的PC12細胞凋亡的影響

表4 干擾miR-122表達對OGD/R誘導的PC12細胞損傷影響的比較

2.5 上調miR-122表達逆轉桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞損傷的作用

miR-122在轉染miR-122 mimics的PC12細胞中的表達量為(2.85±0.22),高于轉染miR-NC的細胞(1.00±0.00),差異有統計學意義(t=25.227,P<0.05),說明轉染miR-122 mimics的PC12細胞中miR-122表達上調。OGD/R+桑白皮多糖+miR-122組LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量均高于OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC組(P<0.05),SOD活性低于OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC組(P<0.05)。詳見圖3、表5。

表5 上調miR-122表達逆轉桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞損傷的作用比較

3 討 論

近年來,由于工作、生活壓力增加,缺血性腦卒中發病率不斷增長,且呈年輕化趨勢[7]。腦缺血發生后,血流中斷,治療以恢復血流供應為主。但再灌注時,腦組織產生大量活性氧,造成過氧化氫、超氧自由基、氫自由基增多,導致蛋白質、脂質氧化,神經細胞受損[8]。LDH是一種表達于細胞胞質的糖酵解酶,在細胞受損后被釋放,因此,細胞培養上清液中LDH漏出率可間接反映細胞受損程度。MDA是脂質過氧化產物,也是反映細胞氧化損傷的重要指標?；钚匝踉黾訉е驴寡趸胶獗黄茐?抗氧化酶如SOD活性降低。過度的氧化損傷可進一步引起神經細胞凋亡,加劇缺血/再灌注損傷。大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC12細胞高度分化后,具有神經細胞特性,常用OGD/R誘導PC12細胞損傷模擬缺血/再灌注損傷[9]。本實驗結果顯示,PC12細胞經OGD/R誘導后,LDH漏出率、MDA含量均增加,而SOD活性降低,且細胞凋亡率增加,提示OGD/R誘導的PC12細胞損傷模型建立成功。

目前,缺血/再灌注損傷發病機制復雜,缺乏有效的治療藥物。中藥或其活性成分毒性低、作用靶點多,且療效強,是疾病治療藥物研究的重點。桑白皮多糖是中藥桑白皮的主要活性成分,具有抗氧化、調節免疫等藥理活性[10]。Zhao等[11]報道,桑白皮多糖可通過激活核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件(Nrf2/ARE)信號通路、促進過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性保護肝細胞免受棕櫚酸誘導的氧化損傷和脂毒性,改善脂質代謝紊亂。本實驗結果顯示,桑白皮多糖可降低OGD/R誘導的PC12細胞氧化損傷,并減少細胞凋亡,且呈劑量依賴性,提示其具有減輕缺血/再灌注損傷的潛在價值。Caspase-9和Caspase-3是Caspase級聯反應的重要參與者,其被活化后傳遞凋亡信號或誘導細胞凋亡[12]。本實驗數據提示,桑白皮多糖可能通過間接抑制Caspase級聯反應減少OGD/R誘導的PC12細胞凋亡,且呈劑量依賴性,可能有助于缺血性腦卒中的治療。

miRNA是一類小分子非編碼RNA,研究已表明,多種miRNA如miR-193b-3p[13]、miR-381-3p[14]、miR-455[15]在腦缺血再灌注腦組織或OGD/R誘導的神經細胞中異常表達,參與調控OGD/R誘導的神經細胞凋亡、炎癥反應或氧化應激,為減輕缺血/再灌注損傷提供了潛在分子靶點。作為一種miRNA,miR-122的異常表達與多種疾病的發生發展有關。研究顯示,miR-122是放射性腦損傷(RBI)小鼠腦組織中表達上調的miRNA,敲減miR-122可有效改善RBI小鼠認知障礙,減輕神經元損傷和神經炎癥[16];miR-122在脂多糖(LPS)誘導的大鼠心肌細胞H9c2中表達增加,敲減miR-122通過靶向G蛋白偶聯受體激酶結合蛋白1(GIT1)抑制LPS誘導的H9c2細胞炎癥、氧化應激及細胞凋亡,有利于減輕膿毒癥引發的心肌損傷[17];miR-122在LPS誘導的腎小管上皮細胞中表達上調,敲減miR-122可保護腎小管上皮細胞免受LPS損傷,miR-122是治療膿毒癥引起的急性腎損傷的潛在分子靶點[18]。

本實驗數據顯示,miR-122在OGD/R誘導的神經細胞PC12中表達增加,干擾miR-122表達減輕OGD/R誘導的PC12細胞氧化損傷,并減少細胞凋亡,這與上述研究結果一致[16-18],提示miR-122也可作為治療缺血/再灌注損傷的分子靶點。Meng等[19]研究顯示,灰樹花多糖可減輕脂多糖/d-半乳糖胺(LPS/d-GalN)誘導的小鼠肝組織炎癥損傷及氧化應激損傷,這與其下調肝組織中miR-122表達進而激活Nrf2/ARE信號通路有關。本實驗結果表明,桑白皮多糖可呈劑量依賴性抑制OGD/R誘導的神經細胞PC12中miR-122表達,而上調miR-122可逆轉桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞氧化應激、細胞凋亡的影響,提示桑白皮多糖可能通過下調miR-122減輕缺血/再灌注損傷,但其具體作用的miR-122靶基因和下游信號通路有待進一步探究。

綜上所述,桑白皮多糖對OGD/R誘導的PC12細胞氧化應激、細胞凋亡具有顯著抑制作用,其作用機制可能與下調miR-122表達有關,提示其可減輕缺血/再灌注損傷,有助于缺血性腦卒中的治療,但尚需進一步在體內探究。