lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人血清中的表達及其臨床意義

李文俊,王瑜芬

病毒性心肌炎是由病毒引起的原發性心肌炎癥,會導致心臟生理功能發生改變,包括心肌泵送力降低和心律異常,其臨床表現為非特異性,表現為乏力、呼吸急促、胸痛等,有時也表現出急性心力衰竭或室性心律失常等[1]。臨床研究發現,病毒性心肌炎病理表現主要為心肌呈彌漫性、炎性病變[2]。有研究報道,病毒性心肌炎初始表現為急性期,經臨床治療后,病毒可被清除,但病毒感染介導的自身免疫性炎癥可能持續存在,導致病人發展為心力衰竭,甚至病情急劇惡化導致病人死亡[3]。因此,早期診斷病毒性心肌炎對于該病治療有十分重要的意義。近年來發現,非編碼RNA,包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA),在疾病的病理變化中扮演關鍵角色[4]。母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)已被確定是心臟纖維化的誘導因子[5]。微小RNA-223(microRNA-223,miR-223)已被證實涉及心肌細胞肥大、心臟纖維化等不同心臟病理過程[6]。Xue等[7]研究發現,lncRNA MEG3在病毒性心肌炎小鼠心臟組織中由于可抑制M2巨噬細胞極化而加重炎癥反應,此過程是通過下調miR-223表達來完成的。目前,lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人中是否發揮同樣作用尚鮮見報道。本研究擬探究lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人血清中的表達情況并探討其對病毒性心肌炎的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年9月—2021年9月本院收治的急性期病毒性心肌炎病人43例為病毒性心肌炎組,男25例,女18例,年齡20～42(32.05±6.53)歲。納入標準:1)符合2001年版《關于成人急性病毒性心肌炎診斷參考標準》[8];2)入組前未接受激素治療;3)病人及家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準:1)患有心源性休克者;2)患有先天性心臟病、心瓣膜病者;3)患有肺、腎、肝系統疾病或血液系統疾病者;4)患有其他惡性腫瘤者。選擇同期在本院體檢的46名健康者為對照組,男26名,女20名,年齡20～40(31.85±6.21)歲。病毒性心肌炎組、對照組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

采集健康體檢者體檢當日和病毒性心肌炎病人入院檢查時清晨空腹靜脈血6 mL,離心(4 ℃,3 500 r/min,15 min),留上清,凍存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測血清中lncRNA MEG3和miR-223的mRNA表達

取上清液樣本于冰上解凍,用北京索萊寶科技有限公司的總RNA提取試劑盒提取總血清RNA,用日本Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit按照20 μL體系逆轉錄合成cDNA。美國ABI公司的7300 qRT-PCR儀對lncRNA MEG3和miR-223及內參β-actin、U6進行擴增反應。建立25 μL熒光反應體系,每組樣本重復3次。反應條件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,40 s;38個循環。采用2-ΔΔCt計算lncRNA MEG3和miR-223的mRNA相對表達量,引物購自上海吉瑪合成。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測

用ELISA法檢測血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)及白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平,操作步驟依據美國Abcam公司的CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書詳細步驟執行。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組血清lncRNA MEG3、miR-223的mRNA水平比較

與對照組比較,病毒性心肌炎組血清lncRNA MEG3相對表達水平較高(P<0.05),miR-223相對表達水平較低(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清lncRNA MEG3、miR-223的mRNA水平比較

2.2 兩組血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平比較

與對照組比較,病毒性心肌炎組血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平較高(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平比較

2.3 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223的相關性分析

Pearson相關性分析顯示,lncRNA MEG3與miR-223呈負相關(r=-0.647,P<0.05)。詳見圖1。

圖1 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223相關性分析

2.4 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223與IL-1β、IL-6的相關性分析

Pearson相關性分析顯示,lncRNA MEG3與IL-1β、IL-6呈正相關(P<0.05),miR-223與IL-1β、IL-6呈負相關(P<0.05)。詳見表4。

表4 血清lncRNA MEG3、miR-223與IL-1β、IL-6相關性分析

2.5 血清cTnI、CK-MB、lncRNA MEG3、miR-223表達診斷病毒性心肌炎的診斷價值

ROC曲線顯示,cTnI、CK-MB診斷病毒性心肌炎的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.782[95%CI(0.683,0.880)]、0.757[95%CI(0.653,0.862)],其敏感度分別為79.10%、76.70%,特異度分別為76.10%、73.90%;血清lncRNA MEG3診斷病毒性心肌炎的AUC為0.902[95%CI(0.841,0.963)],其敏感度、特異度分別為90.70%、76.10%;血清miR-223診斷病毒性心肌炎的AUC為0.790[95%CI(0.696,0.885)],其敏感度、特異度分別為88.40%、60.90%;lncRNA MEG3與miR-223聯合診斷病毒性心肌炎的AUC為0.903[95%CI(0.841,0.966)],其敏感度、特異度分別為88.40%、82.60%,其中lncRNA MEG3與miR-223聯合診斷的AUC值高于cTnI、CK-MB、miR-223單獨診斷的AUC值(Z分別為2.056,2.377,1.977,P<0.05)。詳見圖2。

3 討 論

病毒性心肌炎主要是由腸道病毒、上呼吸道病毒等侵入心臟引起免疫反應而造成心肌間質炎性細胞浸潤的心肌炎性疾病[9]。隨著環境污染加重,病毒性心肌炎的發病率也逐年上升[10]。目前,病毒性心肌炎診斷主要依據病毒感染史、臨床特征、血清中心肌酶含量,但敏感性較低,臨床上診斷病毒性心肌炎的金標準為內膜心肌活檢,但疾病早期階段很難獲得準確的診斷[11]。當心肌細胞受到病毒等因素侵犯時,心肌組織受到損傷,心肌細胞中CK-MB、cTnI會迅速進入血液中,使血清中CK-MB、cTnI升高[12]。本研究顯示病毒性心肌炎組血清cTnI、CK-MB水平較高于對照組,提示病毒性心肌炎病人存在心肌損傷。病毒性心肌炎病理變化為心肌細胞炎性浸潤及壞死,有學者認為其與病毒持續性感染、炎癥反應、免疫反應等有關[13]。另有研究顯示,巨噬細胞極化在調節柯薩奇病毒B3(CVB3)誘導的病毒性心肌炎的心肌炎癥中起著至關重要的作用,抑制CVB3感染引起的M1型巨噬細胞的活化,促進巨噬細胞向M2型極化發展,可改善病毒性心肌炎的心功能[14]。IL-1β、IL-6可由巨噬細胞和淋巴細胞產生,與機體炎癥反應程度呈正相關[15]。本研究顯示,病毒性心肌炎組血清IL-1β、IL-6水平明顯升高,提示病毒性心肌炎病人體內存在炎癥。

lncRNA MEG3可參與調控腫瘤細胞的增殖,目前發現,lncRNA MEG3可介導炎癥性腸病的免疫炎性反應[16-17]。Xie等[18]研究顯示,腦出血的大鼠腦組織中lncRNA MEG3表達水平明顯上升,lncRNA MEG3高表達通過抑制miR181b表達促進腦出血引起的腦組織炎癥反應。Li等[19]研究顯示,在肺部細菌感染小鼠肺上皮細胞中,lncRNA MEG3通過促進IL-1β表達水平以促進肺部炎癥反應。本研究顯示,病毒性心肌炎組血清lncRNA MEG3相對表達水平高于對照組,且與IL-1β、IL-6呈正相關,提示lncRNA MEG3可能參與急性期病毒性心肌炎發生。綜合上述研究推測lncRNA MEG3通過某種機制在急性期病毒性心肌炎中發揮促炎作用,影響急性期病毒性心肌炎的發生。miRNA可調控細胞增殖、凋亡及宿主-病原體反應等,不僅在維持心臟組織功能發揮關鍵作用,也可與不同靶點結合,調控病毒誘導的心肌炎中病毒的復制和病毒感染細胞的存活能力[20]。miR-223是先天免疫反應的調節劑,其表達失調會導致炎癥性疾病[21]。miR-223是巨噬細胞極化和活化的有效調節劑。Yuan等[22]研究顯示,miR-223高表達可通過直接靶向PBX/Knotted 1 Homeobox 1(Pknox1)促進巨噬細胞向M2型極化,降低肥胖小鼠體內炎癥反應,但伴隨著miR-223表達下降,其促使轉錄激活因子3(STAT3)蛋白表達水平增加,又導致IL-6表達增加,并放大炎癥反應。Dang等[23]研究顯示,miR-223過表達通過下調低氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達顯示出抗炎特性,阻止脂多糖誘導的M1型巨噬細胞極化,減輕敗血癥引起的小鼠心臟損傷。Zhang等[24]研究顯示,結腸炎小鼠結腸組織miR-223上調會抑制IL-6/STAT3信號通路,降低IL-6表達水平,抑制結腸炎。本研究顯示,病毒性心肌炎組血清miR-223相對表達水平低于對照組,且與IL-1β、IL-6呈負相關,提示miR-223可能參與急性期病毒性心肌炎發生。血清lncRNA MEG3聯合miR-223診斷病毒性心肌炎的AUC為0.903,其敏感度、特異度分別為88.40%、82.60%,高于血清cTnI、CK-MB、miR-223診斷病毒性心肌炎的AUC,提示lncRNA MEG3聯合miR-223對病毒性心肌炎具有較好的診斷價值,且優于血清cTnI、CK-MB指標。Zhang等[25]研究顯示,lncRNA MEG3高表達促進血管內皮細胞炎癥反應,并促進內皮功能障礙,其可作為miR-223內源性海綿來抑制miR-223表達,從而發揮促炎作用。本研究顯示lncRNA MEG3與miR-223呈負相關,提示lncRNA MEG3可能與miR-223作用,共同影響急性期病毒性心肌炎的發生。

綜上所述,病毒性心肌炎病人血清中lncRNA MEG3表達上調,miR-223表達下調,lncRNA MEG3與miR-223具有密切關系,且二者均與炎性因子相關,lncRNA MEG3聯合miR-223對病毒性心肌炎具有較好的診斷價值。但本研究尚未探究lncRNA MEG3、miR-223與急性期病毒性心肌炎發生機制的關系,后續仍需深入探究。