高光譜熒光示蹤無損檢測瓜類作物嫁接苗愈合狀態

譚佐軍 ，蔡 霞 ，阿克拜爾江·卡德爾 ，余 帆 ，雷紅偉 ，高子藝 ，楊 碩 ，黃 遠 ,3,4※

（1. 華中農業大學理學院，武漢 430070；2. 果蔬園藝作物種質創新與利用全國重點實驗室/華中農業大學園藝林學學院，武漢 430070；3. 華中農業大學深圳營養與健康研究所，武漢 430070；4. 中國農業科學院深圳農業基因組研究所和嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室深圳分中心，深圳 518000；5. 咸寧市農業科學院，咸寧 437199）

0 引言

瓜類作物是一種重要的園藝和經濟作物[1]，在農民增收和滿足中國快速增長的瓜果類產品需求方面發揮著巨大作用[2]。嫁接通常是瓜類作物用來解決連作障礙，減少土傳病對瓜類作物生長發育的不良影響，提高其產量和果實品質的重要方式[3]。而嫁接苗愈合過程中，接穗和砧木間維管束的重新連通是砧穗間成功愈合的表現[4]，目前瓜類嫁接中缺乏準確高效的活體檢測維管束重連的方法，因此開發出判斷嫁接維管束重連的早期無損鑒定技術顯得尤為重要。

傳統的嫁接苗愈合狀態判斷主要是通過有經驗的農藝人員觀察接穗真葉的生長來判斷，耗費大量的人力物力，成本高[5]。實際上，接穗真葉出現往往是嫁接愈合后，無法實現盡早檢測的目的。而在研究中應用較為廣泛的熒光染色[6]、石蠟切片[7]、解剖分析[8]等方法工藝復雜、成本高、耗時耗力，并且不同的瓜類作物無法采用相同的檢測方式。最重要的是，上述方法均為人工破壞式的方法，嫁接苗進行愈合檢測后無法繼續存活生長，所以難以實現產業化應用。因此，亟需探究出能快速準確并且能實現產業化應用的判別嫁接苗早期愈合狀態的無損檢測方式。隨著傳感器檢測[9]、圖像識別[10]、計算機圖像處理[11]等的飛速發展，為了提高嫁接苗的生產效率以及經濟效益，目前許多研究致力于將機器視覺技術應用于對嫁接苗的無損檢測[12-13]。李長纓等[14]通過機器視覺對黃瓜的株高以及葉冠的投影進行識別分析，從而判斷嫁接用苗黃瓜生長情況。但是此方法針對嫁接苗適用性較差，因為提取信息時需要區分砧木和接穗，圖像分割難度大。蘇穎欣等[15]利用機器視覺技術和機器學習方法對甜瓜嫁接苗的成活情況進行研究，但是該方法只是替代了人工觀察接穗真葉的方法，而且僅從圖像層面區分，愈合狀態近似時準確率大大下降，同樣存在無法檢測更為準確的維管束重連時間。高光譜成像技術能夠實時、非接觸、高效地測量植物結構形態、生理生化[16]等多樣化的表型，在高通量植物表型分析中表現出良好的潛力[17-18]。楊杰鍇等[19]通過對甜瓜嫁接苗新長出真葉區域的高光譜圖像進行分析，實現對甜瓜嫁接愈合情況的提前預測，然而該方法也是對接穗真葉進行檢測。上述方法利用機器視覺檢測嫁接苗的愈合雖然避免了人工以及破壞式檢測的缺陷，但是嫁接愈合鑒定的準確率較低并且檢測效率低。

碳點（CDs，carbon dots）是一種碳基零維納米材料[20]，能夠從石墨、活性炭、碳納米管以及有機小分子[21]等碳源中制得。CDs 具有尺寸小且穩定可調的熒光特性[22]、良好的生物相容性、無毒以及低成本[23]等優良特性，使其受到了研究者廣泛的關注[24-25]。CDs 在植物體內一方面可以被合成為二氧化碳被代謝出體外，另一部分合成為有機物（糖、淀粉等）在植物體內積累，成為植物生長代謝的能源物質。因此，本文以氮硫摻雜碳點為熒光示蹤材料，以西瓜砧木和接穗為研究對象，利用高光譜熒光成像方法，對西瓜嫁接苗愈合狀態進行早期無損檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西瓜是典型的瓜類作物，西瓜自嫁具有親和性，其存活率較高，有利于本試驗獲取大量愈合存活狀態的數據。因此，試驗選取西瓜自嫁苗為研究材料，品種為早佳8 424，華中農業大學園林樓中培養。種子首先于0.2%的甲醛溶液中浸泡30 min，去離子水沖洗，搓洗去除種子上的殘留物。消毒完成后，種子于50～55 ℃去離子水浸泡約6～8 h，用濕潤的紗布將種子包裹好后于催芽箱內進行催芽，種子發芽1 cm 左右后進行播種。采用江西鎮江的育苗專用基質進行育苗，在基質中加入1%代森錳鋅進行消毒。采用50 孔盤穴培育種苗，將播種后的苗盤置于培養箱內進行培養，培養箱中采用的白光LED 燈照射，環境設施參數為光照強度300 μmol/m2·s，光照周期為：白天/黑暗=12 h/12 h，對應的晝夜溫度為28 ℃/22 ℃，相對濕度為65%～75%。采用第一片真葉未展平的幼苗作為接穗（種苗發芽播種后 4 d）；第一片真葉展平的幼苗作為砧木（種苗發芽播種后 6 d）。使用1% 代森錳鋅對幼苗消毒處理后進行嫁接處理。嫁接采用單子葉貼接法進行嫁接，如圖1，嫁接后將苗子放入華中農業大學園林樓培養箱中培養。

圖1 西瓜嫁接苗嫁接過程Fig.1 Grafting process of watermelon grafts

1.2 氮硫摻雜碳點（N,S-CDs，nitrogen and sulfur doped carbon dots）的制備

將0.5 g 海藻酸鈉和1 g 谷胱甘肽分別溶解于30 mL甲酰胺溶劑中。將上述混合液于超聲清洗機中混合均勻，轉移至內襯為聚四氟乙烯，釜體為304 優質不銹鋼的反應釜中。擰緊后放入電熱鼓風干燥箱內，于180 ℃反應8 h。將反應后的粗產物在10 000 r/min 的轉速下進行離心，并使用0.22 μm 濾膜對離心后溶液的上清液進行過濾透析，然后冷凍干燥得到碳點粉末材料，操作流程如圖2。

圖2 氮硫摻雜碳點的制備流程圖Fig.2 Preparation flow chart of N,S-CDs

1.3 碳點標記

對嫁接后1～8 d 的西瓜嫁接苗進行氮硫摻雜碳點染色標記。具體方法為：氮硫摻雜碳點配置為濃度1 000 mg/L 的水分散液，西瓜嫁接苗的培育穴盤完全浸泡于碳點水分散液中30 min 進行碳點標記，將標記成功的西瓜嫁接苗置于暗室中使用高光譜儀觀察其標記后圖像狀態，由此分析其愈合情況，流程見圖3。

圖3 氮硫摻雜碳點處理西瓜嫁接苗的流程圖Fig.3 Flowchart of grafting watermelon seedlings treated with N,S-CDs

1.4 高光譜熒光圖像采集

試驗采用四川雙利合譜GaiaField Pro 便攜式高光譜成像系統，該光譜儀光譜范圍為 400～1 000 nm，光譜分辨率為3.5 nm。試驗在華中農業大學逸夫樓 A502 暗室中進行，光源采用15 W 的紫外燈，其中心波長為365 nm，帶寬為10 nm。系統采樣物距為30 cm，曝光時間設為25 ms，推掃速度設為 0.15 cm/s，試驗裝置如圖4 所示。

圖4 西瓜嫁接苗砧木和接穗光譜采樣示意圖Fig.4 Schematic diagram of spectral sampling of rootstock and scion of watermelon grafted seedlings

裝置由計算機、高光譜成像系統、紫外光源、升降置物臺組成。為了消除噪聲和光照不均勻的影響，需要對獲得的光譜圖像按式（1）進行校正。

式中R是黑白校正后的嫁接苗圖像，IR是原始光譜圖像，ID是黑板圖像；IW是白板圖像。

2 結果與分析

2.1 氮硫摻雜碳點熒光發射光譜

如圖5a 所示，在日光燈下碳點的水分散液為墨綠色，對N,S-CDs 的熒光發射進行檢測，結果顯示制備的N,S-CDs 在330～630 nm 激發下有明顯的熒光發射，并且表現紅藍雙發射特性。

圖5 N,S-CDs 熒光發射的特征Fig.5 Characteristics of fluorescence emission of N,S-CDs

圖6 西瓜嫁接苗高光譜熒光染色主成分分析圖像Fig.6 Principal component analysis of watermelon grafted seedling by hyperspectral fluorescence staining

如圖5 可知該碳點在藍光發射的最佳激發為330 nm，對應發射波長為430 nm，該碳點在紅光發射的最佳激發為430 nm，對應發射波長為670 nm。這種獨特的雙發射特性是歸因于大的sp2/sp3雜化域和氮/硫摻雜的表面狀態[26-27]，以及含硫熒光分子團[28]。它們在短波區的熒光發射帶表現出與激發有關的行為，在激發波長為330～450 nm 時，熒光發射帶表現出激發依賴性，從410 nm移動到505 nm；而以650 nm 為中心的發射則表現出與激發波長無關的行為。

N,S-CDs 表面有豐富的官能團，石墨氮、吡啶氮、C-S-C 等多種摻雜形式可以在N,S-CDs 中產生豐富的缺陷位點，同時谷胱甘肽和海藻酸鈉含有豐富的氨基和羧基，在反應過程中容易脫水縮合成為含氮、硫的熒光分子團，因此造成此碳點的發射，光致發光機制如圖5b。

2.2 愈合狀態圖像分析

為了將高光譜原始數據多維數據變換為低維樣本矩陣，采用PCA 對西瓜嫁接苗高光譜進行特征提取，PCA 是通過矩陣變化，在測量空間尋找數據方差最大的正交向量，假設有P個樣本X，樣本均數為X1、X2、···、XP，樣本標準差為S1、S2、···、SP，將樣本矩陣進行標準化變換

前5 個主成分貢獻率可達99%，在主成分圖像中可見，即紅方框標記處，嫁接后第3 天，嫁接苗尚未愈合時，碳點材料無法通過木質部運輸到接穗部位，碳點在紫外光激發下有強烈的熒光，因此在主成分圖像中的PC2 圖像中可以看到砧木部位為白色，接穗部位為黑色；嫁接后第 7 天嫁接苗已經愈合，在主成分圖像中的PC2圖像中接穗和砧木莖稈均通體發亮。

圖7 為西瓜嫁接苗高光譜碳點染色圖像及光譜。嫁接苗未愈合時，接穗和砧木未連通，碳點材料無法通過木質部轉運到接穗，在接穗部位無法觀察到碳點的熒光；嫁接苗愈合后，接穗和砧木連通，碳點材料可以通過木質部轉運到接穗，在接穗部位觀察到熒光。在高光譜圖像分析中，500 nm 左右為碳點的熒光發射峰，680 和740 nm 為植物自體熒光發射峰。砧木在愈合前后均可以檢測到碳點材料，但接穗中只有在愈合后才能檢測到碳點材料。

圖7 不同愈合狀態的嫁接苗的檢測Fig.7 Detection of grafted seedlings with different healing states

2.3 愈合狀態光譜分析

已知500 nm 左右為碳點的熒光發射峰，680 和740 nm 為植物自體熒光發射峰。

由圖8 可知，在1～4 d 時，嫁接苗砧穗間尚未愈合，碳點材料無法運輸到接穗部位，因此在接穗部位檢測不出碳點材料的存在。在5～7 d 時，植物開始愈合，維管束功能恢復，碳點材料可以運輸至接穗部位。由于愈合不完全，5 d 時，碳點運輸速率較慢，30 min 內接穗上，只能檢測出極少量的碳點。6～7 d 時，碳點通過愈合后的木質部轉運至接穗后，由于愈合不完全，嫁接苗部分粘連，碳點通過滲透作用運輸到接穗部分，但是導管與篩管還沒有完全連接愈合，碳點無法通過向下轉運，導致接穗莖部碳點的含量高于砧木莖部。第8 天，嫁接苗砧木與嫁接苗接穗部位的熒光強度相等，表明碳點在嫁苗中可以自由轉運，說明砧穗間韌皮部和木質部已經連通，嫁接愈合完成。

圖8 嫁接后N,S-CDs 在西瓜嫁接苗中的轉運情況Fig.8 Transfer of N,S-CDs in watermelon grafted seedlings after grafting

2.4 N,S-CDs 對西瓜嫁接苗愈合的影響

圖9 a 可以明顯發現，植物嫁接之后 12 d 內，隨著時間的增加，經過碳點材料處理的西瓜嫁接苗接穗葉面積增長明顯大于未經碳點材料處理的植株，表明N,S-CDs材料對嫁接后的西瓜真葉生長起到促進作用。

圖9 嫁接后西瓜嫁接苗表型的變化Fig.9 Phenotypic changes of grafted watermelon seedlings

嫁接后第4 天時，處理組的接穗真葉面積增加量相較于對照組提升了 53.6%，說明嫁接后第4 天，CDs 水分散液處理后的嫁接苗愈合情況比對照組更好。處理組嫁接苗的接穗真葉葉面積 相較于處理組，第6 天提升了46.3%，第8 天提升了 59.8%，第10 天增加了 65.3%，第12 天增加了 61.4%。由此可以看出，在嫁接后第10 天的時候，處理組對嫁接苗葉面積增長促進作用最為顯著。第3 天嫁接苗開始愈合，處理組的愈合情況優于對照組，所以水分礦物質通過愈合部木質部的運輸到達接穗部位，促進葉面積增長。

圖9b 可以看出，隨著時間的增加，經過N,S-CDs水分散液處理的嫁接苗的根長較處理組增加的更快一些。通過N,S-CDs 處理后，嫁接苗根系的變化情況與處理后西瓜嫁接苗的真葉面積變化情況一致。隨嫁接天數增加，處理組的西瓜嫁接苗根長比對照組增長更快，在嫁接后2、4、6、8、10 和12 d，處理組根長增長量相對對照組分別提升了 6.2%、42.9%、56.0%、71.4%、62.5%、78.7%。由此說明，N,S-CDs 可以促進嫁接苗根系的生長，有利于對營養物質以及水分的汲取[29]。

3 結論

本文以西瓜自嫁苗為研究對象，以N,S-CDs 為熒光示蹤材料，利用高光譜成像儀采集嫁接苗熒光染色后不同愈合時期的光譜數據和不同波段下的圖像信息，結合N,S-CDs 在嫁接苗中的轉運情況進行了研究，主要結果如下：

1）N,S-CDs 具有穩定的熒光特性并且可以被嫁接苗吸收并轉運。未愈合時，接穗和砧木未連通，碳點材料無法通過木質部轉運到接穗，在接穗部位無法觀察到碳點的熒光；嫁接苗愈合后，接穗和砧木連通，碳點材料可以通過木質部轉運到接穗，在接穗部位觀察到熒光。采用高光譜成像儀對愈合期西瓜自嫁苗的愈合情況進行監控，可以準確、快速、無損地判斷瓜類作物早期的愈合狀態。

2）通過N,S-CDs 處理發現嫁接苗能夠促進嫁接苗根系以及接穗葉面積的增長，嫁接后第12 天，相較于對照組，處理組的根系增長量提升了78.7%，葉面積增長量提升了61.4%。